Vertering van hele muisogen voor multiparameterstroomcytometrische analyse van mononucleaire fagocyten
17 juni 2020
Dit protocol biedt een methode om hele ogen te verteren tot een suspensie met één cel met het oog op cytometrische analyse van de multiparameterstroom om specifieke oculaire mononucleaire fagocytische populaties te identificeren, waaronder monocyten, microglia, macrofagen en dendritische cellen.
Dit protocol is ontworpen om hele muizenogen te verteren tot een enkele celsuspensie voor multi-parameter flow cytometry van mononucleaire fagocyten, waaronder macrofagen, monocyten, microglia en dendritische cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om kwantitatieve analyse met fluorofoorintensititeit te gebruiken om nauw verwante celtypen te differentiëren op basis van de expressie van celoppervlaktemarkers. Ons protocol is geoptimaliseerd voor de analyse van macrofagenheterogeniteit, inclusief zowel residente als infiltrerende populaties in het laser-geïnduceerde choroïdale neovascularisatiemodel.
Deze concepten en technieken kunnen echter ook op andere modellen worden toegepast, zoals diabetische retinopathie, experimentele auto-immuun uveïtis en manifestaties van lupus. Bij het uitvoeren van dit protocol is het begrijpen van de configuratie van uw cytometer een kritische start, aangezien niet alle cytometers op dezelfde manier zijn geconfigureerd. Daarom kunnen de volumes van fluorescent geconjugeerde antilichamen moeten worden getitreerd en/of fluoroforen moeten worden aangepast om het protocol te optimaliseren op basis van de configuratie van uw cytometer.
Begin met het bereiden van de verteringsbuffer volgens de manuscriptaanwijzingen. Gebruik een dissectief microscoop en 10X totale vergroting, verwijder de resterende conjunctiva en oogzenuw van de ogen. Verplaats schone ogen naar een droge dissectiebak of een kleine weegschaal, maak vervolgens twee doorborende wonden met een hoek van 90 graden tussen hen door de visuele as.
Gebruik een spuit met een naald van 30 gauge om 0,15 tot 0,2 milliliter verteringsbuffer in de vitreuze holte van elk oog te injecteren. Snijd de ogen in kleine stukjes met veerschaar en fijne pincetten, en dissocieer het lensweefsel met stompe mechanische verstoring om verstopping van de pipetpunten in latere stappen te voorkomen. Spoel de pincetten en schaar met 0,75 milliliter verteringsbuffer en vervang de bak voor elk monster.
Gebruik een P1000 pipet om de inhoud van de bak over te brengen naar een dissociatiebuis op ijs, zorg ervoor dat er geen materiaal verloren gaat. Spoel de bak met een extra 1,5 milliliter verteringsbuffer en voeg het toe aan de dissociatiebuis, waardoor het totale volume tussen 3,25 en 3,5 milliliter komt. Dissocieer het weefsel op een elektronische dissociator zoals beschreven in het tekstmanuscript, zorg ervoor dat al het weefsel zich op de bodem van de omgekeerde dissociatiebuis bevindt en in contact komt met de verteringsbuffer.
Vervolgens incubeer de dissociatiebuis bij 37 graden Celsius en 200 RPM gedurende 30 minuten. Herhaal de weefseldissociatie nog twee keer, waarbij het monster tussen de dissociaties gedurende 30 minuten wordt geïncubeerd bij 37 graden Celsius en 200 RPM. Om de reactie te stoppen, voeg 10 milliliter koude flowbuffer toe en plaats de monsterbuizen op ijs.
Om een enkele celsuspensie te maken, zeef de gestopte oogverteringsreactie door een filter van 40 micrometer dat op de bovenkant van een 50 milliliter conische centrifugebuis is geplaatst. Gebruik de plunjer van een 2,5 milliliter spuit om eventuele resterende stukjes onverteerd oogweefsel door de filter te duwen. Was de dissociatiebuis met 10 milliliter flowbuffer en spoel de filter.
Gebruik vervolgens dezelfde plunjer om de stukjes onverteerd oogweefsel opnieuw door de filter te laten gaan. Herhaal dit proces met vijf milliliter flowbuffer. Was vervolgens de dissociatiebuis en filter met een laatste 10 milliliter flowbuffer.
Centrifugeer de conische buis bij 400 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en decanteer het supernatant zonder de celpellet te verstoren. Breek de pellet op door de buis tegen een andere buis te klappen. Voeg vervolgens een milliliter lysingoplossing toe en slinger de buis bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden om de rode bloedcellen te lyseren.
Stop de reactie met 20 milliliter flowbuffer en centrifugeer de conische buis bij 400 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Decanteer het supernatant zonder de celpellet te verstoren. Klap de buis tegen een andere buis.
Voeg vervolgens vijf milliliter koude HBSS toe. Herhaal de centrifugatie en verwijder het supernatant. Voeg 0,5 milliliter levend dood kleurstof toe aan elk monster met behulp van een P1000 pipet, zorg ervoor dat de pellet volledig wordt gedissocieerd.
Breng de monsters over naar 1,2 milliliter microtiterbuisjes en incubeer ze gedurende 15 minuten in het donker. Tel ondertussen een 10 microliter aliquot van het monster met trypaanblauw en een hemocytometer. Na de incubatie, was elk monster door 400 microliter koude flowbuffer toe te voegen.
Centrifugeer de buisjes in een microtiterbuisjesrek bij 400 keer G gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius en aspireer het supernatant zonder de celpellet te verstoren. Resuspendeer de cellen volledig in 500 microliter koude flowbuffer. Herhaal vervolgens de centrifugatie en verwijder het supernatant.
Blok tot vijf miljoen levende cellen in 50 microliter FC-blok. Dissocieer de celpellet volledig en incubeer hem gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Voeg vervolgens 50 microliter antilichaamkleuringsoplossing toe aan elk monster.
Meng het volledig en incubeer het gedurende nog eens 30 minuten bij vier graden Celsius. Eigenschappen van de voorwaartse verstrooiingsgebied versus zijwaartse verstrooiingsgebied voor alle geanalyseerde gebeurtenissen van twee ogen van een enkele muis worden hier getoond. Kralentellingen werden schoongemaakt en bevestigd door PE over APC-Cy7 uit te plotten, waardoor een strakke cluster van PE positieve en APC-Cy7 negatieve gebeurtenissen ontstond.
Vervolgens werden singlets in levende cellen geïdentificeerd vanuit alle gebeurtenissen. Singlets waren positief gecorreleerd in voorwaartse verstrooiingshoogte versus voorwaartse verstrooiingsgebied, terwijl doublet- en tripletcellen een groter voorwaarts verstrooiingsgebied hadden dan voorwaartse verstrooiingshoogte. Levende cellen zijn voorwaarts verstrooiingsgebied positief en levend dood kleurstof negatief.
De initiële gatingstrategie voor de afbakening van mononucleaire fagocyten van levende singletcellen wordt hier getoond. Levende
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het verteren van volledige muizenogen tot een single-cell suspensie voor multi-parameter flowcytometrie-analyse. De focus ligt op het identificeren van specifieke okulair mononucleaire fagocytische populaties, waaronder macrofagen, monocyten, microglia en dendritische cellen.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Immunologie
Achtergrond
- De techniek maakt kwantitatieve analyse mogelijk op basis van fluorofoorintensiteit.
- Het helpt bij het differentiëren van nauw verwante celtypen op basis van de expressie van celoppervlaktemerkers.
- Geoptimaliseerd voor de analyse van macrofaag-heterogeniteit.
- Toepasbaar op diverse modellen, zoals diabetische retinopathie en auto-immuun uveïtis.
Doel van de studie
- Om mononucleaire fagocytpopulaties in oogweefsels te analyseren.
- Om het begrip van de rol van macrofagen bij oogziekten te verbeteren.
- Om een betrouwbare methode voor flowcytometrische analyse te bieden.
Gebruikte methoden
- Vertering van volledige muizenogen tot een suspensie van enkelvoudige cellen.
- Multi-parameter flowcytometrie voor celanalyse.
- Gebruik van fluorescentie-geconjugeerde antilichamen voor de detectie van celoppervlaktemarkers.
- Optimalisatie op basis van de configuratie van de cytometer.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van verschillende populaties mononucleaire fagocyten in het oog.
- Kwantitatieve differentiatie van macrofaagsubtypes.
- Inzichten in de heterogeniteit van macrofagen in oogmodellen.
- Protocol dat aanpasbaar is aan diverse experimentele condities.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het analyseren van oogimmunocellen.
- Het biedt een kader voor het bestuderen van macrofaagdynamiek bij oogziekten.
- Inzicht in de configuratie van de cytometer is essentieel voor een succesvolle implementatie.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Kwantitatieve multi-parameter flowcytometrie van volledige muizenogen maakt een nauwkeurige afbakening van subpopulaties mononucleaire fagocyten mogelijk, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie in modellen voor oogziekten. Deze aanpak verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid bij targetvalidatie en immuuncelprofilering, wat een directe impact heeft op vroege ontdekkings- en translationele onderzoekspijplijnen. De aanpasbaarheid van de methode aan diverse ziektemodellen versterkt de besluitvorming voor portfolio's binnen immunologie-georiënteerde biofarmaceutische R&D.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Maakt een rigoureuze analyse van de heterogeniteit van aangeborene immuuncellen in oogweefsels mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door onderscheid te maken tussen residente en infiltrerende macrofaagpopulaties.
- Faciliteert mechanische risicoreductie via kwantitatieve markeranalyse.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor immuunmodulerende therapeutische strategieën.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde single-cell suspensies voor voor high-content flowcytometrie-assays.
- Standaardiseert gating-strategieën met behulp van fluorescence minus one-controles en single color-controles.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de identificatie van immuuncel-subsets.
- Maakt betrouwbare downstream cel sortering mogelijk voor transcriptomische of proteomische workflows.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt immuunprofilering uitgelijnd met ziekterelevante oculaire modellen, zoals choroïdale neovascularisatie en diabetische retinopathie.
- Ondersteunt continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door fate mapping en subset-tracking mogelijk te maken.
- Levert kwantitatieve gegevens om risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling in oculaire immunologieprogramma's te onderbouwen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode vormt de schakel tussen vroege ontdekking en preklinisch onderzoek, waardoor robuuste profilering van immuuncellen mogelijk is, van hypotheseonderzoek tot de identificatie van lead-verbindingen.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door de heterogeniteit van mononucleaire fagocyten op te lossen.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare single-cell suspensies met gestandaardiseerde gating en kwantitatieve marker-readouts.
- Analytics: Biedt multi-parametrische metingen voor vergelijkende analyse van immuuncelpopulaties over verschillende experimentele condities heen.
- Translational Research: Maakt afstemming van immuuncelprofilering met ziektemodellen mogelijk voor biomarker-ontdekking en -validatie.
- Enterprise Reuse: Biedt een herbruikbaar platform voor immuuncelanalyse in diverse oculaire en systemische ziektemodellen.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van targets voor immuuncellen.
- Operationele waarde: Standardiseert monsterpreparatie en gating-strategieën voor reproduceerbare, schaalbare immuunprofilering.
- Strategische waarde: Onderbouwt go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalefficiëntie door het leveren van robuuste kwantitatieve gegevens.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van immuunmodulerende therapeutische kandidaten mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in flowcytometrie en de selectie van immuuncelmarkers.
- Vraagt toegang tot multiparameter flowcytometers en analysesoftware.
- Maakt standaardisatie van gating- en controlestrategieën tussen verschillende teams noodzakelijk.
- Aanpasbaar aan diverse oculaire en systemische ziektemodellen door optimalisatie van het protocol.
- Beperkt door het verlies van weefselarchitectuur, wat aanvullende beeldgevingsmethoden kan vereisen.
