Dissectie en isolatie van Murine Glia uit meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel
4 juni 2020
Hier presenteren we een protocol voor in vitro isolatie van meerdere gliacelpopulaties van een muis CNS. Deze methode maakt de segregatie van regionale microglia, oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten mogelijk om de fenotypen van elk in verschillende cultuursystemen te bestuderen.
Dit protocol is belangrijk omdat we leren dat gliacellen regionaal heterogeen zijn, morfologisch, functioneel en genetisch. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat je drie afzonderlijke gliacellensubsets van vier verschillende regio's van het centrale zenuwstelsel kunt bestuderen. Ik zal deze procedure demonstreren samen met Rachel Tinky, een afgestudeerde student in mijn lab.
Gebruik een fijne schaar om de cutane laag langs de middenlijn van het kopje van de pup te snijden, beginnend vanuit de staart en naar voren bewegend tot je de snuit bereikt. Vermijd diep in de schedel te snijden om weefselbeschadiging te voorkomen. Door de kop naar beneden te kantelen, trekt u de cutane laag naar elke kant van de schedel en gebruikt u een veerschaartje om een incisie langs de schedelmiddenlijn te maken, beginnend bij het foramen magnum.
Trek de schedelhelften uit elkaar met een fijne pincet en leg de cortex, het cerebellum en de hersenstam bloot. Eenmaal blootgelegd, tilt u de hersenen voorzichtig uit de schedel en plaatst u ze in een 10 centimeter petrischaal met 10 milliliter PBS en een antibioticaoplossing. Zorg ervoor dat de hersenen onbeschadigd blijven met de achterhersenen erop geplaatst.
Kneip het cerebellum af met een fijne, gebogen pincet. Plaats het in een aangewezen 15 milliliter conische buis op ijs. Scheid de middenhersenen van de cortex.
Verwijder de corticale hersenvliezen en plaats ze in een aangewezen conische buis. Het weefsel moet zorgvuldig worden onderzocht om ervoor te zorgen dat de hersenvliezen volledig zijn verwijderd. Als er hersenvliezencellen in de cultuur achterblijven, kunnen ze schadelijk zijn voor de groei van gliacellen.
Om het ruggenmerg te dissekeren, plaatst u het met de buikzijde naar boven en gebruikt u een fijne veerschaartje om de wervels te snijden, wisselend tussen de linker- en rechterkant totdat het ruggenmergweefsel is blootgelegd. Verwijder voorzichtig het ruggenmerg en de hersenvliezen en plaats ze in de aangewezen conische buis op ijs. Voeg één milliliter 0,05% trypsine met 0,53 millimolar EDTA toe aan elke buis met weefsel.
Tritureer het mengsel met een 10 milliliter pipette ongeveer 20 keer. Breng vervolgens de celsuspensie over naar een lege 50 milliliter conische buis. Incubeer de oplossing gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.
Schud de lysaten voorzichtig na acht minuten. Na de incubatie, voegt u vijf milliliter MGM en 200 microliter DNase I toe aan elke buis voor een uiteindelijke concentratie van 50 microgram per milliliter. Tritureer elke lysate 10 keer met een 10 milliliter pipette.
Laat vervolgens de celsuspensie drie minuten op kamertemperatuur staan om niet-gedissocieerd weefsel zich op de bodem van de buis te laten bezinken. Breng de celsuspensies over naar nieuwe 50 milliliter conische buizen en laat het niet-gedissocieerde weefsel achter. Na centrifugatie, resuspendeer de celpellet in vijf milliliter MGM en tritureer deze 20 keer. Plaats de celsuspensies op gecoate T25 kolven en incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.
Ververs het medium na 24 uur om celdebris te verwijderen. Om oligodendrocytvoorlopercellen te isoleren, schudt u de cellen gedurende 15 uur, verwijdert u vervolgens het supernatant uit de kolf en plaatst u het op een steriele petrischaal. Incubeer het supernatant gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.
Zwiep na 15 minuten om resterende microglia te verwijderen. Verwijder niet-adhesief celsupernatant, tel de cellen en plaats ze op een Poly-D-Lysine gecoate oppervlakte op de gewenste concentratie. Breng de cellen terug naar de incubator gedurende minimaal één uur.
Aspireer vervolgens voorzichtig 95% van het medium en voeg langzaam warm OPC-medium toe, waarbij u het tegen de zijkant van de put pipet om verstoring van OPC's te minimaliseren. Deze methode werd gebruikt om aan te tonen dat interferon gamma-signalering de differentiatie en rijping van OPC's beïnvloedt. Zonder de interferon gamma-receptor ondergaan corticale OPC's geen differentiatie naar volwassen myeliniserende oligodendrocyten, wat blijkt uit de afwezigheid van MBP-kleuring.
De expressie van GFAP werd ook geanalyseerd. Interferon gamma-deficiënte cellen drukken GFAP sterk tot expressie, wat suggereert dat ze mogelijk een astrocytic fenotype aannemen. Regionale heterogeniteit in CNS-cellen wordt aangetoond door variërende astrocytenmorfologie in de cortex, cerebellum, hersenstam en ruggenmerg.
Astrocyten uit hetzelfde gebied kunnen ook morfologische heterogeniteit vertonen, wat het idee ondersteunt dat dit gliacellensubtype zeer dynamisch is. Regionale reacties van OPC's op differentiële cytokine-stimulatie werden ook onderzocht. Cytokine-signalering heeft significante invloed op het gedrag van stamcellen en immuuncellen en kan van invloed zijn op hoe de OPC's differentiëren tot volwassen myeliniserende oligodendrocyten.
Na isolatie van regionale gliacellen kunnen cellen worden gebruikt in verschillende experimentele omstandigheden en zuur met behulp van verschillende technieken, waaronder immunohistochemie, kwantitatieve real-time PCR en Western blotting.
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor de in vitro isolatie van meerdere gliale celpopulaties uit het centrale zenuwstelsel (CZS) van de muis, waaronder regionale microglia, oligodendrocytaire precursorcellen en astrocyten. De methodologie maakt het mogelijk om de verschillende fenotypes van elk gliaal celtype te bestuderen onder diverse culturesystemen, waarbij hun regionale heterogeniteit wordt benadrukt.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Gliale celbiologie
Achtergrond
- Gliale cellen vertonen regionale heterogeniteit in morfologie, functie en genetica.
- Het begrijpen van de verschillende populaties gliale cellen is essentieel voor het onderzoeken van hun rollen in het centrale zenuwstelsel (CZS).
- Dit protocol stelt onderzoekers in staat om de interactie tussen verschillende typen gliale cellen te bestuderen.
- De isolatie van afzonderlijke populaties kan inzicht bieden in hun specifieke bijdragen aan de functie van het CZS.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode om specifieke populaties gliale cellen uit verschillende regio's van het CZS te isoleren.
- Het onderzoeken van de fenotypische kenmerken van geïsoleerde gliale populaties.
- Het bestuderen van regionale responsen van oligodendrogene precursorcellen op cytokinestimulatie.
Gebruikte methoden
- Voor de isolatie van glialcellen werd gebruikgemaakt van in vitro celkweekmethodologie.
- Het biologische model omvat glialcellen afgeleid van fragmenten uit het centrale zenuwstelsel (CZS) van muizen.
- Er werden geen multi-omics workflows vermeld.
- De belangrijkste stappen omvatten dissectie, trypsinisatie en technieken voor celsuspensie.
- Tijdsbestekken voor incubatie en het uitplaten van cellen werden beschreven voor optimale resultaten.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol heeft met succes onderscheidende gliale celpopulaties geïsoleerd uit verschillende regio's van het CZS.
- De studie merkte op dat interferon-gamma-signalering de differentiatie van oligodendrocyte-precursorcellen beïnvloedt.
- Astrocyten vertoonden morfologische heterogeniteit op basis van hun regio van herkomst in het CZS.
- Potentiële implicaties voor het begrijpen van hoe cytokinesignalering het gedrag van gliale cellen beïnvloedt, werden belicht.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een waardevolle methode voor het ontleden van de rol van gliacellen in de functie van het centraal zenuwstelsel.
- Door de isolatie van specifieke gliale subsets mogelijk te maken, kunnen onderzoekers hun unieke bijdragen beter begrijpen.
- Dit protocol ondersteunt toekomstige onderzoeken naar gliale celdynamiek en hun reactie op omgevingsprikkels.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Regionale heterogeniteit van gliale cellen heeft invloed op de validatie van targets en het mechanistisch beperken van risico's bij het ontdekken van geneesmiddelen voor het centraal zenuwstelsel (CZS). Dit protocol maakt de isolatie mogelijk van microglia, oligodendrogene progenitorcellen en astrocyten uit vier muizenregio's van het CZS ter ondersteuning van fenotypische screening en assayontwikkeling. Door ziekterelevante systemen met een gedefinieerde cellulaire samenstelling te bieden, wordt het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen verbeterd en worden strategieën voor de identificatie van lead-verbindingen onderbouwd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om gliale subset-fenotypen in corticale, cerebellaire, hersenstam- en ruggenmergregio's te onderzoeken om de doelbiologie te verduidelijken en mechanistische hypothesen te staven.
- Operationele waarde: Maakt reproduceerbare isolatie van microglia, OPC's en astrocyten mogelijk voor consistente studies naar target-engagement en padmodulatie.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert regionaal gedefinieerde gliale culturen voor compound-screening en beoordeling van cytokine-gemedieerde effecten op OPC-differentiatie en -rijping.
- Operationele waarde: Standardiseert de gliale preparatie via mechanische dissociatie en het uitplaten op een gedefinieerde matrix om assay-gereedheid en schaalbaarheid te waarborgen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de evaluatie van regionale gliale responsen op interferon gamma en andere cytokinen, wat bijdraagt aan de afstemming van biomarkers en pathofysiologische relevantie.
- Operationele waarde: Maakt co-culturesystemen en systemen met enkelvoudige celtypen mogelijk om glia-neurale interacties te modelleren en doelgerichte uitkomsten in preklinische workflows te beoordelen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode kan worden geïntegreerd in vroege discovery-workflows door gevalideerde gliale populaties te leveren voor target-validatie, assay-ontwikkeling en mechanistische risicoanalyse voorafgaand aan de identificatie van lead-verbindingen.
- Discovery Biology: Faciliteert hypothesetesten over regionale gliale heterogeniteit en cytokinesignaleringspaden bij de modulatie van doelen in het centrale zenuwstelsel.
- Screening: Levert gestandaardiseerde gliale suspensies met een gedefinieerde cellulaire samenstelling voor reproduceerbare compoundscreening en fenotypische read-outs.
- Analytics: Maakt kwantitatieve metingen mogelijk van gliale differentiatie, markerexpressie (bijv. MBP, GFAP) en functionele reacties op cytokinestimulatie.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt regionale gliale fenotypes met ziekterelevante systemen, wat risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling in preklinische modellen ondersteunt.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een schaalbaar platform voor gliale isolatie dat toepasbaar is over meerdere regio's van het centrale zenuwstelsel en experimentele condities voor duurzaam R&D-gebruik.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid bij de validatie van gliale targets door vermindering van mechanistische ambiguïteit en regio-specifieke functionele inzichten.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde workflows voor dissociatie, uitplating en celseparatie waarborgen reproduceerbaarheid en schaalbaarheid tussen laboratoria.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen door gliale target-interactie te verduidelijken en biologische risico's in een laat stadium binnen CZS-programma's te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van regionale gliale fenotypedata en cytokinerespons-profielen.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in neuroanatomie en steriele weefseldissectie is vereist om CNS-regio's te isoleren en de meninges te verwijderen zonder contaminatie.
- Toegang tot centrifuges, pipetten, CO2-incubatoren en gecoate kweekcolven is noodzakelijk voor gliale dissociatie, uitplating en expansie.
- Standaardisatie van trypsinisatie-, DNase-behandeling- en trituratieprotocollen binnen teams waarborgt een consistente gliale opbrengst en levensvatbaarheid.
- Aanpassing aan alternatieve modelsystemen (bijv. uit menselijke iPSC afgeleide glia) vereist validatie van regionale markers en dissociatie-efficiëntie.
- Beperkingen omvatten de noodzaak voor snelle weefselverwerking om de gliale integriteit te behouden en overgroei van meningeale cellen in kweek te voorkomen.
