Name: Het meten van post-beroerte cerebraal oedeem, infarctzone en bloed-hersenbarrière-afbraak in een enkele set knaagdierhersenmonsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 32 s
Description: Leer een gemodificeerde middelste cerebrale arterie-occlusietechniek om ischemisch hersenletsel, infarctzone, hersenoedeem en bloed-hersenbarrière-permeabiliteit te meten in één knaagdierhersenmonster.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Maryna Kuscheriava, Maksym Kryvonosov, Daryna Yakumenko en Evgenia Goncharyk van de afdeling Fysiologie, Faculteit Biologie, Ecologie en Geneeskunde, Oles Honchar, Dnipro University, Dnipro, Oekraïne voor hun steun en nuttige bijdragen aan onze discussies. De verkregen gegevens maken deel uit van het proefschrift van Ruslan Kuts.

De volgende procedures werden uitgevoerd overeenkomstig de aanbevelingen van de Verklaring van Helsinki en Tokio en de richtsnoeren voor het gebruik van proefdieren van de Europese Gemeenschap. De experimenten werden ook goedgekeurd door de Animal Care Committee van de Ben-Gurion University of the Negev.
1. Ratten voorbereiden op de experimentele procedure
<ol><li>Selecteer volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten zonder openlijke pathologie, elk met een gewicht tussen 300 en 350 g.</li>
	<li>Houd alle ratten op kamertemperatuur op 22 °C, met 12 uur lichte en donkere cycli voor het experiment.</li>
	<li>Zorg ervoor dat voedsel en water ad libitum beschikbaar zijn.</li>
	<li>Voer alle procedures uit tussen 6:00 a.m. en 14:00 uur.m.</li>
</ol>2. Ratten voorbereiden op een operatie
<ol><li>Verdoof de ratten gedurende 30 minuten met isofluraan (4% voor inductie en 2% voor onderhoud) en 24% zuurstof (1,5 L/min).<ol>
<li>Test het anesthesieniveau bij de ratten door ervoor te zorgen dat ze geen pedaalontwenningsreflex hebben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Steek de 24-gauge katheter in de staartader. OPMERKING: Staartverwarming voor vasodilatatie wordt niet uitgevoerd.<ol>
<li>Leg de ratten in een liggende positie op tafel. Gebruik medische tape om alle vier de ledematen van de ratten aan te brengen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats de sonde voor temperatuurmeting in het rectum van de rat vóór de operatie.</li>
	<li>Houd tijdens de procedure een verwarmingsplaat aan om een kernlichaamstemperatuur van 37 °C te ondersteunen.</li>
	<li>Voeg zalf toe in de ogen van de rat voor bescherming.</li>
	<li>Scheer het operatiegebied en desinfecteer met drie toepassingen van 10% povidonjodium gevolgd door 70% isopropylalcohol.</li>
</ol>3. Rechterzijde midden hersenslagader occlusie
OPMERKING: MCAO wordt uitgevoerd met een gewijzigde techniek, zoals eerder beschreven16,22,23, met het gebruik van instrumenten beschreven door McGarry et al.24 en Uluç et al.25.
<ol><li>Ontleed de huid en oppervlakkige fascia aan de ventrale middellijn van de nek met een chirurgisch pincet en een schaar met gebogen messen.</li>
	<li>Identificeer de spierdriehoek, bestaande uit de ICA, uitwendige halsslagader (ERK) en gemeenschappelijke halsslagader (CCA).</li>
	<li>Scheid voorzichtig de juiste CCA en ICA van de nervus vagus met microforceps voor vasculaire chirurgie.</li>
	<li>Ontmasker de juiste CCA en de ICA. Blokkeer de bloedstroom van de CCA naar de ICA met behulp van microclips of speciale tourniquets voor vasculaire chirurgie. Maak een incisie (ongeveer 1 mm) op de ICA met behulp van microscissors voor vasculaire chirurgie.</li>
	<li>Plaats een monofilamentkatheter (4-0 nylon) rechtstreeks door de ICA, ongeveer 18,5-19 mm van het bifurcatiepunt van de rechter CCA in de cirkel van Willis tot het bereiken van een milde weerstand, om de MCA26af te sluiten.</li>
	<li>Ligate rond ICA boven de splitsing van CCA.</li>
	<li>Voer voor de schijngestuurde controlegroep een invoeging van nylondraad uit in plaats van de stappen 3.5 en 3.616,22.</li>
	<li>Dien 5 ml 0,9% natriumchloride toe door intraperitoneale injectie.</li>
	<li>Sluit de wond met hechting en breng de rat naar een herstelgebied. OPMERKING: Een paar minuten na het einde van de anesthesie wordt de rat wakker en beweegt hij zich onafhankelijk rond de kooi.</li>
	<li>Na 23 uur na MCAO 2% Evans blauw injecteren in zoutoplossing (4 ml/kg)23,26 in de staartader voor beide geopereerde groepen via een canule27. OPMERKING: Dit wordt gebruikt als een bloed-hersendoorlatendheid tracer. Laat 60 minuten circuleren.</li>
</ol>4. Bepaling van het infarctgebied
<ol><li>Maatregel IZ om 24 uur na MCAO zoals eerder beschreven9,15,18,19,26. OPMERKING: Ratten die meer dan 20% van hun gewicht verloren of aanvallen of hemiplegie ontwikkelden, zijn uitgesloten van het experiment.</li>
	<li>Euthanaseer de rat door het geïnspireerde gasmengsel te vervangen door 20% zuurstof en 80% kooldioxide totdat de rat spontaan stopt met ademen.</li>
	<li>Open de borstkas met een zijincisie van 5-6 cm door de buikwand onder de ribbenkast met behulp van een schaar en chirurgische tang.</li>
	<li>Voer een diafragmatische incisie uit over de gehele lengte van de ribbenkast met een schaar en chirurgische tang.</li>
	<li>Voorzichtig verplaatsen van de longen, snijd door de ribbenkast tot aan het sleutelbeen aan de rechter- en linkerkant28.</li>
	<li>Perfuse met 200 ml normale zoutoplossing door de linkerventrikel van het hart.</li>
	<li>Prik of inciseer het rechter atrium van het hart met een schaar.</li>
	<li>Voer onthoofding uit met behulp van een guillotine en verzamel hersenweefsel.</li>
	<li>Snijd met behulp van een irisschaar van het foramen magnum naar de distale rand van het achterste schedeloppervlak aan beide zijden.</li>
	<li>Scheid de reukbollen, nerveuze verbindingen langs het ventrale oppervlak en het dorsale oppervlak van de schedel van de hersenen.</li>
	<li>Haal de hersenen uit het hoofd.</li>
	<li>Produceer 6 hersenschijfjes door 2 mm dikke horizontale secties te maken met een .009" roestvrij staal, ongecoat scheermesje met één rand.</li>
	<li>Incubeer gedurende 30 min bij 37 °C in 0,05% TTC.</li>
	<li>Plaats het hersenweefsel op de microscoopdia's en voer optische scans uit van deze 6 hersensegmenten met een resolutie van 1600x1600 dpi (zie bijvoorbeeld Supplement 1).</li>
	<li>Voeg een blauw filter toe met een foto-editor (bijv. Adobe Photoshop CS2) met behulp van de functie Kanaalmixer (Afbeelding > Aanpassingen > Kanaalmixer) en sla de afbeelding op als JPEG-bestandsindeling. OPMERKING: Nadat u het blauwe filter hebt aangebracht, wordt de afbeelding grijs weergegeven.</li>
	<li>Open de opgeslagen afbeelding in ImageJ 1.37v29,30. OPMERKING: Dit computerprogramma gebruikt een drempelfunctie om de pixels zwart of wit te isoleren en te berekenen (zie figuur 1).</li>
	<li>Voor elk van de 6 hersensegmenten van de afbeelding selecteert en slaat u elke hersenhelft (rechts gewond ipsilateraal en links ongedeerd contralateral) op als een afzonderlijk afbeeldingsbestand met behulp van het gereedschap "polygoonselectie" in het hoofdmenu.</li>
	<li>Stel de cut-off in voor het bepalen van de IZ met behulp van een automatische drempelfunctie in het hoofdmenu van de ImageJ-software door Afbeelding > Aanpassen > Drempelwaardete selecteren en het aantal pixels in elke hersenhelft van één hersenset te meten. OPMERKING: Macro's kunnen voor deze stap worden gebruikt in ImageJ-software (zie Supplement 2 voor de code). De cut-off is een kritieke parameter om te bepalen welke pixels naar wit moeten worden geconverteerd en welke naar zwart moeten worden geconverteerd, afhankelijk van de grijstint (zie Supplement 3 en Supplement 4 als voorbeelden). ImageJ vergelijkt vervolgens witte en zwarte pixels om IZ te bepalen. Op basis van het kleuringsprotocol en de scannerinstellingen gebruikten we een constante afkapwaarde van 0,220.</li>
	<li>Voer metingen uit van IZ-correctie voor weefselzwelling met behulp van de verhoudingen van ipsilaterale en contralaterale hersenhelften (RICH) methode13,23 (zie voorbeeld in supplement 5). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ01.jpg"> OPMERKING: De grootte van het infarct wordt beoordeeld als een percentage van de contralaterale hemisfeer.</li>
</ol>5. Bepaling van hersenoedeem31
OPMERKING: Gebruik ImageJ 1.37v voor het meten van BE32,33.
<ol><li>Meet BE 24 uur na MCAO. Gebruik voor de berekening van BE de gegevens van het volume van de linker- en rechterhersenhelft (in eenheden).</li>
	<li>Voer optische scans uit met een resolutie van 1600x1600 dpi (zie bijvoorbeeld Supplement 1).</li>
	<li>Selecteer hersenhelften en stel de cut-off in voor het bepalen van BE met ImageJ 1.37v, zoals hierboven beschreven in de paragrafen 4.17-4.19.</li>
	<li>Druk het BE-gebied uit als een percentage van de standaardgebieden van de niet-aangetaste contralaterale hemisfeer, berekend door de RICH-methode met behulp van de volgende vergelijking (zie voorbeeld in supplement 5)23,34. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61309/61309equ02v2.jpg"> OPMERKING: De omvang van BE wordt beoordeeld als een percentage van de contralaterale hemisfeer.</li>
</ol>6. Bepaling BBB-storing
<ol><li>Maatregel BBB-storing 24 uur na MCAO.</li>
	<li>Verdeel de rechter- en linkerhersenhelft in zes plakjes en doe ze allemaal in een microcentrifugebuis.</li>
	<li>Homogeniseer elk deel van het hersenweefsel in trichloorazijnzuur, gebaseerd op de berekening van 1 g hersenweefsel in 4 ml van 50% trichloorazijnzuur.</li>
	<li>Centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 20 min.</li>
	<li>Verdun supernatant vloeistof 1:3 met 96% ethanol.</li>
	<li>Voer luminescentiespectrofotometrie uit met behulp van spectrofotometriesoftware, installeer de plaat en voer een monstermeting uit met behulp van de volgende parameters: fluorescentie-intensiteit excitatiegolflengte van 620 nm (bandbreedte 10 nm) en een emissiegolflengte van 680 nm (bandbreedte 10 nm)23,35 ; Mod bovenkant; Nummer Vlees 25; Handleiding 100; Schudden 1 sec, 1 mm. OPMERKING: Gebruik een excitatiegolflengte van 620 nm (bandbreedte 10 nm) en een emissiegolflengte van 680 nm (bandbreedte 10 nm). 23,35 jaar
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het belangrijkste doel van dit protocol was om consistente metingen van drie belangrijke parameters van ischemische schade aan te tonen: IZ, BE en BBB permeabiliteit. Eerdere studies op dit gebied hebben de mogelijkheid aangetoond om een of twee van deze parameters samen in dezelfde steekproef uit te voeren. Naast de kostenreductie die deze driedelige methode biedt, biedt het ook een wenselijker bio-ettisch model dat het aantal dieren beperkt dat moet worden geopereerd en vervolgens geëuthanaseerd. Zoals in alle histolog...

Een van de meest voorkomende oorzaken van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd is beroerte. Wereldwijd vertegenwoordigt ischemische beroerte 68% van alle beroertegevallen, terwijl in de Verenigde Staten ischemische beroerte 87% van de beroertegevallenvertegenwoordigt 1,2. Geschat wordt dat de economische last van beroerte in de Verenigde Staten2 en 45 miljard EUR in de Europese Unie3bedraagt . Diermodellen van beroerte zijn nodig om de pathofysiologie te bestuderen, nieuwe methoden voor evaluatie te ontwikkelen en nieuwe therapeutische opties voor te stellen4.
Ischemische beroerte treedt op met occlusie van een belangrijke hersenslagader, meestal de middelste hersenslagader of een van de takken5. Zo hebben modellen van ischemische beroerte van oudsher betrekking gehad op midden-cerebrale slagader occlusie (MCAO)6,7,8,9,10,11,12. In navolging van MCAO, neurologisch letsel wordt meestal beoordeeld door infarctzone (IZ) te meten met behulp van een 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuringsmethode13, hersenoedeem (BE) met behulp van of het berekenen van hemisferische volumes14,15,16, en bloed hersenbarrière (BBB) permeabiliteit door middel van een spectrometrie techniek met behulp van Evans blauwe kleuring17,18,19.
De traditionele MCAO-methode maakt gebruik van afzonderlijke sets hersenen voor elk van de drie hersenmetingen. Voor een grote steekproefgrootte resulteert dit in een aanzienlijk aantal geëuthanaseerde dieren, met extra ethische en financiële overwegingen. Een alternatieve methode om deze kosten te verlichten zou metingen van alle drie parameters in één set post-MCAO knaagdierhersenen omvatten.
Eerdere pogingen zijn gedaan om combinaties van parameters in hetzelfde hersenmonster te meten. Gelijktijdige immunofluorescente kleuringsmethoden20 evenals andere moleculaire en biochemische analyses21 zijn beschreven na TTC-kleuring in hetzelfde hersenmonster. We hebben eerder de volumes van de hersenhelft berekend om hersenoedeem te beoordelen en TTC-vlekken uitgevoerd om de infarctzone in dezelfde hersenset15te berekenen.
In dit protocol presenteren we een aangepaste MCAO-techniek die ischemisch hersenletsel meet door de permeabiliteit van IZ, BE en BBB in dezelfde set knaagdierhersenen te bepalen. IZ wordt gemeten door TTC-kleuring, BE wordt bepaald door het hemisferische volume te berekenen en BBB-permeabiliteit wordt verkregen door spectrometriemethoden19. In dit protocol gebruikten we een aangepast MCAO-model, gebaseerd op directe invoeging en fixatie van de monofilamentkatheter in de interne halsslagader (ICA) en verdere blokkering van de bloedtoevoer naar de middelste hersenslagader (MCA)22. Deze gewijzigde methode vertoont een verlaagd sterftecijfer en morbiditeit in vergelijking met de traditionele MCAO-methode16,22.
Deze nieuwe aanpak biedt een financieel verantwoord en ethisch model voor het meten van neurologisch letsel na MCAO. Deze beoordeling van de belangrijkste parameters van ischemisch hersenletsel zal helpen om de pathofysiologie uitgebreid te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>2 mL Syringe</td><td>Braun</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>2% chlorhexidine in 70% alcohol solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>500 cc</td><td>Biedt algemene antisepsis van de huid in het operatiegebied</td></tr><tr><td>27 G Naald met Syringe</td><td>Braun</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>3-0 Zijde suturen</td><td>Henry Schein</td><td>1007842</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Nylon suture</td><td>4-00</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brain & Tissue Matrices</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15013</td><td></td></tr><tr><td>Cannula Venflon 22 G</td><td>KD-FIX</td><td>183603985447</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Sigma 2-16P</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sigma 2-16P</td><td></td></tr><tr><td>Compact Analytical Balances</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HR-AZ/HR-A</td><td></td></tr><tr><td>Digital weegschaal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Rs 4,000</td><td></td></tr><tr><td>Dissectie schaar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z265969</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf pipet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z683884</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf buis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030119460</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentie detector</td><td>Tecan, M&auml;nnedorf Zwitserland</td><td>Model: Infinite 200 PRO multimode reader</td><td>Optioneel.</td></tr><tr><td>Fluorescentie detector</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>VWR cat. # 10822 512 SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader Base Instrument</td><td>Optioneel.</td></tr><tr><td>Gaasjes</td><td>Fisher</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>Verwarming met thermometer</td><td>Heatingpad-1</td><td>Model: HEATINGPAD-1/2</td><td></td></tr><tr><td>Hemostatic microclips</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Horizon-XL</td><td>Mennen Medical Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infuus manchet</td><td>ABN</td><td>IC-500</td><td></td></tr><tr><td>Micro forceps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro schaar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiset</td><td>Teva Medical</td><td>998702</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX 40 microscoop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Operatie forceps</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Operatie schaar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optische scanner</td><td>Canon</td><td>Cano Scan 4200F</td><td>Resolutie 3200 x 6400 dpi</td></tr><tr><td>Petrischalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5606</td><td></td></tr><tr><td>Purina Chow</td><td>Purina</td><td>5001</td><td>Rodent laboratory chow gegeven aan ratten, muizen en hamsters is een levenscyclusvoeding die al meer dan 5 decennia wordt gebruikt in biomedisch onderzoek. Aan ratten ad libitum gegeven in dit experiment.</td></tr><tr><td>Rattenkooien</td><td>Techniplast</td><td>2000P</td><td>Conventionele huisvesting voor knaagdieren. Kooien werden gebruikt voor het huisvesten van ratten gedurende het hele experiment</td></tr><tr><td>Scalpel blades #11</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS2 voor Windows</td><td>Adobe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.37v</td><td>NIH</td><td></td><td>De broncode is gratis beschikbaar. De auteur, Wayne Rasband (wayne@codon.nih.gov), werkt bij de Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA</td></tr><tr><td>SPSS Statistics 22</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Office 365 ProPlus</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td>Microsoft Office Excel</td></tr><tr><td>Windows 10</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-Trifenyltetrazolichloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>50% trichloroazijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>76-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 96 %</td><td>Romical</td><td></td><td>Ontvlambare vloeistof</td></tr><tr><td>Evans blue 2%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP 100%</td><td>Piramamal Critical Care, Inc</td><td>NDC 66794-017</td><td></td></tr></tbody></table>

het meten van post-beroerte cerebraal oedeem, infarctzone en bloed-hersenbarrière-afbraak in een enkele set knaagdierhersenmonsters

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

Een van de meest voorkomende oorzaken van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd is ischemische beroerte. Historisch gezien omvat een diermodel dat wordt gebruikt om ischemische beroerte te stimuleren midden-cerebrale slagader occlusie (MCAO). Infarctzone, hersenoedeem en afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB) worden gemeten als parameters die de omvang van hersenletsel na MCAO weerspiegelen. Een belangrijke beperking van deze methode is dat deze metingen normaal gesproken worden verkregen in verschillende monsters van rattenhersenen, wat leidt tot ethische en financiële lasten vanwege het grote aantal ratten dat moet worden geëuthanaseerd voor een geschikte steekproefgrootte. Hier presenteren we een methode om hersenletsel na MCAO nauwkeurig te beoordelen door infarctzone, hersenoedeem en BBB-permeabiliteit in dezelfde set rattenhersenen te meten. Deze nieuwe techniek biedt een efficiëntere manier om de pathofysiologie van beroerte te evalueren.

Infarctzonemeting
Een onafhankelijke t-test gaf aan dat 19 ratten die permanente MCAO ondergingen een significante toename van het infarctvolume van de hersenen vertoonden in vergelijking met de 16 schijnratten (MCAO = 7,49% ± 3,57 vs. Sham = 0,31% ± 1,9, t(28,49) = 7,56, p < 0,01 (zie figuur 2A)). De gegevens worden uitgedrukt als een gemiddeld percentage van de contralaterale hemisfeer ± SD.
...

Dit protocol beschrijft een nieuwe techniek om de drie belangrijkste parameters van ischemisch hersenletsel te meten op dezelfde set knaagdierhersenmonsters. Het gebruik van slechts één hersenmonster is zeer voordelig in termen van ethische en economische kosten.

Het meten van post-beroerte cerebraal oedeem, infarctzone en bloed-hersenbarrière-afbraak in een enkele set knaagdierhersenmonsters

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

In het huidige protocol presenteren we een gemodificeerde middenhersenslagader-occlusietechniek die ischemische hersenschade meet om een infarctzone, hersenoedeem en BBB-permeabiliteit in dezelfde reeks knaagdierhersenen te bepalen. Wat betreft ethische en economische kosten is het grootste voordeel van deze techniek dat er slechts één hersenmonster nodig is voor alle drie de metingen. Deze beoordeling van de belangrijkste parameters van ischemische hersenschade zal helpen om de pathofysiologie van ischemische beroerte volledig te onderzoeken.Verwijder om te beginnen de rattenhersenen en snijd 2 millimeter dikke horizontale secties met een 0,009-inch roestvrijstalen, ongecoat, eenzijdig scheermesje. Plaats de secties in 0,005% TTC en incubeer ze gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius, plaats vervolgens het hersenweefsel op de microscoopglazen en voer een optisch scannen uit van de zes hersenslices met een resolutie van 1600 x 1600 DPI. Gebruik een foto-editor om een blauwe filter toe te voegen aan de afbeeldingen.Nadat u de software hebt geopend, gaat u naar afbeelding, aanpassingen en kanaalmixer. Selecteer blauw als uitvoerkanaal en vink monochroom aan, klik vervolgens op oké. Sla de afbeelding op in het JPEG-bestandsformaat.Gebruik de polygoonselectietool in ImageJ versie 1.37 om elk halfrond van elk van de zes hersenslices te selecteren en sla het op als een apart afbeeldingsbestand. Gebruik een macro om de pixels in de afbeelding om te zetten in wit of zwart, op basis van een drempelwaarde, om het infarctvolume en hersenoedeem te berekenen. Sluit vervolgens alle bestanden en gebruik een tweede macro om het aantal witte en zwarte pixels te vergelijken om het infarctvolume en hersenoedeem te bepalen.Kopieer de ruwe gegevens naar een spreadsheet. Corrigeer bij het berekenen van het infarctvolume voor weefselzwelling door de verhoudingen van ipsilaterale en contralaterale hersenhelften te gebruiken. Druk de hersenoedeemgebieden uit als een percentage van de standaardgebieden van de onaangetaste contralaterale hersenhelft.Bepaal de verstoring van de bloed-hersenbarrière 24 uur na occlusie. Verdeel de rechter- en linkerhersenhelften in zes plakjes en doe elk plakje in een microcentrifugebuisje. Homogeniseer elk plakje van het hersenweefsel in trichloroazijnzuur, met 4 milliliter 50% trichloroazijnzuur per gram hersenweefsel.Centrifugeer de monsters bij 10.000 keer G gedurende 20 minuten, breng vervolgens het supernatant over in een verse buis en verdun het 1:3 met 96% ethanol. Voer luminescentiespectrofotometrie uit met een platelezer. Een onafhankelijke steekproef-t-test gaf aan dat 19 ratten die een permanente middenhersenslagader-occlusie, of MCAO, ondergingen, een significante toename vertoonden in het volume van herseninfarct in vergelijking met de 16 sham-geopereerde ratten.De ratten die een permanente MCAO ondergingen, vertoonden ook een significante toename in de mate van hersenoedeem en bloed-hersenbarrièrebreuk na 24 uur, in vergelijking met de sham-geopereerde dieren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de chemische concentraties voldoen aan het protocol. Dit protocol maakt het mogelijk om alle drie de parameters van ischemische schade in één hersenmonster te evalueren.

measuring-post-stroke-cerebral-edema-infarct-zone-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

This video demonstrates the assessment of the infarct zone and brain edema in brain slices from rats subjected to middle cerebral artery occlusion. Infarcted areas are identified using redox staining, while a blue filter and threshold function in image analysis software quantify the infarct zone and edema in the affected hemisphere.

Measuring the Infarct Zone and Brain Edema in a Rat Brain Following Middle Cerebral Artery Occlusion

Source: Zeynalov, E. et. al., Continuous IV Infusion is the Choice Treatment Route for Arginine-vasopressin Receptor Blocker Conivaptan in Mice to Study Stroke-evoked Brain Edema. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the intravenous delivery of an arginine-vasopressin (AVP) receptor antagonist in a mouse model. Transient middle cerebral artery occlusion induces brain edema. An AVP receptor antagonist is administered through a catheter in the left jugular vein, alleviating edema.

Intravenous Delivery of Receptor Blockers to Reduce Brain Edema in a Mouse Model

Cerebrale perfusie controle is aangetoond dat de nauwkeurigheid van ischemische beroerte modellen te verbeteren. Technische moeilijkheden beperken vaak het gebruik van dit essentieel instrument voor cerebrovasculaire onderzoek. In deze video wordt een geoptimaliseerd systeem getoond op een of meerdere locaties hemodynamische bewaking verkrijgen tijdens intraluminale middelste cerebrale slagader occlusie in ratten.

Geoptimaliseerde Systeem voor cerebrale perfusie Monitoring in het Rat Stroke Model van intraluminale midden cerebrale slagader occlusie

Brain myeloïde cellen karakterisatie volgende slag kan worden uitgevoerd door stereology de optische fractioneerinrichting methode of een flowcytometrische analyse van hersenen leukocyten suspensies. Beide zijn nuttige technieken om een ​​nauwkeurige fenotypische onderscheiding van de belangrijkste myeloïde cel subsets in de ischemische hersenen voeren.

Stereological en flowcytometrie Karakterisering van leukocytsubpopulaties in Modellen van voorbijgaande of blijvende cerebrale ischemie

Dit protocol beschrijft repetitieve hypoxische preconditie, of korte blootstellingen aan systemische hypoxie die infarctvolumes en bloed-hersenbarrière-storingen verminderen na een voorbijgaande occlusie van de middelste hersenslagader bij muizen. Het beschrijft ook dubbele kwantificering van infarctvolume en bloed-hersenbarrière-storing na een beroerte om de werkzaamheid van neurovasculaire bescherming te beoordelen.

Kwantificering van Neurovasculaire Protection Na Repetitive Hypoxische Voorconditionering en Transient midden cerebrale slagader Occlusie in Muizen

We beschrijven een muismodel van een beroerte veroorzaakt door de occlusie van de middelste hersenslagader met behulp van een met siliconen omhulde naald. Het protocol kan worden toegepast om een permanente occlusie of een tijdelijke ischemie te induceren, gevolgd door reperfusion.

Inductie van ischemische beroerte en ischemie-reperfusie in Muizen met behulp van het Midden-slagader occlusie Techniek en Visualisatie van Infarct Area

Het algemene doel van deze procedure is bedoeld als een zeer reproduceerbaar techniek voor in vivo beoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in rat modellen van ischemische beroerte.

In Vivo eenbeoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in een Rat Model van ischemische beroerte

Hier presenteren we een protocol te induceren post-takt depressie bij ratten door afsluiter het midden cerebrale slagader via de interne halsslagader. We gebruiken de Porsolt geforceerde zwem test en de sacharose voorkeur test om geïnduceerde depressieve stemmingen te bevestigen en te evalueren.

Een middelste cerebrale slagader occlusie techniek voor het induceren van post-takt depressie bij ratten

Het doel van deze studie is het vaststellen en valideren van een diermodel voor onderzoek in de herstel-en sequela stadia van hersen ischemie door het testen van herseninfarct en sensorimotorische functie na de middelste cerebrale slagader occlusion/reperfusie (MCAO/R) na 1-90 dagen bij ratten.

Een preklinisch model om hersen herstel na acute beroerte bij ratten te beoordelen

Het hier gepresenteerde protocol toont een techniek om een knaagdiermodel van hersenletsel te creëren. De hier beschreven methode maakt gebruik van laserbestraling en richt zich op de motorische cortex.

Laser-Geïnduceerde hersenletsel in de motorische cortex van ratten

Leer een gemodificeerde middelste cerebrale arterie-occlusietechniek om ischemisch hersenletsel, infarctzone, hersenoedeem en bloed-hersenbarrière-permeabiliteit te meten in één knaagdierhersenmonster.

Het meten van post-beroerte cerebraal oedeem, infarctzone en bloed-hersenbarrière-afbraak in een enkele set knaagdierhersenmonsters (Video) | JoVE Journal

Het meten van post-beroerte cerebraal oedeem, infarctzone en bloed-hersenbarrière-afbraak in een enkele set knaagdierhersenmonsters

Meer video's verkennen