Gerichte echografie geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening voor het richten op hersenstructuren en het evalueren van chemogenetische neuromodulatie

Ons protocol maakt sub-millimeter nauwkeurige targeting van gerichte echografie bij muizen mogelijk. Het stelt ons in staat om echografie te targeten met behulp van goedkope 3D geprinte onderdelen zonder dat er chirurgische ingrepen of MRI-compatibele echografieapparatuur nodig zijn. Het openen van de bloed-hersenbarrière met behulp van gefocuste echografie kan in eerste instantie best lastig zijn.

Het is van cruciaal belang dat de transducer correct op het dier is aangesloten met behulp van ontgaste gel of water en dat de microbellen niet instorten tijdens de injectie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Richard Li, een afgestudeerde student aan Caltech. Na het bevestigen van een gebrek aan reactie op de pedaalreflex bij een verdoofde muis, gebruik 10 eenheden per milliliter heparine-zoutoplossing om een schone 25 tot 35 gauge katheter te wassen en gebruik een ethanolpad om de staart van het dier te desinfecteren.

Plaats de katheter in een laterale staartader en gebruik weefsellijm om de katheter op zijn plaats te bevestigen. Als de naald correct is geplaatst, zal een terugstroming van bloed in de katheter worden waargenomen. Wanneer de lijm is opgedroogd, verwijder het haar op het hoofd van het dier met ontharingscreme en plaats de muis in een 3D geprinte MRI-kar, waarbij de voortanden op een beetbalk worden gemonteerd met het hoofd binnen een neuskoker.

Bevestig de stompe staven aan de schedel met een veilige hoeveelheid druk en observeer de ademhaling gedurende 30 seconden om te bevestigen dat het dier vrij ademt met een snelheid van één adem per seconde. Verbind de targetgeleidering met de oorstaven en controleer de ademhaling opnieuw. Plaats de MRI-kar in een MRI-houder en plaats de houder in de boring van een magneet.

Vervolgens wordt een MRI-sequentie verkregen om de muis in de scanner te lokaliseren, met behulp van de 3D fast low angle shot sequentie om de hele hersenen te beeld te vormen. Om een MRI-gestuurde targeting uit te voeren, plaats de kar binnen een stereotactisch instrument en gebruik een metalen blok met dubbelzijdig plakband om de blok op zijn plaats te bevestigen tegen twee steunposten van het stereotactisch instrument. Breng de MRI-beelden over naar een computer met een draaiende geleide softwareprogramma voor gefocuste echografie en open de beelden.

Wanneer alle beelden zijn geladen, klik met de rechtermuisknop en klik op herformatteer om het beeld in drie assen te herformatteren. Klik met de rechtermuisknop om de transducer te lokaliseren naar de ronde targetinggeleidering. In de sagittale weergave, pas de verticale positie van de virtuele transducer aan om rekening te houden met de dikte van het waterbad en de transducerbehuizing.

Geef de gebieden aan die moeten worden getargeerd in de trajectplanner en noteer de coördinaten in een spreadsheet. Kies de gewenste diepte van de targeting en noteer de coördinaten zoals eerder gedemonstreerd. Klik vervolgens op traject verzenden en uitvoeren om elk van de punten te targeten.

Om de coördinaten van een MRI te correleren met het stereotactische frame, plaats de aangepaste gemonteerde transducer over een targetinggeleidering en vertaal totdat elk van de drie targetingbouten door zowel de transducerhouder als de targetinggeleidering kan gaan. Bevestig dat de bouten niet onder spanning of kantelen staan en vertaal de transducer 10,56 millimeter naar voren in de anterieure-posterieure richting totdat de transducer zich op het punt bevindt waar het centrum van een targetinggeleidering op de MRI verschijnt. Bepaal vervolgens de afstand van het centrum van de virtuele transducer tot het getargeteerde gebied en gebruik het frame om de transducer naar deze coördinaten te verplaatsen.

Om de injectieoplossing voor te bereiden, laad 800 microliter zoutoplossing en 100 microliter MRI-contrastmiddel in een 1,5 milliliter buis met mixen. Breng vervolgens een niet-geactiveerde microbellenoplossing op kamertemperatuur, voordat u de microbellen gedurende 45 seconden activeert in een microbellenactivatieapparaat. Na de activering, laad langzaam 100 microliter microbellen vanuit het midden van de oplossing in een tuberculine-spuit van één milliliter, uitgerust met een 21 gauge naald, en voeg 80 microliter van de microbellen toe aan de contrastmiddeloplossing.

Meng de bereide oplossing door de 1,5 milliliterbuis gedurende 15 seconden voorzichtig om te keren om drijfvermogen te voorkomen. Aan het einde van de menging, laad 200 microliter van de microbellenoplossing in een spuit zonder naald en keren de spuit om. Druk de zuiger in en trek deze terug om te mengen en bevestig een 30 gauge naald aan de spuit terwijl deze nog omgekeerd is.

Duwt vervolgens langzaam de microbellenoplossing uit totdat er druppels verschijnen aan het uiteinde van de naald. Zodra de microbellen klaar zijn, stel de pulsduur voor de insonaties in op 10 milliseconden, met 120 herhalingen per seconde, met 0,3 tot 0,45 mega pascals druk op de schedel. Verwijder de targetinggeleidering en breng ontgaste echografiegel aan op het hoofd van de muis, en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan.

Laat de transducer zakken totdat deze direct op het platte deel van de oorstaafhouder ligt en draai de coördinaten in op de stereotactische instrumenten. Verdun het adeno-geassocieerde virus van belang tot een concentratie van 0,5 tot 2 keer 10 tot de 10e virale deeltjes per gram lichaamsgewicht en laad de virusdeeltjes in een spuit van één milliliter, uitgerust met een 30 gauge naald. Injecteer de oplossing in de staarvenekatheter en injecteer 80 microliter van de microbellenoplossing in de muis.

Om de opening van de bloed-hersenbarrière door MRI te evalueren, neemt u een fast low angle shot-sequentie op zoals gedemonstreerd. Voor DREADD-stimulatie, lost u clozapine N-oxide op in steriele zoutoplossing met een concentratie van één milligram per milliliter en injecteert u deze intraperitoneal. 15 tot 45 minuten na levering, begint u met het opnemen van de gedragsactiviteit van het dier.

Voor neuronale activeringsanalyse, gebruik hersenweefsel. Volgend het protocol zoals gedemonstreerd, kan een T1 signaalversterking worden bereikt in het hippocampusgebied en in andere delen van de hersenen. Zoals waargenomen, leidt immunokleuring tegen mCherry tot een betrouwbaardere detectie van D