Kwantificering van de inname van macronutriënten in een thermogenetisch neuronaal scherm met drosophilalarven
June 11th, 2020
Hier wordt een protocol beschreven dat de colorimetrische kwantificering mogelijk maakt van de hoeveelheid voedsel die binnen een bepaald tijdsinterval wordt gegeten door Drosophila melanogasterlarven die worden blootgesteld aan diëten van verschillende macronutriëntenkwaliteit. Deze assays worden uitgevoerd in de context van een neuronaal thermogenetisch scherm.
Ons protocol maakt identificatie mogelijk van larvale neuronale populaties die voedingskeuzes coderen die gerelateerd zijn aan de controle van de innameniveaus van twee belangrijke macronutriënten, eiwitten en koolhydraten. De eenvoud en relatief hoge doorvoer van onze methode maakt de kwantificering van voedselinname mogelijk voor verschillende genotypen die zijn blootgesteld aan verschillende voedingsomstandigheden. Om de ouderlijke lijnen genetisch te kruisen, zet 60 millimeter embryo-verzamelkooien op met L3-kweekplaten die zijn aangevuld met wat actieve gistpasta.
Breng de volwassen TripA1 vrouwelijke maagden en Janelia GAL4 mannetjes van vijf tot acht dagen oud over naar de embryo-verzamelkooien en laat het paringsproces 24 tot 48 uur plaatsvinden bij 25 graden Celsius met 60% vochtigheid en een 12, 12 licht donker cyclus. Na de paringsperiode, breng de gepaarde volwassen vliegen over naar nieuwe L3-kweekplaten en laat het leggen van eieren gedurende drie tot vier uur bij 25 graden Celsius plaatsvinden. Zorg ervoor dat alle platen zijn gelabeld met het genotype en de datum van het leggen van eieren.
Wanneer de eierleggende periode is afgelopen, verwijder de platen uit de kooien en schat het aantal eieren per plaat door het aantal embryo's in een kwart van de plaat te tellen. Houd de larvale dichtheid tot maximaal 200 embryo's per plaat en dek de platen af met plastic deksels. Incubeer de L3-kweekplaten gedurende negen dagen bij 18 graden Celsius, 60% vochtigheid en een 12, 12 licht donker cyclus.
Na de incubatie, verzamel drie groepen van 10 L3 van elk van de te testen genotypen, evenals een groep van 10 L3 voor de nul kleurstof voedselcontrole. Gebruik nummer vijf of lichtgewicht pincetten om de larveverzameling zo voorzichtig mogelijk uit te voeren. Breng de verzamelde larven over naar plastic gewichtsschalen met één milliliter water.
Stel een incubator van 30 graden Celsius in en houd de luchtvochtigheid hoog door een lade gevuld met water toe te voegen om uitdroging van de larven tijdens de test te voorkomen. Breng de temperatuur van de testplaten in evenwicht door ze op te warmen tot 30 graden Celsius voordat u begint. Zorg ervoor dat alle platen zijn gelabeld met het genotype en de eiwit-koolhydraatverhouding van het dieet.
Verwarm de experimentele larven gedurende twee minuten door de plastic schalen met de dieren direct over te brengen naar een waterbad van 37 graden Celsius. Stel het vereiste aantal timers in voor één uur, giet vervolgens voorzichtig het water uit de plastic schalen en breng de L3-groepen over van de schalen naar het midden van de testplaten. Dek de platen af en start de timer.
Laat de larven gedurende één uur bij 30 graden Celsius in het donker voeden. Stop de voedingstest door de platen over te brengen naar een ijsbad. Bereid voor elke geteste L3-groep twee microbuisjes van een milliliter voor met voldoende 0,5 millimeter glazen kralen om de onderkant van het microbuisje te vullen en 300 microliters ijskoud methanol.
Gebruik een koeltafel om de microbuisjes koud te houden. Haal voorzichtig de L3-groepen uit de voedingstestplaten en breng ze over naar de deksels van de platen met wat water. Spoel de larven om voedselresten van hun lichaam te verwijderen, zorg ervoor dat er geen verwondingen ontstaan.
Breng de larven over naar de voorbereide microbuisjes en lyseer ze met een weefsel lyser om de voedselkeurmiddelen uit de darmen te extraheren. Breng de extracten over naar schone microbuisjes van 1,5 milliliter door de twee milliliter microbuisjes direct om te keren op de nieuwe buisjes. Doe dit voorzichtig zodat de meeste glazen kralen op de bodem van de twee milliliter buis blijven.
Verwijder de cellulaire deeltjes door de extracten te centrifugeren met een maximale snelheid en vier graden Celsius gedurende 10 minuten, en breng vervolgens de supernatanten over naar schone buisjes van 1,5 milliliter. Om calorimetrische kwantificering van voedselinname uit te voeren, bereid standaardoplossingen van blauwe kleurstof door deze serieel te verdunnen van een naar twee in methanol. Breng 100 microliters van de experimentele monsters, standaarden en blanco over naar de putjes van een 96-putjes microplaat en meet de absorptie bij 600 nanometer.
Dit protocol werd gebruikt om de relatieve hoeveelheden macronutriënten die worden geconsumeerd voor dieren onder thermogenetische activering van specifieke neuronale populaties in het larvale zenuwstelsel te kwantificeren. Het activeren van verschillende populaties van neuronen had een significant effect op de balans van macronutriënten bij larven in het derde stadium. Het voedingspatroon dat werd waargenomen voor de controlelijn, hier aangegeven in grijze kleur, vertoont een verwachte afname van voedselinname bij hogere eiwit-koolhydraatverhoudingen, wat de effectiviteit van de methode aantoont.
De vijf fenotypische klassen die voor de experimentele dieren zijn vastgesteld, zijn veel eten en compensatie voor eiwitverdunning door overeten, veel eten, maar niet compenseren, weinig eten, maar compenseren, weinig eten en niet compenseren, en abnormaal eten. Voor elk van deze fenotypische klassen en genotypen worden de GFP-patronen in de centrale zenuwstelsels van larven in het derde stadium getoond. Bij het uitvoeren van dit protocol is het belangrijk om ontwikkelingssynchrone vroege larven in het derde stadium te genereren om de variatie die geassocieerd is met diergedrag te minimaliseren.
Volgens dit protocol zou radiolabeling van de voedingsmiddelen de bevestiging en verdere ontleding mogelijk maken van de resultaten die zijn gevonden met deze methoden.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie beschrijft een protocol voor colorimetrische kwantificering van voedselinname bij Drosophila melanogaster-larven die worden blootgesteld aan verschillende macronutriënten diëten. Het onderzoek richt zich op het identificeren van neuronale populaties bij larven die betrokken zijn bij voedingskeuze en voedselinnamecontrole in verschillende eiwit- en koolhydraatverhoudingen.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Gedragsbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Drosophila melanogaster-larven dienen als model voor het bestuderen van voedingsgedrag.
- De impact van de kwaliteit van macronutriënten in het dieet op voedingspatronen is cruciaal voor het begrijpen van metabole keuzes.
- Het protocol maakt high-throughput screening van voedselinname mogelijk tussen verschillende genotypen.
Doel van het Onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van voedselinname in larvale stadia van Drosophila.
- Om de neuronale mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan voedingskeuzes.
- Om de effecten van verschillende eiwit- en koolhydraatverhoudingen op voedingsgedrag te onderzoeken.
Gebruikte Methoden
- Het protocol gebruikt gedragsmetingen om voedingsactiviteit bij derde-instar larven te kwantificeren.
- Drosophila-larven worden blootgesteld aan verschillende diëten terwijl neuronale populaties thermogenetisch worden geactiveerd.
- De beoordeling omvat het hitteschokken van larven, gevolgd door colorimetrische meting van voedselkleurstof die is geabsorbeerd uit hun dieet.
- Zorgvuldige synchronisatie van larveontwikkeling is cruciaal voor consistente gedragsresultaten.
- Standaardcurves voor kwantificering worden vastgesteld met behulp van serieel verdunde kleurstofoplossingen.
Belangrijkste Resultaten
- Onderscheiden neuronale activeringen hebben een significante invloed op de macronutriëntenbalans in voedingspatronen.
- Vijf fenotypische klassen van voedingsgedrag werden geïdentificeerd op basis van innamereacties op dieetveranderingen.
- De methode toonde effectieve kwantificering van de relatie tussen dieetsamenstelling en voedselinname.
Conclusies
- Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de rol van specifieke neuronale populaties in voedingskeuzes van larven te onderzoeken.
- Duidelijke meting van voedselinname en gedragsfenotypes verbetert het begrip van metabole besluitvorming.
- De bevindingen dragen bij aan de kennis van voedingsfysiologie en de neuronale grondslagen daarvan.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables high-throughput quantification of macronutrient intake in a genetically tractable model, supporting target validation in metabolic and feeding behavior research. By linking specific neuronal populations to dietary choice phenotypes, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on obesity, diabetes, and nutrient-sensing pathways. The quantitative, dye-based readout offers predictive confidence in screening workflows where nutritional homeostasis is a key biomarker.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by identifying larval neuronal populations that regulate protein and carbohydrate intake under controlled dietary conditions.
- Operational Value: Enables functional target validation through thermogenetic activation screens that link genotype to feeding behavior phenotypes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by classifying genotypes into phenotypic classes based on macronutrient compensation patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by standardizing food intake quantification across genotypes and diet conditions.
- Operational Value: Delivers reproducible, quantitative outputs via colorimetric measurement of dye uptake, enabling reliable compound or genetic perturbation evaluation.
- Scalability: Supports platform reuse through simple larval collection, feeding, and extraction steps compatible with 96-well plate formats.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase neuronal hits to preclinical validation by establishing disease-relevant feeding phenotypes in a conserved model system.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development through quantifiable macronutrient intake metrics that reflect nutritional homeostasis.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on whether genetic perturbations normalize or exacerbate feeding imbalances across protein-to-carbohydrate ratios.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in neuronal mechanism elucidation before progressing to lead identification and preclinical validation in metabolic disease models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating the effect of specific neuronal activations on macronutrient balancing in larval feeding behavior.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized larval synchronization, diet exposure, and dye-based quantification that yields comparable data across conditions.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements (food intake via absorbance at 600 nm) that allow comparison of conditions and statistical evaluation of genotype effects.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by identifying neuronal regulators of dietary choice that may inform target selection in mammalian models of metabolic disorder.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable screening capability for metabolic and behavioral phenotypes due to its simplicity, low cost, and compatibility with genetic libraries.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in nutrient-sensing pathways.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled larval staging, diet composition, and timed feeding assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early evidence of on-target metabolic effects, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their ability to restore balanced macronutrient intake in perturbed feeding phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, larval staging, and thermogenetic techniques.
- Dependent on incubation equipment, water baths for heat shock, and microplate readers for absorbance measurement.
- Necessitates cross-team standardization of larval density, diet labeling, and assay timing to minimize variability.
- Adaptation to other model systems would require modification of diet composition, dye compatibility, and larval recovery methods.
- Practical limitations include the need for dexterous larval handling and the assumption that dye uptake linearly correlates with food intake.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:32
Preparation of Third-instar Larvae (L3)
2:24
Thermogenetic Activation and No-choice Feeding Assay
3:35
Food Dye Extraction and Colorimetric Quantification of Food Consumption
5:37
Results: Amount of Food Eaten per Larva under Neuronal Thermogenetic-activation Conditions in Three Macronutrient Balancing Diets
6:49
Conclusion
