Een pijpleiding die bilaterale in Utero-elektroporatie gebruikt om genetische invloeden op knaagdiergedrag te ondervragen

Deze methode kan toelaten om te ontdekken hoe bepaalde veranderingen in genexpressie kunnen bijdragen aan pathologieën die geassocieerd zijn met neurologische ziekten. Het voordeel van deze techniek is dat het de noodzaak om genetische dierlijnen te maken of te kopen omzeilde, wat jaren kan duren om te creëren en valideren. Deze techniek maakt de studie van genen mogelijk die betrokken zijn bij neurologische aandoeningen.

Bepalen hoe specifieke genen bijdragen aan pathologie is een belangrijke stap in het ontwikkelen van nieuwe therapieën. Het voordeel van dit protocol is dat je leert om de embryo's te manipuleren zodat de experimentator de genoverdrachtstap voltooit zonder de overlevingspercentages te verlagen. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk omdat de embryo's erg kwetsbaar zijn, dus het is nuttig om te observeren hoe een ervaren experimentator ze manipuleert tijdens de procedure.

Breng drachtige moeders minstens 30 minuten voor de operatie naar het operatiegebied. Steriliseer de volledige operatieplaats met gesteriliseerde germicide doekjes en vervolgens 70% ethanol. Steriliseer vervolgens autoclaafgereedschap in een glazen parel sterilisator.

Breng steriele PBS over in 50 milliliter kegelbuisjes en plaats de buisjes in een waterbad verwarmd tot 38 tot 40 graden Celsius. Controleer de temperatuur van de steriele zoutoplossing met een thermometer. Zet de waterverwarmingscirculatiepomp aan zodat deze op 37 graden Celsius wordt verwarmd.

Schakel vervolgens de drukinjector en elektroporator in en zorg voor de juiste werking. Draai kort de plasma-DNA-oplossing op een tafelcentrifuge en plaats deze op ijs. Trek glaspipetten op een pipettrekker zodat de punt van de getrokken glaspipet ongeveer 50 micrometer in diameter is.

Vul vervolgens de pipet met 20 tot 40 microliter DNA-oplossing. Zet alle benodigde items voor de operatie op, inclusief haarlotion, jodium, 70% ethanol, wattenstaafjes, oogdruppels, hechtdraad en gaas. Bereid een operatieblad voor en vul de nodige informatie in.

Weeg de muis voor de operatie en noteer het gewicht. Na het anestheseren van de muis, toedienen van preoperatieve pijnstillers en het verwijderen van de vacht van de buik met behulp van haarverwijderingscrème of een scheermes. Steriliseer de buik door deze drie keer af te vegen met povidonjodium en 70% ethanol.

Maak een steriel veld rond de buik met steriele gaas en drapering. Maak een middenincisie in de buikhuid terwijl je de huid omhoog tilt met een pincet om te voorkomen dat je door de spier snijdt. Til vervolgens de spier omhoog en snijd er doorheen, waarbij je ervoor zorgt dat je geen vitale organen snijdt.

Trek voorzichtig de baarmoederhoorns uit de moeder met behulp van ringtangen en plaats ze voorzichtig op het steriele veld, ervoor zorgen dat ze worden ondersteund met padding en niet te ver van de moeder worden getrokken. Houd de baarmoederhoorn gedurende de rest van de operatie vochtig met de voorverwarmde steriele PBS. Positioneer een embryo met ofwel forceps of vingers, en steek vervolgens voorzichtig de getrokken glaspipet in het laterale verticale en injecteer twee tot drie microliters in elke ventrikel door de pipet in de ene en vervolgens in de andere ventrikel te steken.

De ventrikel is succesvol gericht als er na de injectie een halvemaanvorm aanwezig is. Om cellen bilateraal in de frontale cortex te transfecteren, plaats de twee negatieve elektroden aan de zijkanten van het hoofd van het embryo, net lateraal en iets caudaal ten opzichte van de laterale ventrikels, en plaats de positieve elektrode tussen de ogen, net voor de zich ontwikkelende snuit. Zorg ervoor dat de embryo royaal bevochtigd is en breng vier vierkante pulsen aan.

Injecteer en elektroporeer alle embryo's, een voor een, zodat elk embryo onmiddellijk na de injectie van de DNA-oplossing wordt geelektroporeerd. Zodra alle embryo's zijn geelektroporeerd, steek de baarmoederhoorns voorzichtig terug in de buikholte. Bedek de buikholte met steriele PBS om de plaatsing van de baarmoederhoorn te vergemakkelijken.

Vul de buikholte met steriele PBS zodat er geen luchtzakken achterblijven nadat het naaien is voltooid. Naai de spier met absorberbare hechtdraad en de huid met zijde, niet-absorbeerbare hechtdraad. Laat de moeder zich volledig herstellen in een verwarmde kamer gedurende ten minste een uur.

Controleer de moeders regelmatig in de komende 48 uur. Terwijl de moeder zich herstelt van de anesthesie en bijkomt, zal ze beginnen met bewegen en vechten. Deze methode werd gebruikt om ongeveer 5.000 laag 2/3 piramide neuronen te transfecteren met de pCAG-GFP-plasmide.

De meeste van deze cellen waren gelokaliseerd in de frontale corticale gebieden. Een representatief voorbeeld toont de rostrale caudale verdeling van getransfecteerde neuronen in een volwassen controlemuis, wat de mogelijkheid van bilaterale IUE's bevestigt om grote populaties van piramide neuronen in de frontale cortex te targeten en genetisch te labelen. Het eerste deel van de maternale interactietaak test het vermogen van gecontroleerde P18 getransfecteerde muizen om nestbedden te vinden.

Controle muizen besteedden meer tijd aan het verkennen van hun nestbed dan aan het verkennen van vers bed, wat suggereert dat ze intacte sensorische motorische vaardigheden en verkenningsgedrag hebben. Het tweede deel van de taak maakt gebruik van de neiging van muizen om gemotiveerd te zijn om te communiceren met hun moeder. In deze taak brachten pups het grootste deel van hun tijd door in de buurt van hun moeder, terwijl ze aanzienlijk minder tijd besteedden aan het verkennen van de lege kom of het nestbed.

Volwassen controle muizen besteedden ongeveer 35% van de tijd aan het verkennen van een nieuw object. Wanneer gepresenteerd met een nieuw en een vertrouwd object, besteedden volwassen muizen meer tijd aan het verkennen van het nieuwe object. In de sociaalheidstaak besteedden controle volwassen muizen vergelijkbare hoeveelheden tijd aan het verkennen van een nieuwe muis en een lege kom.

Dit gedrag we