Kwantificering van de inname van macronutriënten in een thermogenetisch neuronaal scherm met drosophilalarven
11 juni 2020
Hier wordt een protocol beschreven dat de colorimetrische kwantificering mogelijk maakt van de hoeveelheid voedsel die binnen een bepaald tijdsinterval wordt gegeten door Drosophila melanogasterlarven die worden blootgesteld aan diëten van verschillende macronutriëntenkwaliteit. Deze assays worden uitgevoerd in de context van een neuronaal thermogenetisch scherm.
Ons protocol maakt identificatie mogelijk van larvale neuronale populaties die voedingskeuzes coderen die gerelateerd zijn aan de controle van de innameniveaus van twee belangrijke macronutriënten, eiwitten en koolhydraten. De eenvoud en relatief hoge doorvoer van onze methode maakt de kwantificering van voedselinname mogelijk voor verschillende genotypen die zijn blootgesteld aan verschillende voedingsomstandigheden. Om de ouderlijke lijnen genetisch te kruisen, zet 60 millimeter embryo-verzamelkooien op met L3-kweekplaten die zijn aangevuld met wat actieve gistpasta.
Breng de volwassen TripA1 vrouwelijke maagden en Janelia GAL4 mannetjes van vijf tot acht dagen oud over naar de embryo-verzamelkooien en laat het paringsproces 24 tot 48 uur plaatsvinden bij 25 graden Celsius met 60% vochtigheid en een 12, 12 licht donker cyclus. Na de paringsperiode, breng de gepaarde volwassen vliegen over naar nieuwe L3-kweekplaten en laat het leggen van eieren gedurende drie tot vier uur bij 25 graden Celsius plaatsvinden. Zorg ervoor dat alle platen zijn gelabeld met het genotype en de datum van het leggen van eieren.
Wanneer de eierleggende periode is afgelopen, verwijder de platen uit de kooien en schat het aantal eieren per plaat door het aantal embryo's in een kwart van de plaat te tellen. Houd de larvale dichtheid tot maximaal 200 embryo's per plaat en dek de platen af met plastic deksels. Incubeer de L3-kweekplaten gedurende negen dagen bij 18 graden Celsius, 60% vochtigheid en een 12, 12 licht donker cyclus.
Na de incubatie, verzamel drie groepen van 10 L3 van elk van de te testen genotypen, evenals een groep van 10 L3 voor de nul kleurstof voedselcontrole. Gebruik nummer vijf of lichtgewicht pincetten om de larveverzameling zo voorzichtig mogelijk uit te voeren. Breng de verzamelde larven over naar plastic gewichtsschalen met één milliliter water.
Stel een incubator van 30 graden Celsius in en houd de luchtvochtigheid hoog door een lade gevuld met water toe te voegen om uitdroging van de larven tijdens de test te voorkomen. Breng de temperatuur van de testplaten in evenwicht door ze op te warmen tot 30 graden Celsius voordat u begint. Zorg ervoor dat alle platen zijn gelabeld met het genotype en de eiwit-koolhydraatverhouding van het dieet.
Verwarm de experimentele larven gedurende twee minuten door de plastic schalen met de dieren direct over te brengen naar een waterbad van 37 graden Celsius. Stel het vereiste aantal timers in voor één uur, giet vervolgens voorzichtig het water uit de plastic schalen en breng de L3-groepen over van de schalen naar het midden van de testplaten. Dek de platen af en start de timer.
Laat de larven gedurende één uur bij 30 graden Celsius in het donker voeden. Stop de voedingstest door de platen over te brengen naar een ijsbad. Bereid voor elke geteste L3-groep twee microbuisjes van een milliliter voor met voldoende 0,5 millimeter glazen kralen om de onderkant van het microbuisje te vullen en 300 microliters ijskoud methanol.
Gebruik een koeltafel om de microbuisjes koud te houden. Haal voorzichtig de L3-groepen uit de voedingstestplaten en breng ze over naar de deksels van de platen met wat water. Spoel de larven om voedselresten van hun lichaam te verwijderen, zorg ervoor dat er geen verwondingen ontstaan.
Breng de larven over naar de voorbereide microbuisjes en lyseer ze met een weefsel lyser om de voedselkeurmiddelen uit de darmen te extraheren. Breng de extracten over naar schone microbuisjes van 1,5 milliliter door de twee milliliter microbuisjes direct om te keren op de nieuwe buisjes. Doe dit voorzichtig zodat de meeste glazen kralen op de bodem van de twee milliliter buis blijven.
Verwijder de cellulaire deeltjes door de extracten te centrifugeren met een maximale snelheid en vier graden Celsius gedurende 10 minuten, en breng vervolgens de supernatanten over naar schone buisjes van 1,5 milliliter. Om calorimetrische kwantificering van voedselinname uit te voeren, bereid standaardoplossingen van blauwe kleurstof door deze serieel te verdunnen van een naar twee in methanol. Breng 100 microliters van de experimentele monsters, standaarden en blanco over naar de putjes van een 96-putjes microplaat en meet de absorptie bij 600 nanometer.
Dit protocol werd gebruikt om de relatieve hoeveelheden macronutriënten die worden geconsumeerd voor dieren onder thermogenetische activering van specifieke neuronale populaties in het larvale zenuwstelsel te kwantificeren. Het activeren van verschillende populaties van neuronen had een significant effect op de balans van macronutriënten bij larven in het derde stadium. Het voedingspatroon dat werd waargenomen voor de controlelijn, hier aangegeven in grijze kleur, vertoont een verwachte afname van voedselinname bij hogere eiwit-koolhydraatverhoudingen, wat de effectiviteit van de methode aantoont.
De vijf fenotypische klassen die voor de experimentele dieren zijn vastgesteld, zijn veel eten en compensatie voor eiwitverdunning door overeten, veel eten, maar niet compenseren, weinig eten, maar compenseren, weinig eten en niet compenseren, en abnormaal eten. Voor elk van deze fenotypische klassen en genotypen worden de GFP-patronen in de centrale zenuwstelsels van larven in het derde stadium getoond. Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om ontwikkelingssynchrone vroege larven in het derde stadium te genereren om de variatie die geassocieerd is met diergedrag te minimaliseren.
Volgens dit protocol zou radiolabeling van de voedingsmiddelen de bevestiging en verdere ontleding mogelijk maken van de resultaten die zijn gevonden met deze methoden.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een protocol voor de colorimetrische kwantificering van de voedselinname bij Drosophila melanogaster-larven die zijn blootgesteld aan diverse macronutriëntdieëten. Het onderzoek richt zich op het identificeren van neuronale populaties in larven die betrokken zijn bij nutritionele keuze en de controle van de voedselinname bij verschillende eiwit- en koolhydraatverhoudingen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Gedragsbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Larven van Drosophila melanogaster dienen als model voor het bestuderen van nutritionele gedragingen.
- De impact van de kwaliteit van macronutriënten in het dieet op voedingspatronen is cruciaal voor het begrijpen van metabole keuzes.
- Het protocol maakt high-throughput screening van de voedselopname over verschillende genotypen mogelijk.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het kwantificeren van de voedselinname in de larvale stadia van Drosophila.
- Het begrijpen van de neuronale mechanismen die ten grondslag liggen aan nutritionele besluitvorming.
- Het onderzoeken van de effecten van verschillende eiwit- en koolhydraatverhoudingen op het voedingsgedrag.
Gebruikte methoden
- Het protocol maakt gebruik van gedragsassays om de voedingsactiviteit in larven in het derde stadium te kwantificeren.
- Drosophila-larven worden blootgesteld aan verschillende diëten terwijl neuronale populaties thermogenetisch worden geactiveerd.
- De beoordeling omvat het toedienen van een hitte-shock aan de larven, gevolgd door een colorimetrische meting van de voedingskleurstof die uit hun dieet is opgenomen.
- Een zorgvuldige synchronisatie van de larvale ontwikkeling is essentieel voor consistente gedragsresultaten.
- Standaardcurves voor kwantificatie worden vastgesteld met behulp van seriële verdunningen van kleurstofoplossingen.
Belangrijkste resultaten
- Onderscheidende neuronale activaties beïnvloeden de balans van macronutriënten in voedingspatronen significant.
- Er werden vijf fenotypische klassen van voedingsgedrag geïdentificeerd op basis van inname-responsen op veranderingen in het dieet.
- De methode bleek effectief voor de kwantificering van de relatie tussen dieetsamenstelling en voedselinname.
Conclusies
- Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de rol van specifieke neuronale populaties bij de voedingskeuzes van larven te onderzoeken.
- Een nauwkeurige meting van de voedselinname en gedragsfenotypes vergroot het inzicht in metabole besluitvorming.
- De bevindingen dragen bij aan de kennis over de nutritionele fysiologie en de neuronale basis hiervan.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Dit protocol maakt high-throughput kwantificatie van de inname van macronutriënten mogelijk in een genetisch hanteerbaar model, wat targetvalidatie in onderzoek naar metabolisme en voedingsgedrag ondersteunt. Door specifieke neuronale populaties te koppelen aan fenotypes van dieetkeuze, biedt het mechanische risicoreductie voor vroege ontdekkingsprogramma's die gericht zijn op obesitas, diabetes en nutriënt-sensingspaden. De kwantitatieve, op kleurstof gebaseerde uitlezing biedt voorspellende betrouwbaarheid in screeningworkflows waarbij nutritionele homeostase een belangrijke biomarker is.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door larvale neuronale populaties te identificeren die de inname van eiwitten en koolhydraten reguleren onder gecontroleerde dieetomstandigheden.
- Operationele waarde: Maakt functionele targetvalidatie mogelijk via thermogenetische activatiescreens die genotype koppelen aan fenotypes van voedingsgedrag.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfoliotriage door genotypen in fenotypische klassen in te delen op basis van patronen in macronutriëntencompensatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream screening door de kwantificering van voedselinname over genotypen en dieetcondities te standaardiseren.
- Operationele waarde: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten via colorimetrische meting van kleurstofopname, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen of genetische perturbaties mogelijk maakt.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform door eenvoudige stappen voor het verzamelen, voeden en extraheren van larven, compatibel met 96-wellsplaatformaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt neurale hits uit de ontdekkingsfase met preklinische validatie door ziekterelevante voedingsfenotypes vast te stellen in een geconserveerd modelsysteem.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers via kwantificeerbare metrieken voor de inname van macronutriënten die de nutritionele homeostase weerspiegelen.
- Risicogestuurde voortgang: Maakt go/no-go-beslissingen mogelijk op basis van de vraag of genetische perturbaties voedingsonbalansen normaliseren of verergeren over verschillende eiwit-koolhydraatverhoudingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het vroege stadium van het ontdekkingsproces en ondersteunt het toetsen van hypothesen bij het ontrafelen van neuronale mechanismen, alvorens over te gaan naar lead-identificatie en preklinische validatie in modellen voor metabole ziekten.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing door het effect van specifieke neuronale activaties op de macronutriëntenbalans in het voedingsgedrag van larven te isoleren.
- Screening: Garandeert de gereedheid van de assay via gestandaardiseerde larvale synchronisatie, blootstelling aan het dieet en kleurstofgebaseerde kwantificering, wat vergelijkbare gegevens over verschillende condities oplevert.
- Analytiek: Genereert kwantitatieve metingen van de afhankelijke variabele (voedselinname via absorptie bij 600 nm) die vergelijking van condities en statistische evaluatie van genotype-effecten mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Bevordert de preklinische continuïteit door neuronale regulatoren van dieetkeuze te identificeren die kunnen bijdragen aan de selectie van targets in zoogdiermodellen voor metabole stoornissen.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Fungeert als een herbruikbare screeningcapaciteit voor metabole en gedragsfenotypes vanwege de eenvoud, de lage kosten en de compatibiliteit met genetische bibliotheken.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelwitvalidatie door mechanische ambiguïteit in nutriëntensensingspaden te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid en standaardisatie door gecontroleerde larvale stadia, dieetsamenstelling en getimede voedingsassays.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door vroegtijdige bewijzen van on-target metabole effecten te leveren, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten mogelijk op basis van hun vermogen om een gebalanceerde macronutriënteninname te herstellen bij verstoorde voedingsfenotypen.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in Drosophila-genetica, larvale stadiëring en thermogenetische technieken.
- Afhankelijk van incubatieapparatuur, waterbaden voor hitte-shock en microplate-readers voor absorptiemetingen.
- Vereist standaardisatie tussen teams van de larvale dichtheid, diëtbemerkingen en de timing van de assay om variabiliteit te minimaliseren.
- Aanpassing aan andere modelsystemen zou modificatie van de dieetsamenstelling, kleurstofcompatibiliteit en methoden voor larvaal herstel vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van behendige hantering van larven en de aanname dat kleurstofopname lineair correleert met de voedselopname.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:32
Preparation of Third-instar Larvae (L3)
2:24
Thermogenetic Activation and No-choice Feeding Assay
3:35
Food Dye Extraction and Colorimetric Quantification of Food Consumption
5:37
Results: Amount of Food Eaten per Larva under Neuronal Thermogenetic-activation Conditions in Three Macronutrient Balancing Diets
6:49
Conclusion
