Proteolytisch afgebroken alginaat hydrogels en hydrofobe microbioreactoren voor porcine Oocyte Inkapseling

Dit protocol voor de inkapseling van varkensocyten maakt het mogelijk om de bolvormige organisatie van COC's te handhaven. Dit voorkomt dat de afvlakking en de daaruit voortvloeiende verstoring van de kloof tussen de eicellen en de omliggende folliculaire cellen. De belangrijkste voordelen van de twee beschreven protocollen zijn die gebruiksvriendelijk zijn en zorgen voor effectieve controle van zowel de eicel en chemocel overleving.

Beide cultuursystemen zijn waardevolle hulpmiddelen voor basisonderzoek in reproductieve biologie, en kunnen klinische relevantie voor betere onvruchtbaarheidsbehandeling hebben. Ze kunnen ook worden toegepast voor de ontwikkeling van nieuwe biotechnologiemethoden en voor de verbetering van de veestapel. Na het spoelen van de eierstokken, breng ze naar een beker gevuld met HM medium en bewaar ze in een incubator op 38 graden Celsius tijdens alle latere manipulaties.

Aspirate de folliculaire vloeistof uit grote varkenszakjes en centrifugeren op 100 keer G gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens filtert u de supernatant met behulp van een steriele spuit die is bevestigd aan een 0,2-micrometer membraanfilter en vries het in bij negatieve 80 graden Celsius. Om de COC's te isoleren van middelgrote follikels, breng twee tot drie eierstokken over naar een steriele petrischaal van 10 centimeter gevuld met HM. Snijd voorzichtig het oppervlak van de uitstekende eierstokzakjes met een steriel chirurgisch nummer 15-blad, waardoor de folliculaire vloeistof en de COC's in de petrischaal stromen.

Aspirate de folliculaire inhoud met een 28-meter naald bevestigd aan een wegwerpspuit, en breng het in een andere petrischaal. Om de IVF Petri gerechten te bereiden, voeg een milliliter HM aan de centrale putten, en plaats drie tot vier druppels HM in de buitenste ringen. Gebruik vervolgens een polycarbonaatmicropipet om de onbeschadigde COC's naar druppels HM in de buitenste ringen te verplaatsen en ze kort drie tot vier keer te spoelen.

Wanneer u klaar bent, individueel overbrengen ze in de centrale put. Bewaar de IVF-platen in de couveuse. Bereid trombin en fibrinogen oplossingen zoals beschreven in de tekst manuscript.

Ontdooi op de dag van de procedure de fibrinogen-oplossing langzaam op ijs en breng deze vlak voor gebruik op kamertemperatuur. Meng 0,5% alginaatoplossing en de fibrinogen-oplossing met een één-op-één verhouding voor een eindvolume van twee milliliters en voorzichtig draaikolf het mengsel. Repareer incubatiekamers door dunne stroken paraffinefilm aan te brengen op glazen microscoopdia's.

Pipette 7,5 microliter druppels van het FA-mengsel op de met paraffine gecoate glazen schuif met scheidingsruimters, waarbij acht tot tien druppels in twee rijen worden geplaatst. Gebruik een micropipet om drie tot vijf COC's over te brengen naar het midden van de FA-drop, samen met een minimum volume rijpingsmedium. Voeg 7,5 microliter tromber van trombine oplossing op de top van elke FA druppel om het te dekken.

Het is niet nodig om ze te mengen, omdat de gel zich bijna onmiddellijk vormt. Bedek de incubatiekamer met een eerder voorbereide glazen schuif, draai de kamer ondersteboven en plaats deze in een petrischaal van 100 millimeter bekleed met vochtig filterpapier. Zet de petrischaal in de 5%kooldioxide op 38 graden Celsius incubator voor vijf tot zeven minuten.

Breng na incubatie elke FA-capsule over in een put van een 96-putplaat met 100 microliter rijpingsmedium. Om de twee dagen vervangt u de helft van het medium door vers voorvervoeende rijpingsmedium. Beeld COC maakt gebruik van een omgekeerde lichtmicroscoop bij 10x vergroting.

Na het kweken van de COC's gedurende vier dagen, verwijder het rijpingsmedium uit de putten en voeg 100 microliter van 10 internationale eenheden per milliliter algenaat lysaat in DMEM. Laat de kweekplaat 25 tot 30 minuten in de couveuse staan. Verwijder de COC's uit de opgeloste capsules.

Was ze in DMEM meerdere malen, dan breng ze naar de binnenste ring van een IVF-schotel met PBS. Maak een bed van vijf gram FEP poeder in een 30 millimeter petrischaal. Verdeel een enkele druppel rijping medium met drie tot vijf COC's op de FEP poeder.

Draai de plaat voorzichtig in een cirkelvormige beweging om ervoor te zorgen dat de deeltjes het oppervlak van de vloeibare druppel volledig bedekken en vloeibare knikkers vormen, of LMs. Bereid meerdere 60 millimeter IVF Petri gerechten en voeg drie tot vier milliliter steriel water toe aan de buitenste ringen om een vochtigheidskamer te creëren. Pak de gevormde LM op met een 1000 microliter pipet en plaats deze in de centrale put.

Incubeer de knikkers voor vier dagen op 38 graden Celsius in een vijf procent kooldioxide incubator. Om het medium te veranderen, breng 30 microliter rijping medium op elke LM, waardoor het zal leiden tot verspreiding. Wanneer de marmeren inhoud oplost, breng de COC's vrij uit de bioreactor naar een druppel vers rijping medium in de petrischaal.

Na drie tot vier wasbeurten in rijping medium, breng de COC's, samen met 30 microliters van vers medium, op het FEP-poederbed. Draai de plaat voorzichtig in een cirkelvormige beweging om ervoor te zorgen dat de poederdeeltjes het oppervlak van de vloeibare druppel volledig bedekken en een nieuwe LM vormen.Breng vervolgens de LM over op de IVF Petrischaal. Beide in vitro rijpingssystemen produceerden COC's met granulosiscellen die strak aan elkaar werden gehecht en intacte lagen cumuluscellen.

De levensvatbaarheidsanalyse van het COC bevestigde dat in beide inkapselingssystemen optimale groeiomstandigheden werden bereikt. In beide groepen werden alleen sites met een hoge levensvatbaarheid van eicellen waargenomen. De eicellen werden afgebeeld met transmissie elektronenmicroscopie.

De mitochondriën waren gelijkmatig verdeeld en hadden een shell-achtige vorm. Slechts een paar van hen waren langwerpig en hun clustering werd sporadisch waargenomen. Endoplasmatisch reticulum werd ofwel geassocieerd met mitochondriën of vrij in het eicelcytoplasma.

Vloeibare druppels verschenen als kleine, donkere, ronde structuren, en Golgi apparaten werden ontstaan met verwijde stortbak. Het is belangrijk om nauwkeurig en voorzichtig te zijn bij het overbrengen van FA-capsules van incubatiekamer naar kweekplaten en bij het oppakken en overbrengen van formaat LM in de IVF Petri schotel.