Modellering van primaire bottumoren en botmetastase met implantatie van solide tumortransplantaten in bot

Deze studie biedt flexibiliteit bij het creëren van primaire bottumoren of botmetastasen door vaste tumorgraften in bot te plaatsen. Deze techniek wijkt af van het injecteren van tumorcelsuspensies in het bot. Deze methode overwint de beperking van longemboli van tumorcelsuspensie-injecties.

Een ander voordeel is het creëren van een meer uniforme model in vergelijking met spontane botmetastase of na intravasculaire celinjectie. Op basis van de implantatie van vaste tumorgraften, bestaan er mogelijkheden die verder gaan dan menselijke of muismodellen, maar het gebruik van op patiënten gebaseerde xenograften kan leiden tot op specifieke patiënten afgestemde therapieën. De primaire focus is voor gebruik in kankeronderzoek zoals tumormicro-omgeving, metastase, geneesmiddelontdekking, kankergenetica en precisiegeneeskunde.

Visuele demonstratie is essentieel om de belangrijkste stappen van het creëren van de subcutane tumor, dissectie en creatie van de tumorgraft, en chirurgische implantatie in de tibia te laten zien. Voor subcutane tumorinductie, verzamel de cellijn van belang met behulp van een geschikte cellophopingsoplossing en resuspendeer de cellen in een concentratie van één tot twee keer 10 tot de vijfde cellen tot 100 tot 150 microliter steriele PBS. Plaats de cellen op ijs.

Reinig de blootgestelde huid met 70% ethanol en laad de cellen in een Tuberculin-spuiten gevuld met een 27 gauge naald. Injecteer vervolgens de cel subcutaan in een regio van gedesinfecteerde huid die niet wordt beïnvloed door de beweging van de schouderbladen. Gebruik een calliper om de grootte van de subcutane tumor boven de dorsale thorax of buik te controleren, en meet het lichaamsgewicht van het dier wekelijks om ervoor te zorgen dat de tumor niet ulcereert of dat de muis niet voldoet aan de criteria voor vroegtijdige verwijdering zoals vastgesteld door het Institutioneel Comité voor Dierverzorging en -gebruik.

Wanneer de tumor 15 millimeter bereikt in elke dimensie, gebruik 70% ethanol om de huid te steriliseren en gebruik een 15 scalpel om de huid boven de tumor in te snijden. Gebruik steriele chirurgische schaar om de tumor scherp te dissecteren van de omliggende gehechtte zachte weefsels en plaats de tumor in één put van een zes-puttenplaat met compleet groeimedium. Gebruik de scalpel om de tumor in geschikt gegrootte fragmenten te snijden en plaats de fragmenten in een nieuwe container met steriele compleet groeimedium op kamertemperatuur.

Voor cryoconservatie, verzamel meerdere fragmenten in één cryovial in compleet groeimedium aangevuld met 20% foetaal bovien serum en 10% dimethylsulfoxide en gebruik een commercieel cryoconservatiesysteem op min 80 graden Celsius om het weefsel geleidelijk te bevriezen voordat het langdurig wordt opgeslagen in vloeibare stikstof. Om tumorfragmenten te bewaren voor latere analyse maar niet voor toekomstige implantatie, bevries de monsters snel door onderdompeling in vloeibare stikstof en bewaar de bevroren tumorfragmenten langdurig op min 80 graden Celsius. Voor subcutane tumorfragmentimplantatie, breng eerst de tumorfragmentensuspensie naar kamertemperatuur.

Bevestig vervolgens het ontbreken van reactie op de peesreflex bij een geanesthetiseerde ontvangende muis en geef subcutaan pijnstilling toe. Om het mogelijke trauma aan de huid te minimaliseren, gebruik ontharingscreme om het haar op de rechter kniegewricht en proximale tibia van de aangesloten achterste ledemaat te verwijderen. Schrob de blootgestelde huid met 70% ethanol, gevolgd door afwisselende chloorhexidine en zoutoplossing scrubs.

Tijdens het buigen en strekken van het gewricht, visualiseer de proximale tibia als de regio net distaal van het kniegewricht en gebruik een 15 scalpelblad om een incisie van drie tot vier millimeter te maken op het niveau van de proximale tibia op de mediale aspect van het ledemaat door de huid en het subcutane weefsel om de mediale cortex van de proximale tibia bloot te leggen. Om een klein gat in de mediale cortex van de proximale tibia te maken, gebruik de punt van een 25 gauge naald om zachte druk uit te oefenen terwijl de punt ongeveer twee millimeter distaal van het kniegewricht wordt gedraaid en op gelijke afstand tussen de craniale en caudale tibiale cortexen. Wanneer het gat is gemaakt, gebruik steriele pincetten of een 27 tot 30 gauge naald om minimaal 0,5 kubieke millimeter tumorfragmenten in de mergholte van de proximale tibia te plaatsen en gebruik een 27 tot 30 gauge naald om de tumorfragmenten in de mergholte te manipuleren.

Na het plaatsen van alle fragmenten, breng de huidranden samen met het geschikte materiaal en breng het dier terug in zijn kooi met bewaking tot het weer loopkundig is. Evalueer vervolgens de tibiale tumorgroei niet-invasief door wekelijkse digitale radiografie, bioluminescentie of fluorescentiebeeldvorming, en gebruik callipers om het ledemaat op de implantatieplaats te meten. Succesvolle implantatie kan worden gedocumenteerd met geavanceerde beeldvorming.

In deze representatieve analyse was het corticale defect dat werd gecreëerd voor tumorgraftimplantatie een week na implantatie zichtbaar in de proximale tibia. Tegen de tweede week kon zichtbare osteolyse en botremodellering naast het corticale defect worden waargenomen. Van week twee tot vijf trad aanvullende progressieve botvernietiging en de vorming van nieuw bot op in verband met tumorimplantatie en groei.

Er moet voorzichtig worden gehandeld bij het maken van een klein gaatje in de proximale tibia. Vertrouw op het draaien van de punt met zachte tot minimale druk waardoor de naaldpunt het werk kan doen. Na deze procedure kan tumorgraftplaatsing op andere botlocaties, plaatsing van organoïden of tumorcellen in de extracellulaire matrix in het botdefect of moleculaire en histologische analyse naast beeldvorming worden uitgevoerd.