Biotribologische testen en analyse van gewrichtskraakbeen glijden tegen metaal voor implantaten

Ons protocol maakt het mogelijk om het schuiven van metaal voor orthopedische implantaten te testen tegen gewrichtskraakbeen en daarmee de effecten van focale implantaten of hemiarthroplastie op de biosynthetische activiteit van bepaalde chondracyten te onderzoeken het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een uitgebreid inzicht biedt in zowel de tribologische eigenschappen als de biologische effecten van mechanische belasting in het kraakbeenkoppeling. Deze techniek kan complimenteren met de klinische bevindingen na chirurgische ingrepen zoals implantatie van een focale metalen implantaten voor de behandeling van een osteochondrale defect van de knie of hemiarthroplastie van de heup. Het aantonen van de procedure zal Christopher Bauer een postdoc van mijn laboratorium hier op de Donau Universiteit.

Gebruik een commercieel verkrijgbare reciprocating tribometer met een cilinder op plaat configuratie, verticale laadmogelijkheden en verstelbare belasting en schuifsnelheid. Daarnaast is een vloeibare cel nodig om de tests in een smeeroplossing uit te voeren. Bevestig de osteochondrale cilinders op de onderste monsterhouder met de markering uitgelijnd met de schuifrichting.

Begin met het bepalen van de contactdruk in het kobaltchchmmolybdeen op het kraakbeensysteem met behulp van een drukmeetfilm. Plaats de drukmetingsfilm op de interface en pas gedurende 30 seconden een statische belasting toe om de initiële contactdruk, contactgrootte en vorm te bepalen. Monteer de kobalt chroom molybdeencilinders op de bovenste belastingscel.

Voeg de testoplossing toe aan de vloeibare cel om de osteochondrale cilinder onder te dompelen en de metalen kraakbeenschuifinterface te bedekken. Stel testparameters in zoals beschreven in normale krachtslag en glijdende snelheid die gedurende de hele test worden gehandhaafd. Begin met het wederkerig schuiven van de metalen cilinder tegen het gewrichtskraakbeen ondergedompeld in de smeeroplossing.

Het controleren van de wrijvingscoëfficiënt tijdens het experiment, het einde van het experiment. Verwijder na de beoordelingsperiode de osteochondrale plug uit de monsterhouder en spoel deze op met PBS en bewaar deze in medium tot verdere biologische analyse. Houd de controlemonsters en de testoplossing bij kamertemperatuur gedurende de duur van de test en analyseer ze samen met de monsters die zijn blootgesteld aan mechanische belasting.

Plaats, een 24 goed plaat op een schaal en nul. Spoel de osteochondrale plug met PBS en plaats deze in een petrischaaltje. Gebruik vervolgens een scalpel om het kraakbeen uit het transplantaat in één stuk te snijden, het kraakbeen in twee gelijke stukken, zodat het contactgebied gelijkelijk op beide kraakbeenstukken wordt verdeeld en de helft in ongeveer één millimeter blokjes wordt gesneden.

Gebruik de tweede helft voor genexpressie analyse overdracht van het gehakt kraakbeen in een put van de bereid op 24 put plaat en bepalen het weefsel gewicht herhaal dit proces voor elk monster en voeg een milliliter groeimedium aan elke put van de plaat. Voeg 500 microliter XTT-oplossing toe aan elke put en meng de plaat vervolgens bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende vier uur na incubatie verwijder de supernatant en breng deze over naar een vijf milliliter buis. Haal het tetrazoliumproduct eruit door 500 microliter DMSO aan het kraakbeenweefsel in elke put toe te voegen en breng continue agitatie gedurende een uur bij kamertemperatuur aan, verwijder de DMSO-oplossing en trek het met de eerder verzamelde XTT-oplossing.

Breng 100 microliter van elk monster in drievouden over naar een 96 putplaat. Gebruik een plaatlezer om de absorptie op een golflengte van 492 nanometer en een referentiegolflengte van 690 nanometer te meten. Om het RNA-gehakt te isoleren, wordt de tweede helft van het kraakbeenweefsel verkregen uit de osteochondrale plug in kleine stukjes overgebracht naar een buis met keramische kralen en 300 microliter van gelicentieerde buffer.

Met 1% bèta mercaptoethanol gebruik maken van een commercieel lysaat om het weefsel van toepassing 6, 500 RPM homogeniseren gedurende 20 seconden vier keer met een 20 minuten koeling fase na elke run. Voeg 20 microliter proteinase K en 580 microliter RNAs gratis water toe aan elk monster en vouw ze gedurende 30 minuten uit bij 55 graden Celsius. Centrifugeer de monsters gedurende drie minuten op 10.000 keer G en breng de supernatant over op 1,5 milliliter buizen.

Voeg 0,5 volume van 90% ethanol toe aan elke buis en meng vervolgens 700 microliter van het monster naar een RNA-bindingskolom in een twee milliliter opvangbuis en centrifugeer het op 8,000 keer G gedurende 15 seconden. Gooi de doorstroom weg en herhaal de centrifigatiestap voor de rest van het lysaat. Voeg een 350 microliter buffer RW een aan de kolom.

Centrifuge het op 8.000 keer G gedurende 15 seconden en gooi de flow-through. Meng 10 microliter DNA-voorraadoplossing en 70 microliter buffer RDD. Voeg de oplossing toe aan het RNA-zuiveringsmembraan en broed deze gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en voeg vervolgens 350 microliter buffer RW één aan de kolom toe.

Centrifuge het op 8,000 keer G gedurende 15 seconden en gooi de flow-through voeg 500 microliters van buffer RPE aan de RNA zuivering kolom en Centrifuge het op 8, 000 keer G gedurende 15 seconden gooi de stroom door en om nog eens 500 microliter buffer RPE toe te voegen aan de RNA-zuiveringskolom en vervolgens te centrifugeren op 8,000 keer G gedurende twee minuten plaats de kolom in een nieuwe 1,5 milliliter collectie buis en voeg 30 microliter van RNAs gratis water centrifugeren de buis op 8.000 keer G gedurende een minuut, om de RNA gesynthetiseerd cDNA te zinspelen met behulp van een commerciële kit ontdooien en meng alle regio's, voeg de RNA monster en de reactie en de thermische cycler zoals beschreven in de tekst manuscript. Voeg negen microliters van RTQ PCR master mix, en een microliter van cDNA aan elke put van een 96 put plaat met elk monster in drievouden gloeit de PCR plaat met plafondolie en centrifugeren op 877 keer G gedurende 10 minuten op vier graden Celsius uit te voeren RTQ PCR en een precisie en thermische cycler. Volgens de aanwijzingen van het manuscript.

Voorafgaand aan het testen van het contactgebied en de contactdruk op de metalen kraakbeeninterface moet worden bevestigd met behulp van een drukmeetfolie. Fysiologische belastingstoestand kan vervolgens worden bevestigd door de verkregen afdruk te vergelijken met referentie gevolgtrekking voor gedefinieerd contact Een lage wrijvingscoëfficiënt kan ten minste één uur worden gehandhaafd met een migratiecontactgebied. De extracellulaire matrixsamenstelling en -structuur kan worden bepaald met saffraan en O-kleuring.

De intensiteit van saffraan en O-kleuring is evenredig aan het proteoglycangehalte. De proteoglycan inhoud varieert over het gewrichtsoppervlak, maar moet uniform zijn in de weefselsectie in basislijnmonsters, tonen extractie van glycosaminoglycanen die kunnen worden tegengegaan door mechanische belasting. De metabolische activiteit van de runderarticulaire chondracyten is onafhankelijk van de oogstplaats, maar vertoont een toename met mechanische belasting.

De genexpressieniveaus van kraakbeenspecifieke genen verhoogden met fysiologische belastingsomstandigheden. Terwijl katabole genen zijn up-geregeld met stationaire contactgebied. Na deze procedure kan aanvullende analyse worden uitgevoerd, waaronder de bepaling van kraakbeenwebproducten en analyse van gewrichtsoppervlakken met behulp van scanning elektronenmicroscopie en verder proberen we de smering van gewrichtscartilage in verschillende tribologische combinaties te optimaliseren.