Automatisering van bio-atoomkrachtmicroscoopmetingen op honderden C. albicans-cellen

Atoomkrachtmicroscoopautomatisering is een belangrijke innovatie in de evolutie van de technologie naar biomedische toepassingen. Het opent ook toegang tot het onderzoek naar de biomechanische eigenschappen van celpopulaties. Onze methode maakt het mogelijk om AFM-metingen voor 1.000 cellen in vier uur vast te leggen, in vergelijking met de gebruikelijke methoden, die vier uur duren om 10 cellen te meten, dit is echt een aanzienlijke tijdwinst.

Als automatisering een voorwaarde is om deze technologie in ziekenhuislaboratoria te brengen, suggereert dit proof of concept-protocol het potentieel voor gebruik bij de ontwikkeling van specifieke medische diagnostische strategieën. Dit protocol maakt gebruik van een veelzijdige PDMS-stam die kan worden gevuld met verschillende microben waardoor verschillende systemen kunnen worden verkend. Om de PDMS-stempel te bereiden, mengt u 55 gram PDMS-prepolymeeroplossing met een massaverhouding van 10 tot één in PDMs, oligomeren en uithardingsmiddel en ontgast u de resulterende oplossing onder vacuüm op één keer 10 tot de negatieve één tot één keer 10 tot de negatieve twee staven gedurende vijf tot 10 minuten.

Wanneer alle vangbellen zijn verwijderd, giet je 20 gram van de ontgaste oplossing op een siliconen mastervorm tot een dikte van twee tot drie millimeter en ontgass je het opnieuw. Wanneer alle bellen zijn verwijderd, moet u het PDMS gedurende een uur op 80 graden Celsius laten staan en een scalpel gebruiken om de PDMS micro gestructureerde stempel parallel aan de zichtbare microstructuurarrays te snijden. Schil vervolgens de stempel van de siliconen mastervorm en plaats de stempelmicrostructuurplaats op een glazen dia met de microstructuren uitgelijnd met de zijkant van de dia.

Om de cellen voor het apparaat voor te bereiden, centrifugeer 600 microliters van de celsuspensie van belang en voeg 200 microliters van het supernatant toe aan de stempel. Ontgast het supernatant ongeveer 40 minuten onder vacuüm. Wanneer alle bellen zijn verwijderd, vervangt u het supernatant van het PDMS-oppervlak door 200 microliters van de geresuspendeerde celoplossing gedurende een incubatietijd van 15 minuten bij kamertemperatuur.

Om de cellen in de microstructuren van de stempel te laden, gebruikt u een glazen schuif die onder een hoek van 30 tot 50 graden wordt gehouden om de cellen in beide richtingen over de stempel te spreiden, meerdere keren indien nodig. Wanneer een hoge vulsnelheid van de microstructuren is bereikt, gebruik dan een pipet om de celsuspensie te verwijderen en was de drie keer met één milliliter acetaatbuffer per wasbeurt om eventuele ongetradeerde cellen te verwijderen. Gebruik na de laatste wasbeurt de stikstofstroom om de achterkant van het monster te drogen en plaats de stempel in een petrischaal.

Voeg vervolgens twee milliliter verse acetaatbuffer toe aan de schaal. Voor atoomkrachtmicroscopie van de cellen plaatst u de schotel op het stadium van de atoomkrachtmicroscoop en centreert u het stadium op nul tot nul. Wanneer het podium is gecentreerd, verplaatst u de schaal in de petrischaalhouder van de microscoop en lijnt u de rand van de stempel uit zodat deze loodrecht staat op de y-as van de petrischaalhouder.

Plaats vervolgens de krachtkop van de atoommicroscoop op het podium en zorg ervoor dat de stappenmotoren voldoende zijn uitgeschoven om te voorkomen dat de punt op de stempel crasht. Gebruik voor beeldvorming de microscoopknoppen om de atoomkrachtmicroscooppunt over de linkerhoek van de 4,5 bij 4,5 vierkante micrometerputten te centreren en selecteer de krachtmappingmodus in de microscoopsoftware. Om een 64 bij 64 krachtkaart in te stellen over een gebied van 100 bij 100 micrometer, stelt u het relatieve instelpunt in op drie tot vijf nano Newton, de Z-lengte op vier micrometer, de Z-beweging op constante duur, de verlengingstijd tot 0,01 seconden, de verlengingsvertraging op nul, de intrekkingsvertraging op nul, de vertragingsmodus op constante kracht , de steekproeffrequentie tot 2048 Hertz.

Schakel Z closed loop uit en controleer de vierkante afbeelding. Stel de snelle toegang in op 100 micrometer, de langzame as op 100 micrometer, de X-offset op nul micrometer, de Y-offset op nul micrometer, de rasterhoek op nul graden, de pixels op 64 bij 64 en de pixelverhouding op één op één. Open vervolgens de automatiseringssoftware.

Selecteer in het pop-upvenster het pad naar het scriptbestand. Voer de W1-coördinaat in de variabele P1-regel 239 van de sectie invoervak van het gyfonscript en de W2-coördinaatwaarde in de variabele P2-regel 241 in. Schrijf de toonhoogtewaarde toe aan de toonhoogtevariabele lijn 245 van het script en voer de putdimensie in, die kan worden bepaald aan de hand van het ontwerp van de putpatronen in de variabele W-S-lijn 248.

Schrijf het pad naar de opslagmap in regel 251 om de gegevens op de gewenste plaats op te slaan en stel de variabele regel 254 voor het totale gebied in op de wens om meerdere uiteinden van de 100 micrometer te bereiken. Stel vervolgens de matrixrij en kolom krachtcurven in die per put zijn opgenomen in de variabele regel 257 voor getalscans en klik op uitvoeren om het programma te starten. Als u de gegevens wilt analyseren, gebruikt u de videostudiocodesoftware om het Python-script te openen en het Python-script voor kopieerbestanden uit te voeren om de forcecurvebestanden in één map te ordenen.

Voer het pad in naar de algemene map waar de gegevens worden opgeslagen. om de krachtcurven te analyseren, opent u de gegevensverwerkingssoftware van de fabrikant van de atoomkrachtmicroscoop. Selecteer in het bestandsmenu een batch spectroscopiecurven.

Selecteer vervolgens het bestand- en laadproces en selecteer het stijfheidsproces. Selecteer de laatste stap van het proces en klik op houden en toepassen op iedereen, zodat alle krachtcurven dezelfde behandeling krijgen. Als u het R-script wilt openen, laadt u de bestanden met de informatie die met de gegevensverwerkingssoftware is geëxtraheerd in de R-studiosoftware.

Klik in het omgevingsvenster op gegevensset importeren en klik vanuit tekstlezer in het pop-upvenster op bladeren om het TSV-bestand met de stip te zoeken. Zodra het bestand is geladen, selecteert u het gebied voor het uitvoeren van code en voert u alles uit om alle code uit te voeren. Hier worden typische histogrammen getoond die zijn verkregen met behulp van het protocol zoals gedemonstreerd.

In deze analyse werd de stijfheidsherpartitie geregistreerd op 957 inheemse cellen, terwijl in deze analyse de stijfheid van 574 caspofungine behandelde cellen werd gemeten. Weet dat het gebruik van honderden cellen het mogelijk maakt om een bi-modale verdeling van de waarden waar te nemen. In kleinere monsters wordt meestal een enkele verdeling waargenomen en kan dit leiden tot een gebrek aan observatie van de populatie heterogeniteit.

Een vergelijking van de twee aandoeningen benadrukt de effecten van Caspofungin op het verminderen van de celstijfheid. Een onthuld door ANOVA vergelijking van de inheemse en behandelde cellen, de twee voorwaarden vertonen zeer, aanzienlijk verschillende stijfheden. Deze waarde werd bereikt vanwege het grote aantal geanalyseerde cellen, waardoor een groter vertrouwen in de verkregen resultaten.

Het toevoegen van het supernatant aan de PDMS-stempel voordat de cellen herhaaldelijk in de putten worden gespoeld totdat de stempel vol is, is van cruciaal belang voor het succes van de analyse. In deze proof of concept werden Candida albicans cellen geanalyseerd, maar het protocol kan worden toegepast op elke groep patrooncellen, moleculen of materialen.