Karakterisering van intrakraakbeen transport eigenschappen van Cationic Peptide Carriers

Het karakteriseren van de transporteigenschappen van therapieën en hun dragers is van cruciaal belang voor het waarborgen van effectieve biologische reacties. Deze methoden helpen bij het ontwerpen van optimaal geladen geneesmiddelendragers voor het richten van negatief geladen weefsels. Het belangrijkste voordeel van deze technieken is hun vermogen om in vivo therapeutische werkzaamheid beter te voorspellen door middel van een reeks in vitro experimenten die solute transport door weefsel karakteriseren.

Kraakbeenziekten, zoals artrose, blijven onbehandeld als gevolg van het onvermogen van geneesmiddelen om de dichte avasculaire kraakbeen matrix, die geneesmiddelendragers proloog therapeutische werkzaamheid proloog. Begin met het gebruik van een delicate taak af te vegen om voorzichtig te verwijderen overtollige PBS van de oppervlakken van drie millimeter diameter, een millimeter dik kraakbeen explants. Gebruik een balans om snel het natte gewicht van elke explant vast te leggen en plaats onmiddellijk de explants in een PBS-bad om uitdroging te voorkomen.

Voeg vervolgens 300 microliters vers bereide, 30 micromolar fluorescerend gelabelde kationische peptide carrier oplossing per put toe aan de binnenste putten van een 96-put plaat en gebruik een spatel om een explant toe te voegen aan elke bron van oplossing. Vul elk van de omliggende putten met 300 microliter PBS en bedek de plaat met een deksel. Verzegel de randen van de plaat met flexibele folie om verdamping te minimaliseren en plaats de plaat op een shaker in een 37 graden Celsius incubator gedurende 24 uur bij 50 omwentelingen per minuut, met een 15 millimeter baan.

Breng aan het einde van de incubatie het evenwichtsbad van elke put over naar afzonderlijke polypropyleenbuizen en maak seriële verdunningen uit de voorraad 30 micromolar cationic peptide carrier oplossing om een standaardcurve te genereren. Breng vervolgens 200 microliter van elke oplossing en standaard over in individuele putten van een zwarte 96-putplaat en verkrijg fluorescentiemetingen van elk monster en standaard op basis van de excitatie- en emissiegolflengten van het fluorescerende label. Om de diepte van kationische peptide drager penetratie in een kraakbeen explant te bepalen, gebruik een scalpel te snijden zes millimeter diameter, een millimeter dik kraakbeen explants in de helft en hydrateren de resulterende half-disc stukken met proteus remmer aangevuld PBS.

Breng epoxy aan op het midden van een put van een op maat ontworpen eendimensionale transportkamer en beveilig een halfschijf explant binnen de put met de oppervlakkige kant van de explant naar de stroomopwaartse kant van de kamer. Verwijder overtollige lijm uit de put om contact met het diffusieoppervlak van het kraakbeen te voorkomen en voeg 80 microliter proteaseremmer aan beide zijden van de explant toe. Pipette de vloeistof op en neer aan de ene kant van de explant om te controleren op lekkage aan de andere kant.

Als er geen lekkage aanwezig is, vervang dan de proteaseremmer aangevuld PBS van de upstream kant met 80 microliter van 30 micromolar fluorescentie gelabeld kationische peptide drager oplossing en zorgvuldig plaats de transportkamer in een cel cultuur schotel. Bedek de basis van de schotel met PBS om kationische peptide carrier oplossing verdamping te voorkomen. Zorg ervoor dat er geen direct contact is tussen de oplossingen van de upstream- en downstreamkamers.

Plaats de overdekte schotel op een shaker om deeltjessedimentatie gedurende vier of 24 uur te beperken bij kamertemperatuur en 50 omwentelingen per minuut, met een baan van 15 millimeter. Verwijder aan het einde van de incubatie de explants uit de kamer en snijd ongeveer 100 micron dikke plakjes uit het midden van elke explant. Plaats elk plakje explant tussen een glazen schuif en een afdekslip en hydrateer de plakjes met verse proteaseremmer aangevuld PBS.

Bevestig de dia op het podium van een confocale microscoop en verkrijg een Z-stack van fluorescerende beelden door de volledige dikte van het segment bij vergroting van 10x. Open het afbeeldingsbestand en afbeelding J, klik op Afbeelding en selecteer Stapels en Z-project in het vervolgkeuzemenu. Voer vervolgens de segmentnummers in van één naar het laatste segment en selecteer onder Projectietype de gemiddelde intensiteit en klik op Oke.

Om de niet-evenwichtsmiddel cationic peptide drager kraakbeen diffusie tarief te beoordelen, assembleren elke helft van de transportkamer, om een grote rubberen pakking, een polymethylmethacrylaat insert, en een kleine rubberen pakking. Meet de dikte van een kraakbeen explant, plaats dan de explant in de putten van de plastic insert met het oppervlakkige oppervlak tegenover de stroomopwaartse kamer en sandwich de twee helften samen om de montage te voltooien. Gebruik een moersleutel om de helften stevig aan elkaar te schroeven voordat u de upstreamkamer vult met twee milliliter proteaseremmer aangevuld PBS.

Controleer de stroomafwaartse kamer op lekkage uit de stroomopwaartse kamer. Als er geen lekkage wordt gedetecteerd, vul de downstream kamer met twee milliliter proteaseremmer aangevuld PBS. Voeg een enkele mini roerbalk toe aan zowel de boven- als de stroomafwaartse kamers en plaats de kamer op een roerplaat met de kamer zodanig uitgelijnd dat de laser van de spectrofotometer is gericht op het midden van de stroomafwaartse kamer.

Met het signaalontvangergedeelte van de spectrofotometer achter de stroomafwaartse kamer, verzamel je gedurende ten minste vijf minuten stabiele, realtime stroomafwaartse fluorescentie-emissiemetingen. Na het verkrijgen van een stabiele meting, voeg een vooraf berekend volume van fluorescerend gelabeld cationic peptide carrier stock oplossing aan de upstream kamer aan een uiteindelijke badconcentratie van drie micromolar, en controleer de downstream tl-signaal, terwijl het mogelijk maken van de solute transport tot een gestage toename van de helling te bereiken. Zodra een stabiele toestand is bereikt, breng 20 microliter oplossing van de upstream kamer naar de downstream kamer voor een spike test en het verzamelen van de real-time downstream fluorescentie lezingen.

Een te hoge heffing beperkt de oplospending tot de oppervlakkige zone omdat de drager te sterk bindt aan de negatief geladen aggrecan-groepen van de kraakbeenmatrix. Omgekeerd dringen dragers die in staat zijn om te profiteren van zwakke en omkeerbare ladingsinteracties door de diepe zone van weefsel. Een optimaal geladen drug drager, echter, zou niet alleen doordringen in de diepe zones van weefsel, maar zou ook aantonen een hoge intra-weefsel opname, die kan worden bepaald met behulp van de fluorescentie metingen van het evenwicht bad en weefsel nat gewicht, zoals aangetoond.

Niet-evenwichtsdiffusietransportexperimenten resulteren in een gegevensgegenereerde curve met een geleidelijk toenemende helling. Het eerste deel van de curve vertegenwoordigt oplossing door het kraakbeen als oplosmiddel matrix bindende interacties optreden. Zodra de oplosbare kamer bereikt, neemt de helling van de curve toe naarmate de fluorescentiewaarden in de loop van de tijd toenemen.

Dit tweede deel van de curve bereikt dan een gestage helling, wat de verspreiding van de steady state vertegenwoordigt. De X-intercept van een tangentiale lijn getrokken op de steady state gedeelte van de curve geeft de tijd die nodig is om steady state diffusie of tau lag te bereiken. Na de overdracht van de oplossing van de stroomopwaartse naar de stroomafwaartse kamer wordt een piek in fluorescentie waargenomen, waarna de gestabiliseerde fluorescentieintensiteit kan worden gebruikt om de fluorescentie te correleren met de concentratie.

De representatieve effectieve diffusiviteit en steady state diffusie waarden kunnen vervolgens worden berekend, zoals aangegeven. Merk op dat de steady state diffusiviteit is twee ordes van grootte hoger dan de effectieve diffusiviteit als gevolg van alle van de lading op basis van bindende sites bezet. Dus, op dit punt, diffusie is gebaseerd op grootte en niet opladen, wat resulteert in vergelijkbare steady state diffusie waarden onder CPC's van dezelfde grootte.

Houd hydratatie uit en minimaliseer de verdamping van oplossingen tijdens het hele experiment om veranderingen in de kraakbeenmorfologie en de concentratie van de oplossing te voorkomen en om nauwkeurige en reproduceerbare gegevensverwerving te garanderen. Na het ontwerp van een optimaal geladen drugdrager, kunnen verschillende vervoegingstechnieken worden gebruikt om geneesmiddelen voor verbeterde weefseltargeting te wijzigen en om de evaluatie van hun biologische werkzaamheid te vergemakkelijken.