Een model van epileptogenese in rhinale cortex-hippocampus organotypische plakculturen

Epilepsie is een veel voorkomende neurologische ziekte. Rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes verbeelden evoluerende epileptische gebeurtenissen die lijken op in vivo epilepsie en kunnen daarom worden gebruikt als een ex vivo model van epileptogenese. Dit systeem is inderdaad een uitstekend hulpmiddel voor het monitoren van de dynamiek en progressie van epileptogenese, evenals voor het screenen van potentiële therapeutische doelen voor deze hersenpathologie.

Mijn studenten Francisco Meda en Mafalda Carvalho demonstreren de procedures met mij. Om de hersenen te oogsten van een postnatale dag zes tot zeven Sprague-Dawley pup, was eerst het hoofd drie keer in vijf milliliter GBSS. Werk in een bioveiligheidskast, steek stevig scherpe tang in de oogkassen om het hoofd op zijn plaats te houden en gebruik een dunne puntschaar om de hoofdhuid langs de middellijn van de wervel foramen naar de frontale kwabben te snijden.

Snijd de schedel op dezelfde manier en langs de cerebrale transversale spleet en gebruik gebogen lange tang om de schedelstukken uit elkaar te bewegen. Gebruik een spatel om de olfactorische bollen weg te gooien en om de dorsale kant van de hersenen over te brengen in een plaat van 60 millimeter met vijf milliliter koude GBSS. Steek fijne tangen in het cerebellum en steek de spatel langs de middellijn om de hemisfeer voorzichtig te openen.

Gebruik korte gebogen tangen om voorzichtig het overtollige weefsel te verwijderen dat de hippocampus bedekt zonder de hippocampale structuur aan te raken en snijd vervolgens onder elke hippocampus. Breng één hemisfeer tegelijk hippocampuszijde omhoog en parallel aan elkaar over op een stuk filterpapier. Plaats het filterpapier op een weefselhelikopter met de hemisferen loodrecht op het mes en snijd de hemisferen in plakjes van 350 micron.

Breng het gesneden weefsel over in een nieuwe Petrischaal met vijf milliliter koude GBSS en gebruik ronde tipelektroden om de plakjes zorgvuldig te scheiden, waarbij alleen de monsters met een structureel intacte rhinale cortex en hippocampus worden behouden. De DG- en CA-gebieden moeten perfect worden gedefinieerd, evenals de entorhinale en perirhinale cortexregio's. Gebruik een spatel en een ronde tipelektrode om maximaal vier intacte plakjes op afzonderlijke inzetstukken te plaatsen in het juiste aantal putten van een plaat met zes putten met 1,1 milliliter kweekmedium per put.

Gebruik een P20 pipet om overtollig dissectiemedium uit elk segment te verwijderen. Plaats de plaat in de celkweek-incubator. Verander het medium om de twee tot drie dagen.

Gebruik een tang om het inzetstuk op te tillen. Aspireer het medium uit de overeenkomstige put en plaats het inzetstuk terug op zijn plaats. Gebruik een P1000 pipet om een milliliter vers medium van 37 graden Celsius aan elke put toe te voegen.

Bereid de elektrofysiologie-opstelling voor in een gesloten circuit. Controleer of het debiet van de kamer van het interfacetype is ingesteld op twee milliliter per minuut en open de carb-ox klep. Controleer het waterniveau in het systeem en plaats een stuk filterpapier in de interface-opnamekamer om overtollig medium af te tappen.

Plaats een stuk lensreinigingspapier onder het frame om medium naar het segment te leveren en schakel de temperatuurregelaar, versterkers en micromanipulatoren in. Gebruik een spuit om een glaselektrode te laden met vers bereide kunstmatige cerebrospinale vloeistof. Plaats de glaselektrode in de ontvangende elektrode en wacht tot de temperatuur in de interfacekamer stabiliseert bij 37 graden Celsius.

Werk in een bioveiligheidskast en plaats het inzetstuk in een plaat van 60 millimeter met een druppel medium. Gebruik een scherp mes om een plak uit het inzetstuk te snijden en plaats het segment in de interfacekamer met de hippocampus rechtsonder, plaats vervolgens de ontvangende elektrode in de CA3-piramidevormige cellaag, start het continue acquisitieprotocol en noteer het segment gedurende 30 minuten. Om de propidiumjodide opnametest uit te voeren, werkt u in een bioveiligheidskast.

Til het inzetstuk uit de put en voeg propidiumjodide in medium toe tot een eindconcentratie van twee micromolaren per put. Roer de plaat langzaam voordat u het inzetstuk terug in de put plaatst, waarbij u erop moet zorgen dat er geen bubbels onder de plakjes zitten. Wanneer alle plakjes zijn behandeld, breng je de plaat terug naar de celkweek-incubator.

Voor het immunostaineren van de plakjes, aan het einde van de propidiumjodide incubatie, aspireren het medium van de bodem van elke put en voeg een milliliter van 4% paraformaldehyde toe aan de boven- en onderkant van elke insert. Was de plakjes na een uur op kamertemperatuur twee keer gedurende 10 minuten en één milliliter PBS per wasbeurt en gebruik een hydrofobe pen om twee rechthoeken op microscoopglijbanen te tekenen. Gebruik een scherp mes om de segmenten uit de inzetstukken te snijden en plaats één segment in elke rechthoek.

Voeg permeabilisatieblokkadeoplossing toe aan elk plakje voor een incubatietijd van drie uur bij kamertemperatuur. Voeg aan het einde van de incubatie de primaire antilichamen van belang toe aan elk segment voor een incubatie van vier graden Celsius 's nachts. Was de volgende ochtend de plakjes drie keer met PBS-Tween gedurende 10 minuten per wasbeurt en incubeer de plakjes met de juiste secundaire antilichamen gedurende vier uur bij kamertemperatuur.

Was daarna de plakjes zoals aangetoond en voeg 50 microliter Hoechst-oplossing toe aan elke plak voor een incubatietijd van 20 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatie van Hoechst, was de plakjes opnieuw en voeg 50 microliter montagemedium toe aan elk, plaats vervolgens een coverslip over de plakjes en sluit af met nagellak. Nadat u de dia's 24 uur bij kamertemperatuur hebt laten drogen, visualiseert u de opname van immunostaining en propidiumjodide door confocale microscopie.

Rhinale cortex-hippocampus organotypische plakjes verbeelden gemengde interictale en ictal-achtige activiteit op zeven dagen in vitro. Na 14 dagen in vitro wordt spontane activiteit gekenmerkt door ictale ontladingen, die evolueren naar een overweldigende ictale activiteit na 21 dagen in vitro met ictale gebeurtenissen die langer dan één minuut duren. Propidiumjodide opname en immunohistochistry tegen de neuronale marker NeuN onthulde enige neuronale dood in zeven dagen in vitro plakjes die aanzienlijk is verhoogd na 14 dagen in vitro in alle gebieden van de hippocampus.

Na zeven dagen in vitro zijn geramde microglia met een lage CD68-expressie overvloediger dan Iba1-positieve CD68-positieve reactieve microglia. Terwijl Iba1 positieve CD68 positieve amoebe M1 microglia in vitro, in alle gebieden van de hippocampus, microglia overschrijdt met een lage CD68 expressie. Na 14 dagen in vitro kunnen sommige Iba1-positieve CD68-positieve cellen met een hypervertakkingsverschijning worden vastgesteld, wat de mogelijkheid van een M2-ontstekingsremmend microgliafenotype suggereert.

Na zeven dagen in vitro is de expressie van CD3 nauwelijks detecteerbaar, terwijl in 14 dagen in vitro slices hypertrofische gliazuurhoudende eiwitpositieve CD3-positieve astrocyten kunnen worden waargenomen, wat wijst op een progressieve activering van A1-astrocyten. Bereid rhinale cortex-hippocampus plakjes met uiterste zorg. Zorg ervoor dat u het overtollige weefsel boven de hippocampus verwijdert, omdat dit de integriteit van de plak tijdens het snijden in gevaar kan brengen.

Het structurele tekort zal een negatieve invloed hebben op de levensvatbaarheid van de segmenten. Naast de aangetoonde benaderingen kan een overvloed aan testen zoals westerse vlekanalyse, real-time PCR en ELISA op dit systeem worden toegepast om specifieke vragen met betrekking tot epileptogenese aan te pakken.