Name: Een bacteriële orale voedingstest met met antibiotica behandelde muggen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Leer een bacteriële orale voedingstest met antibiotica-behandelde muggen om de rol van darmbacteriën in gastheerfysiologie te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers bij vectorbeheersing.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497) en het Science and Technology Plan Project van de provincie Hunan (2019RS1036).

1. Midgut dissectie en cultivable bacteriën isolatie
<ol><li>Bereid de mug voor op dissectie.<ol>
<li>Verzamel de muggen 7-9 dagen na het ontstaan met een aspirator. Verdoven de verzamelde muggen door ze gedurende 3-5 min te onderwerpen aan een temperatuur van 4 °C en de muggen verdoofd te houden in een ijskoud petrischaaltje tot dissectie.</li>
	</ol></li>
	<li>Steriliseren laboratoriuminstrumenten en het muggenoppervlak.<ol>
<li>Steriliseren van het experiment bank, ontleden microscoop, tangen, en glas dia door het spuiten van 75% ethanol om besmetting door bacteriën uit het milieu te voorkomen.</li>
		<li>Bereid een steriele petrischaal met 75% ethanol en twee petrischaaltjes met steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS).</li>
		<li>Oppervlakte-steriliseren de mug door dompelen en schudden ze in 75% ethanol gedurende 3 min, en spoel twee keer met 1x PBS buffer in het geval de ethanol van invloed op de ontleed darmflora.</li>
	</ol></li>
	<li>Ontleden de mug midgut.<ol>
<li>Breng de oppervlakte-gesteriliseerde mug op de glazen glijbaan met een druppel steriele 1x PBS buffer. Ontleden onder de ontleden microscoop.</li>
		<li>Onder de onderste vergroting van de ontledenmicroscoop, verwijder voorzichtig de benen, vleugels en het hoofd van de mug om ontsnapping te voorkomen. Verwijder de laatste somiet van de mug door direct te snijden, in plaats van te trekken, om te voorkomen dat het spijsverteringskanaal breekt.</li>
		<li>Klem de thorax van de mug en het einde van de buik met tangen. Trek voorzichtig het spijsverteringskanaal van de mug eruit. Het verworven spijsverteringskanaal bevat meestal het gewas, voorgeletterd, midgut, achterdacht, en de Malpighian buizen.</li>
		<li>Pas de ontleedmicroscoop aan een hogere vergroting aan. Verwijder het gewas, de voorbestaande, de achterpoot en de Malpighische buizen uit het ontleede spijsverteringskanaal om de middenmoter van de mug te krijgen.</li>
		<li>Zorg tijdens het verwijderen van het gewas, als het gewas opblaast en lijkt op de midgut nadat de mug neemt een suikermeel. De Malpighian buizen, een groep lange en dunne uitscheidingsbuizen, bevinden zich op de grens tussen de midgut en de achtersted.</li>
	</ol></li>
	<li>Darmbacteriën isoleren.<ol>
<li>Breng de ontleede midgut over op een steriele 1,5 mL buis met 200 μL steriele 1x PBS buffer.</li>
		<li>Maal de midgut op een steriele bank grondig met een steriele stamper om volledige release van darmbacteriën aan de buffer mogelijk te maken.</li>
		<li>Seriële verdunnen het homogenaat tot drie 10-voudige verdunningen. Voeg 50 μL van elke verdunning toe aan de LB (Luria bouillon) agarplaat en verdeel deze vervolgens op de plaat. Als de midgut een hoge concentratie darmflora bevat, is het essentieel om meer seriële verdunningen te maken om enkele kolonies uit te kiezen.</li>
		<li>Broed de plaat 1-2 dagen in op 37 °C totdat enkele kolonies zichtbaar zijn.</li>
	</ol></li>
	<li>Identificatie van soorten<ol>
<li>Kies enkele kolonies en inenting ze respectievelijk in een 150 mL conische kolf met 50 mL LB bouillon medium.</li>
		<li>Schud de bacteriën 's nachts op 37 °C.</li>
		<li>Haal totaal DNA uit door bacteriële genomic DNA extractiekit. Versterk 16S rDNA door polymerase kettingreactie (PCR). OPMERKING: Er zijn meerdere segmenten in 16S rDNA die behouden zijn gebleven. Op basis van deze geconserveerde regio's kunnen universele primers voor bacteriën worden ontworpen om 16S rDNA-fragmenten van alle bacteriën te versterken. Deze primers zijn specifiek voor bacteriën, en het verschil in het variabele gebied van 16S rDNA kan worden gebruikt om verschillende bacteriën te onderscheiden. Daarom wordt 16S rDNA veel gebruikt voor bacteriële identificatie.</li>
		<li>Herstel en zuiver DNA-fragmenten uit PCR-producten door agarose gel elektroforese en een commerciële gel recovery kit.</li>
		<li>Voer DNA-sequencing uit op de gezuiverde DNA-fragmenten om bacteriële gensequenties te verkrijgen.</li>
		<li>Vergelijk de 16S rRNA-gensequentie met de bacteriële sequentie die beschikbaar is in GenBank. Selecteer de database Bacteriën en Archaea. OPMERKING: Identificatie voor het soortenniveau werd gedefinieerd als ≥99% 16S rDNA-sequentiegelijke met de dichtstbijzijnde GenBank-vermelding. Het isolaat werd toegewezen aan het overeenkomstige geslacht toen de 16S rDNA-sequentiegelijkenis <99% en ≥95% was.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Behandeling met antibiotica en herintroductie van de bacterie
<ol><li>Bereid de antibioticaoplossing voor.<ol>
<li>Weeg de vereiste hoeveelheid sacharose, penicilline en streptomycine af om een 10% sacharoseoplossing voor te bereiden, waaronder 20 eenheden penicilline en 20 μg streptomycine per mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Voed muggen met de antibioticaoplossing.<ol>
<li>Verdoven de muggen in 4 °C gedurende 3-5 min. Breng de muggen over op een papieren beker. Bedek de bovenkant met gaas en wind het gaas met tape om te voorkomen dat muggen ontsnappen.</li>
		<li>Dompel steriele katoenen ballen in de antibioticaoplossing en leg ze zorgvuldig op de muggenbeker. Knijp de katoenen ballen voor gebruik om te voorkomen dat muggen verdrinken in de druipende katoenen ballen.</li>
		<li>Bedek de katoenen balletjes met een petrischaal van 10 cm om vochtverdamping te voorkomen. Vervang de katoenen ballen twee keer per dag gedurende drie opeenvolgende dagen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bevestig de effectiviteit van de antibioticabehandeling.<ol>
<li>Volgens de bovenstaande methode ontleedt u de midgut van met antibiotica behandelde muggen.</li>
		<li>Breng de ontleede midguts over op een steriele 1,5 mL buis met 200 μL steriele 1x PBS buffer.</li>
		<li>Maal midguts in een steriele bank grondig met een steriele stamper om volledige afgifte van darmbacteriën aan de buffer mogelijk te maken.</li>
		<li>Haal het darmmicrobiële DNA eruit door bacteriële genomische DNA-extractiekit.</li>
		<li>Uitvoeren van bacteriële kwantificering door real-time kwantitatieve PCR (qPCR) op genomisch DNA met behulp van universele eubacteria primers (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGCAGCAGT en R: GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT).</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbereiding van bacteriële suspensie<ol>
<li>Meet de bacteriële oplossing met een spectrofotometer. Voeg 1 OD (OD600) bacteriële suspensie toe aan een buis van 1 mL. Centrifugeren de vering op 5.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Gooi de supernatant weg en voeg 1 mL steriele 1x PBS-buffer toe aan 1,5 mL buis voor suspensieneerslag.</li>
		<li>Centrifuge bij 5.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C; gooi de supernatant weg.</li>
		<li>Herhaal stap 2.4.2 en 2.4.3.</li>
		<li>Voeg 200 μL steriele 1x PBS buffer toe aan de bacteriële neerslag.</li>
		<li>Voeg 600 μL van 10% sacharoseoplossing, 200 μL van 10 mm ATP (die fungeert als een phagostimulant) en 200 μL bacteriële suspensie toe in een steriele 1,5 mL buis. Meng door vortexing. U ook bacteriële pelleted in warmte-geïnactiveerd bloed opschorten.</li>
		<li>Bereiding van warmte-geïnactiveerd bloed<ol>
<li>Verzamel vers bloed met een antistollingsbuis.</li>
			<li>Neem 2-3 mL vers bloed. Centrifuge bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om plasma en bloedcellen te scheiden. Merk op dat het bloed verloren zal gaan tijdens het centrifugatie- en wasproces; het gebruik moet vooraf worden berekend.</li>
			<li>Verzamel het plasma in een nieuwe buis van 1,5 mL en inactiveer 1 uur bij 56 °C.</li>
			<li>Voeg 500 μL steriele 1x PBS buffer toe aan 1,5 mL buis voor suspensie van bloedcellen. Centrifuge bij 1.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant weg.</li>
			<li>Herhaal stap 2.4.7.4 twee keer.</li>
			<li>Opnieuw opsplitsen van bloedcellen met warmte-geïnactiveerd plasma om warmte-geïnactiveerd bloed te verkrijgen.</li>
			<li>Volg stappen 2.4.1 tot 2.4.4 om 1 OD bacteriële pelleted te krijgen.</li>
			<li>Resuspend de bacteriën pelleted met 1 mL van warmte-geïnactiveerd bloed.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Voer de mug met bacteriën suspensie.<ol>
<li>Verhonger de muggen voor 24 uur, waardoor antibiotica te metaboliseren voordat het voeden van bacteriën.</li>
		<li>Monteer het membraan-voersysteem.</li>
		<li>Verzegel de gesteriliseerde feeder unit met een parafilm, als alternatief een collageen membraan.</li>
		<li>Zet op een plastic ring en bevestig het met parafilm om te voorkomen dat breken als gevolg van wrijving tijdens het voeden.</li>
		<li>Voeg langzaam de voorbereide bacteriële oplossing toe aan de feeder unit. Houd er rekening mee dat slechts één put van de twee-put feeder unit kan worden gevuld met de oplossing en de feeder unit alleen te dekken van het reagens laten vallen kant.</li>
		<li>Sluit de feederunit aan op een voorverwarmd voedingssysteem tot 37 °C, dat de menselijke temperatuur simuleert om muggen aan te trekken. Plaats het voerapparaat op een papieren beker gevuld met muggen en voer gedurende 90 minuten.</li>
		<li>Verdoven de muggen na het voeden door ze gedurende 3-5 min te onderwerpen aan een temperatuur van 4 °C en de muggen verdoofd te houden in een ijskoud petrischaaltje.</li>
		<li>Kies de volledig opgeslokte muggen voor verdere studies.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Problems+in+Pediatric+and+Adolescent+Health+Care%22%5BJournal%5D)">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li>
<li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbovirus+lifecycle+in+mosquito%3A+acquisition%2C+propagation+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1(2019).</li>
<li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vector+Borne+Diseases%22%5BJournal%5D)">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69(2018).</li>
<li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li>
<li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70(2013).</li>
<li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li>
<li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li>
<li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641(2013).</li>
<li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li>
<li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li>
<li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020(2017).</li>
<li>Guégan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188(2018).</li>
<li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li>
<li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li>
<li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+%28diptera%3A+culicidae%29%28L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites & Vectors. 4 (1), 105(2011).</li>
<li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota%2C+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561(2012).</li>
<li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li>
<li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844(2017).</li>
<li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li>
<li>Möhlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li>
<li>Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li>
<li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants%3A+Part+A%2C+Chemistry%2C+Analysis%2C+Control%2C+Exposure+%26+Risk+Assessment%22%5BJournal%5D)">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li>
<li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li>
<li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186(2018).</li>
<li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria%3A+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141(2019).</li>
<li>Gonçalves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174(2019).</li>
<li>Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuss%2C+SK+%22Science%22">Science</a>. 334 (6053), New York, N.Y. 249-252 (2011).</li>
<li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li>
<li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401(2012).</li>
<li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+microbiota+and+metagenomics%2C+and+its+relevance+to+disease+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li>
<li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Onderzoek naar gastheer-microbe interacties hebben aangetoond dat verschillende darmmicroben hun gastheerfysiologie beïnvloeden via uiteenlopende mechanismen. Dit artikel introduceert de methode om de respectieve rol van mug gut microbe te onderzoeken, met inbegrip van ontleden mug midgut, culturing cultivable darmbacteriën, behandeling met antibiotica, en herinvoering van de bacteriën van belang.
Voor een succesvolle behandeling met antibiotica moeten de volgende details worden overwogen bij ...

Muggen worden beschouwd als de belangrijkste vectoren van menselijke pathogene ziekten, die meer dan honderd ziekteverwekkers overbrengen, waaronder het Zika-virus, het Dengue-virus en Plasmodium-parasieten 1. Wanneer muggen een bloedmaaltijd nemen om voedingsstoffen te verkrijgen voor ovipositie, kunnen ze per ongeluk ziekteverwekkers van een geïnfecteerde gastheer binnenkrijgen via het spijsverteringskanaal2. Belangrijk is dat de mug midgut, die een centrale rol speelt in zowel bloedmeel spijsvertering en pathogene ingang, herbergt een zeer dynamische microbioom3.
Verschillende studies hebben gekenmerkt lab-gefokte en veld-verzamelde mug microbiota met behulp van een cultuur-afhankelijke methode of een bacteriën sequencing test4,5,6. Soorten zoals Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingiaen Enterococcus worden vaak geïsoleerd van muggen in verschillende studies5,7,8,9. Interessant is dat muggendarmmicrobiota dynamisch fluctueert in zowel de diversiteit van de gemeenschap als de hoeveelheid bacteriesoorten, beïnvloed door het ontwikkelingsstadium, soorten, geografische oorsprong en voedingsgedrag4. Studies tonen aan dat bloedvoeding de totale bacteriële belasting drastisch verhoogt met een snelle expansie van soorten uit Enterobacteriaceae en een vermindering van de totale diversiteit10,11. Bovendien wordt muggenonderbuismicrobiota van het larvestadium meestal uitgeroeid wanneer het insect een metamorfose ondergaat tijdens verpopping en eclosie; dus, nieuw opgedoken volwassen muggen moeten hun microbiota4opnieuw bevolken .
Gut microbiota moduleert insectenfysiologie in verschillende aspecten, waaronder opname van voedingsstoffen, immuniteit, ontwikkeling, voortplanting en vectorcompetentie12. Axenic mug larven niet te ontwikkelen dan de eerste instar, terwijl een bacterie orale aanbod redt ontwikkeling, wat aangeeft dat de mug gut microbe is essentieel voor larve ontwikkeling13,14. Bovendien vertraagt uitputting van darmbacteriën de spijsvertering van de bloedmaaltijd en de opname van voedingsstoffen, beïnvloedt de rijping van de eicel en vermindert de ovipositie15. Bovendien lokken muggen met darmmicroflora hogere immuunresponsen uit in vergelijking met met antibiotica behandelde muggen, met voortdurend verhoogde antimicrobiële peptide-expressie tegen andere ziekteverwekkers om16te infecteren. Antibiotica worden meestal oraal toegediend om pan gut bacteriën te verwijderen in deze studies, en vervolgens experimenten worden uitgevoerd om het verschil tussen axenic muggen en muggen te vergelijken met commensale microben. Echter, de mug midgut herbergt een diverse gemeenschap van microben, en elke bacterie soort kan een duidelijk effect uitoefenen op de gastheer fysiologie.
Mosquito microbiota reguleert vector competentie met uiteenlopende effecten. Kolonisatie door Proteus geïsoleerd van veld-afgeleide muggen van dengue-endemische gebieden verleent upregulated antimicrobiële peptide expressie en resistentie tegen dengue virus infectie16. De entomopathogene schimmel Beauveria bassiana activeert de Toll en JAK-STAT immuunroute tegen arbovirusinfectie17. Daarentegen, de schimmel Talaromyces geïsoleerd van Aedes aegypti midgut vergemakkelijkt dengue virus infectie door moduleren gut trypsine activiteit18. Bovendien bevordert Serratia marcescens de overdracht van arbovirus via een secretoir eiwit genaamd SmEnhancin, dat de mucinlaag op het darmeptheel van muggen vertelt19.
Deze procedure biedt een systematische en intuïtieve methode voor dissectie van de mug midgut, isolatie van cultivable bacteriën kolonies, identificatie van de bacteriesoorten, en herintroductie via orale voeding. Het biedt representatieve resultaten van bloedvoeding met een commensale bacterie, Chryseobacterium meningosepticum, op mug eierstokontwikkeling en ovipositie.

<table><tbody><tr><td>Adenosine 5&prime;-triphosphate disodium salt hydrate</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td>Adenosine 5&prime;-triphosphate disodium salt hydrate is gebruikt voor het bereiden van adenosinetrifosfaat (ATP) standaardoplossingen</td></tr><tr><td>Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>Vrouwelijke muggen</td></tr><tr><td>Anticoagulant tube</td><td>BD Vacutainer</td><td>363095</td><td>Verzamel vers bloed</td></tr><tr><td>Centrifuge tube</td><td>Sangon Biotech</td><td>F601620-0010</td><td>1,5 ml, Natuurlijk, Gegradueerd, Sterile</td></tr><tr><td>Katoenen ballen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tissue Grinding Pestle</td><td>Sangon Biotech</td><td>F619072-0001</td><td>70 mm lang, Conisch, Blauw, Sterieel</td></tr><tr><td>Ethanol absoluut</td><td>Paini</td><td></td><td>Verdun het tot 75% ethanol</td></tr><tr><td>Pincet</td><td>RWD</td><td>F11029</td><td>Dissectie</td></tr><tr><td>Hemotek membraan voedingssysteem</td><td>Hemotek</td><td></td><td>Componenten van het voedingssysteem, inclusief&nbsp; Hemotek temperatuurregelaar, feeder-behuizing, gemonteerde metalen feeder.</td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td></td><td>ZQZY-78AN</td><td></td></tr><tr><td>Inoculatielussen</td><td>Sangon Biotech</td><td>F619312-0001</td><td>10 &mu;l, Geel</td></tr><tr><td>LB Agar Poeder</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507003</td><td>Tryptone 10,0 g, Gistextract 5,0 g, NaCl 10,0 g, Agar 15,0 g.</td></tr><tr><td>LB Broth Poeder</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507002</td><td>Tryptone 10,0 g, Gistextract 5,0 g, NaCl 10,0 g.</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi508</td><td></td></tr><tr><td>Papieren beker</td><td></td><td></td><td>Plaats de mug</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sangon Biotech</td><td>F104002</td><td>4 inx 125 ft</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Sangon Biotech</td><td>F611203</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline G procaïne zout hydrate</td><td>Sangon Biotech</td><td>A606248</td><td>Witte poeder. Oplosbaar in water, oplosbaar in methanol, licht oplosbaar in water, ethanol</td></tr><tr><td>Single Channal Pipettor</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine sulfaat</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610494</td><td>Streptomycine sulfaat is een glucosamine antibioticum dat de synthese van prokaryotische eiwitten verstoort.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792</td><td>Oplosbaar in water, ethanol en methanol, licht oplosbaar in glycerol en pyridine.</td></tr><tr><td>TIANamp Bacteriën DNA Kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP302</td><td>DNA extraheren&nbsp;</td></tr><tr><td>Utility Fabric-Mosquito Netting White</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scintic Industries</td><td>S1-0246</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml EP buis</td><td>Sangon Biotech</td><td>F600620</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS buffer</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607016</td><td>Dit product is een 10X oplossing. Verdun het voor gebruik 10 keer. De pH-waarde is 7,4.</td></tr></tbody></table>

een bacteriële orale voedingstest met met antibiotica behandelde muggen

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

De mug midgut herbergt een zeer dynamisch microbioom dat het metabolisme van de gastheer, reproductie, fitness en vectorcompetentie beïnvloedt. Er zijn studies uitgevoerd om het effect van darmmicroben als geheel te onderzoeken; verschillende microben kunnen echter verschillende effecten op de host uitoefenen. Dit artikel biedt de methodologie om het effect van elke specifieke mug gut microbe en het potentiële mechanisme te bestuderen.
Dit protocol bestaat uit twee delen. Het eerste deel introduceert hoe de mug midgut te ontleden, cultivable bacteriën kolonies te isoleren, en bacteriën soorten te identificeren. Het tweede deel biedt de procedure om met antibiotica behandelde muggen te genereren en één specifieke bacteriesoort opnieuw in te voeren.

De muggen die met antibiotica en zonder antibiotica werden behandeld, werden genomen voor DNA-extractie, en qPCR werd uitgevoerd met universele bacteriële primers. Figuur 1 toont de expressie van bacteriële 16S rRNA in de controlegroep en de behandelingsgroep voor antibiotica. De resultaten tonen aan dat ongeveer 98% van de darmbacteriën zijn verwijderd, en de darmsterilisatie van penicilline en streptomycine was succesvol.
Met de beschreven methoden werden bacteriestammen geï...

Dit artikel presenteert een protocol om het effect van individuele muggendarmbacteriën te onderzoeken, inclusief isolatie en identificatie van muggenmuisculivable microben, uitputting van muggendarmen en herintroduceren van een specifieke bacteriesoort.

Een bacteriële orale voedingstest met met antibiotica behandelde muggen

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

Mosquito midgut herbergt een complexe gemeenschap van microben die invloed hebben op de gastheer metabolisme, reproductie, fitness, en dierenarts competentie. Bij elke darmmicrobe is een ander effect. Deze video introduceert de procedure om de respectieve rol van elke bacteriestam of gastheerfysiologie te bestuderen.Om een cultuur van darmbacteriële kolonies te verwerven, ontleden de mug midgut onder steriele toestand. Bezoedelde de ontleed midgut, serotologinaat, en verspreid over de agar plaat. Kies enkele kolonies van de plaat en identificeer de bacteriesoorten via hun 16 SRNA-gensequentie.Voer de muggen met COD-reliëfs met antibiotica voor opeenvolgende van drie dagen om darmmicrobiota te verwijderen. De effectiviteit van de behandeling met antibiotica kan worden bevestigd door de midgut van de aseptische mug te ontleden voor kolonievormende eenheidstest voorafgaand aan latere extremisten. Vervolgens herintroduceren specifieke bacteriën soorten die eerder geïsoleerd uit muggendarm via orale voeding test.Het effect van bacteriën op de hostfysiologie kan worden geëvalueerd door de onbehandelde muggen, met antibiotica behandelde muggen en de muggen opnieuw specifieke terughoudendh

a-bacterial-oral-feeding-assay-with-antibiotic-treated-mosquitoes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Methoden voor het gebruik van Alphavirus transducing systemen om TL-verslaggevers uit te drukken in vitro en in volwassen muggen worden beschreven. Deze techniek kan worden aangepast aan een eiwit van belang uit te drukken in plaats van of naast een verslaggever.

Alphavirus Transducing System: Tools voor het visualiseren van besmetting in Mosquito Vector

Source: Liu, X., et al. A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the dissection of the mosquito midgut to isolate gut bacteria. The midgut is extracted from the digestive tract, homogenized to release the bacteria, and plated on nutrient agar to culture bacterial colonies.

Isolation of Bacteria from the Mosquito Midgut

Source: Liu, X., et al. A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the depletion of native gut microbiota in mosquitoes using an antibiotic-containing sucrose solution. This is followed by controlled recolonization with a bacterial suspension delivered through a membrane feeding system to establish a defined bacterial population in the mosquito gut.

Establishing a Defined Gut Bacterial Population in Adult Mosquitoes

This video demonstrates a blood-feeding assay to evaluate the mortality and fecundity of test compounds with novel modes of action on female mosquitoes. This technique helps in screening new classes of insecticides to kill the resistant population of mosquitoes and control disease spread.

Mosquito Feeding Assay: A Method to Evaluate Test Compound Effects on Mortality and Fecundity of Adult Female Mosquitoes

Als gevolg van de opvallende gelijkenissen van de levenscyclus en de biologie van knaagdieren malariaparasieten voor menselijke malariaparasieten, knaagdieren malaria modellen zijn onmisbaar geworden voor malaria onderzoek. Hierin hebben we enkele van de belangrijkste technieken gestandaardiseerd die worden gebruikt in de fenotypische analyse van wild-type en transgene knaagdier malaria soorten.

Fenotypische analyse van knaagdieren malaria parasiet asexual en seksuele bloed stadia en muggen stadia

Protocollen worden voor de beoordeling van de toxiciteit van chemicaliën te onvolwassen en volwassen muggen voor ontwikkeling als nieuwe klassen van larvicides, adulticides en endectocides beschreven. De protocollen inschakelen high-throughput testen van meerdere oplossingen op single-point dosis en evaluatie achteraf via dosis reactie assay om toxiciteit op contact te bepalen of via ingestie.

Protocollen voor het testen van de toxiciteit van roman insecticide chemicaliën aan muggen

Voor een efficiënte controle van mug virusverspreiding gedragen, is de kennis van het potentieel van de vector van respectieve muggen van bijzonder belang. Beschrijven we gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van vector bevoegdheid van Aedes albopictus en drie verschillende Culex taxa voordeoverdracht van Zika-virus.

Gedwongen speekselvloed als een methode voor het analyseren van Vector bevoegdheid van muggen

Een protocol wordt gepresenteerd voor de formulering van een bloedvrij kunstmatig dieet om Anopheles muggen in gevangenschap te voeden. Dit dieet heeft een vergelijkbare prestatie als gewerveld bloed en triggers oogenese en ei rijping en produceert levensvatbare volwassen nakomelingen.

Een bloedvrij dieet om anopheline muggen rear

De orale toediening van dsRNA geproduceerd door bacteriën, een toedieningsmethode voor RNA-interferentie (RNAi) die routinematig wordt gebruikt bij Caenorhabditis elegans, werd hier met succes toegepast op volwassen muggen. Onze methode maakt robuuste omgekeerde geneticastudies en transmissieblokkerende vectorstudies mogelijk zonder het gebruik van injectie.

Effectieve orale RNA-interferentie (RNAi) toediening aan volwassen Anopheles gambiae muggen

De standaard membraanvoedingstest (SMFA) wordt beschouwd als de gouden standaard voor de beoordeling en identificatie van potentiële antimalariaverbindingen. Dit kunstmatige voedingssysteem wordt gebruikt om muggen te infecteren om de effecten van dergelijke verbindingen op de intensiteit en prevalentie van de Plasmodium falciparum-parasiet verder te evalueren.

Standaard membraanvoedingstest voor de detectie van Plasmodium falciparum-infectie in Anopheles Mosquito Vectors

Deze methodologie, die orale voeding en intrathoracale injectie-infectie omvatte, kon de invloed van midgut- en / of speekselklierbarrières op arbovirusinfectie effectief beoordelen.

Experimentele virale infectie bij volwassen muggen door orale voeding en micro-injectie

Leer een bacteriële orale voedingstest met antibiotica-behandelde muggen om de rol van darmbacteriën in gastheerfysiologie te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers bij vectorbeheersing.

Een bacteriële orale voedingstest met met antibiotica behandelde muggen

Meer video's verkennen