Name: Gerichte echografie geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening voor het richten op hersenstructuren en het evalueren van chemogenetische neuromodulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Leer hoe je met MRI-geleide gefocusseerde echografie de bloed-hersenbarrière opent in muizen voor gerichte gendelivery en chemogenetische neuromodulatie. Deze methode valideert DREADD-expressie via histologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd ondersteund door Brain and Behavior Foundation, NARSAD Young Investigator Award. Verschillende 3D-geprinte componenten zijn oorspronkelijk ontworpen door Fabien Rabusseau (Image Guided Therapy, Frankrijk). Auteur bedankt John Heath (Caltech) en Margaret Swift (Caltech) voor technische hulp bij het voorbereiden van het manuscript.

Geen belangenverstrengeling.

ATAC vereist een succesvolle implementatie van verschillende technieken voor succesvolle neuromodulatie van specifieke neurale circuits, waaronder nauwkeurige MRI-geleide targeting, FUS-BBBO en histologische evaluatie van genexpressie. 3D-printbare componenten zijn ontwikkeld om het richten op kleine hersenstructuren te vereenvoudigen met beeldgestuurde FUS-BBBO.
MRI-geleide gerichte echografie (MRIgFUS) toediening brengt een aantal uitdagingen met zich mee. Ten eerste heeft een typische MRI-spoel een beperkte ruimte die is ontworpen om alleen een monster te huisvesten en niet de echografiehardware. De grotere boringen van MRI's verhogen de kosten van apparatuur en verminderen de beeldkwaliteit, omdat het signaal gerelateerd is aan de vulfactor van een spoel32. Bijgevolg zal elke FUS-hardware die op de bovenkant van een dierbeeld in MRI wordt geplaatst, de beeldkwaliteit in gevaar brengen. Ten tweede is het ontwerpen van MRI-compatibele apparaten moeilijk en duur. MRI-compatibele materialen moeten diamagnetisch zijn, een lage neiging hebben om wervelstromen te creëren tijdens radiofrequente bestraling en een lage magnetische gevoeligheid hebben in hoge magnetische velden. In elk geleidend materiaal zal de creatie van wervelstromen of de magnetische gevoeligheid ervan ook de beeldkwaliteit negatief beïnvloeden. Ten slotte hebben de beschikbare MRI-compatibele materialen een lagere moduli en duurzaamheid van Young dan de metalen die doorgaans worden gebruikt bij de productie van nauwkeurige richtmachines, zoals stereotaxische frames. De motoren die worden gebruikt voor positieaanpassingen moeten MRI-compatibel zijn en vanwege hun grootte buiten de MRI-boring worden geplaatst. Deze motoren moeten op afstand worden aangesloten op de transducer in een MRI-boring met behulp van MRI-compatibele materialen. Problemen met plastic kromtrekken, gebrek aan voldoende ruimte in de boring om componenten van robuuste grootte te implementeren en onvoldoende ruimte voor het veranderen van richtposities in de hele hersenen hebben de targetingnauwkeurigheid in eerder werk beïnvloed.
Om deze problemen op te lossen, werd besloten om beeldvorming uit te voeren in MRI en FUS-BBBO toediening buiten de scanner. Om MRI-begeleiding mogelijk te maken, werden muizen in een 3D-geprinte beperking geplaatst met een MRI-zichtbare richtgids die kon worden gebruikt om de hersenstructuren van de muis te lokaliseren, zowel in de MRI als in de stereotaxcoördinatenruimte. Omdat zowel de muizenschedel als de richtgeleider stevig zijn bevestigd aan oorbalkhouders (figuur 1a,b), kan een richtgids worden gebruikt om ruimtelijke coördinaten binnen het MRI-beeld te correleren en de stereotaxische instrumenten nul te zetten. Het beveiligingssysteem heeft geen bewegende delen en bevat geen transducer, waardoor we het zowel robuust als voldoende klein konden maken om in een MRI te passen en signaalinterferentie van de elektronica van de transducer konden verwijderen. De ruimte in de richtgeleider is uitgehold omdat de 3D-geprinte ondersteuning voor sommige materialen zichtbaar is in MRI (figuur 1c). Er werden gaten in de assemblage aangebracht om stereotaxiskalibratie mogelijk te maken (figuur 3). De ultrasone transducer werd bevestigd aan een elektrodehouder van een stereotaxis en de targeting werd uitgevoerd zoals beschreven in rubriek 4 (figuur 1d). De transducer moet over de lengte worden ondersteund door de behuizing van oorbalken, waardoor elke afwijking van het vlakke vlak wordt voorkomen. De targeting in de dorso-ventrale richting kan worden bereikt met behulp van faseverschuivingen in een ringvormige array.
De praktische richtprecisie wordt bepaald door ultrasone scherpstelling en schedelverzwakking. De FUS-BBBO-procedure is in detail beschreven voor ratten 11 en is geïmplementeerd in een aantal andere modelorganismen23,33,34 en bij mensen 16,17. De relatie tussen ultrasone focusgrootte omgekeerd evenredig met frequentie, waarbij hogere frequenties kunnen resulteren in een nauwkeurigere afgifte. De verzwakking van de schedel neemt echter toe met frequenties35, wat kan leiden tot schedelverwarming en schade aan de corticale gebieden. De exacte targetingstrategie hangt af van de hersensite. De plaatsen waar een halve maximale druk over de volledige breedte in het hersenweefsel past, zorgen voor een voorspelbare en veilige BBB-opening in veel hersenstructuren zoals het striatum, de middenhersenen en de hippocampus. Regio's in de buurt van de basis van de hersenen vormen een specifieke uitdaging bij muizen. Muishersenen meten ongeveer 8-10 mm in dorso-ventrale richting, wat vergelijkbaar is met de volledige breedte halve maximale grootte van veel in de handel verkrijgbare transducers. Bijgevolg kan het richten op de bodem van de schedel leiden tot ultrasone reflectie van de botten en lucht die aanwezig zijn in gehoorgangen, mond of luchtpijp, wat kan leiden tot onvoorspelbare patronen van hoge en lage druk36. Sommige van deze drukken kunnen een traagheidscavitatiedrempel overschrijden waarvan is aangetoond dat deze bloedingen en weefselbeschadiging veroorzaakt37. Om gebieden te targeten die zich in de buurt van de schedelbasis bevinden, kan het de voorkeur hebben om intersectionele ATAC7 te gebruiken, waarbij intersectionele genetica38 wordt gebruikt om genexpressie te beperken tot een kleiner gebied dan het gebied dat is gericht met FUS-bundel. In het gepubliceerde voorbeeld van intersectionele ATAC is een transgeen dier dat een genbewerkingsenzym (Cre38) tot expressie brengt in dopaminerge cellen het doelwit geweest van echografie in de subsectie van het gebied dat dopaminerge cellen bevat. Ten slotte kunnen de corticale gebieden worden gericht met FUS, maar de diffractie en reflectie van echografie kan optreden en leiden tot ongelijke drukprofielen. Dit protocol heeft geen betrekking op de targeting van corticale gebieden, omdat dit sterk afhankelijk zal zijn van de gebruikte soorten; er is echter enige gerichtheid van de cortex boven hippocampus 7 (bijv. Figuur 7) waargenomen, wat aangeeft dat dit, althans bij muizen, mogelijk is.
De keuze van een chemogenetische activator en dosering zal afhangen van de specifieke experimentele behoeften. Een aantal studies, waaronder een van de studies van de auteurs7, toonden geen significante niet-specifieke respons39,40, terwijl hogere doses (bijv. 10 mg / kg) bijwerkingen kunnen veroorzaken, althans in sommige gevallen41. Zoals bij alle gedragsexperimenten zijn goede controles31 echter essentieel vanwege mogelijke off-gerichte activiteit van CNO en zijn metabolieten42. Dergelijke controles kunnen bestaan uit toediening van CNO- en zoutoplossingscontroles aan dieren die DREADDs tot expressie brengen en toediening van CNO aan dieren van het wilde type of in sommige specifieke gevallen een vergelijking van ipsi- en contralaterale plaatsen van de hersenen die respectievelijk wel en geen chemogenetische receptoren tot expressie brengen. Bovendien onthulde recent onderzoek een aantal nieuwe DREADD-agonisten met verbeterde specificiteit28,29,43. Andere chemogenetische receptoren 5,25,44 kunnen ook worden gebruikt in combinatie met de ATAC-procedure.
Histologische evaluatie van genexpressie is post-mortem noodzakelijk voor elk dier. Een klein deel van de dieren vertoont een slechte genexpressie na FUS-BBBO7. Bovendien is het noodzakelijk om de ruimtelijke nauwkeurigheid en specificiteit van genexpressie aan te tonen, omdat mis-targeting mogelijk is. Van belang is dat sommige AAV's retrograde of anterograde traceringsvermogen45 kunnen vertonen en transfectie kunnen veroorzaken ver van de site die met echografie is gericht, ondanks nauwkeurige ultrasone targeting. Als de tot expressie gebrachte chemogenetische receptor is gefuseerd met of co-expressie brengt met een fluorofoor, kan beeldvorming van de fluorofoor in weefselsecties voldoende zijn om de lokalisatie en intensiteit van expressie te evalueren. Veel fluorescerende eiwitten worden echter beschadigd door het weefselfixatieproces en immunostaining voor mCherry-eiwit dat vaak wordt gebruikt met DREADDs leverde een beter signaal op in eerdere studies7. Ten slotte, vanwege de dichtheid van neuronen in bepaalde delen van de hersenen (bijv. Granulaire cellaag in hippocampus), kan het gebruik van nucleair gelokaliseerde fluoroforen uitgedrukt onder IRES, in tegenstelling tot fusies, om celtellingen uit te voeren, gunstig zijn, omdat kernen gemakkelijk kunnen worden gesegmenteerd en tegengekleurd met nucleaire vlekken, zoals DAPI of TO-PRO-3. Om neuromodulatie door c-Fos-kleuring te evalueren, is het uitvoeren van nucleaire tegenkleuring en het tellen van c-Fos-positieve kernen, in plaats van een fluorescentiesignaal, noodzakelijk. In sommige gevallen kan cellulair puin fluorescentie vertonen en de metingen van positieve cellen verstoren.
Beperkingen van het geneesmiddel en de genafgifte met FUS-BBBO omvatten een lagere resolutie dan toediening met invasieve intracraniële injecties en de behoefte aan grotere hoeveelheden geïnjecteerde geneesmiddelen of virale vectoren. Bovendien, terwijl een directe injectie in de hersenen resulteert in exclusieve toediening aan een geïnjecteerde plaats, gebruikt FUS-BBBO een intraveneuze route die resulteert in mogelijke levering aan perifere weefsels. Beperkingen van het gebruik van chemogenetica voor neuromodulatie omvatten een langzame tijdschaal, die ontoereikend kan zijn voor sommige gedragsprotocollen die snelle veranderingen in de intensiteit van neuromodulatie vereisen.

Het gebruik van circuitspecifieke neuromodulatietechnologieën, zoals optogenetica1,2 en chemogenetica 3,4,5, heeft ons begrip van psychiatrische aandoeningen als neuronale circuitstoornissen verbeterd. Neuronale circuits zijn moeilijk te bestuderen en nog moeilijker te beheersen bij de behandeling van hersenaandoeningen omdat ze meestal worden gedefinieerd door specifieke celtypen, hersengebieden, moleculaire signaalroutes en timing van activering. Idealiter voor zowel onderzoek als klinische toepassingen zou een dergelijke controle niet-invasief worden uitgeoefend, maar het bereiken van zowel nauwkeurige als niet-invasieve neuromodulatie is een uitdaging. Bijvoorbeeld, terwijl neuroactieve geneesmiddelen de hersenen niet-invasief kunnen bereiken, missen ze ruimtelijke specificiteit door in de hersenen te werken. Aan de andere kant kan elektrische diepe hersenstimulatie specifieke hersengebieden beheersen, maar heeft het moeite met het beheersen van specifieke celtypen en vereist het een operatie en plaatsing van het apparaat6.
Acoustically Targeted Chemogenetics7 (ATAC) biedt neuromodulatie met ruimtelijke, celtype en temporele specificiteit. Het combineert drie technieken: gerichte echografie geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening (FUS-BBBO) voor ruimtelijke targeting, gebruik van adeno-geassocieerde virale vectoren (AAV's) om niet-invasieve genen af te leveren onder controle van celtypespecifieke promotors, en gemanipuleerde chemogenetische receptoren om getransfecteerde neurale circuits selectief te moduleren via toediening van geneesmiddelen. FUS is een door de FDA goedgekeurde technologie die gebruik maakt van het vermogen van echografie om diep in weefsels, inclusief het menselijk brein, met millimeter ruimtelijke precisie te focussen. Bij hoog vermogen wordt FUS gebruikt voor niet-invasieve gerichte ablatie, inclusief een door de FDA goedgekeurde behandeling voor essentiële tremor8. FUS-BBBO combineert echografie met lage intensiteit met systemisch toegediende microbubbels, die oscilleren in bloedvaten bij de ultrasone focus, wat resulteert in gelokaliseerde, tijdelijke (6-24 uur) en omkeerbare opening van de BBB9. Deze opening zorgt voor de afgifte van eiwitten 9,10, kleine moleculen11 en virale vectoren7,12,13,14 aan de hersenen zonder significante weefselschade bij knaagdieren 10 en niet-menselijke primaten 15. Klinische studies zijn aan de gang voor FUS-BBBO16,17, wat wijst op mogelijke therapeutische toepassingen van deze techniek.
Virale genafgifte met behulp van AAV vordert ook snel in klinisch gebruik voor CZS-aandoeningen, met recente FDA- en EU-wettelijke goedkeuringen als belangrijke mijlpalen. Ten slotte worden chemogenetische receptoren18, zoals Designer Receptors Activated Exclusively by Designer Drugs (DREADDs), veel gebruikt door neurowetenschappers om farmacologische controle te bieden over neuronale excitatie bij transgene of getransfecteerde dieren19,20. DREADDs zijn G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) die genetisch zijn gemanipuleerd om te reageren op synthetische chemogenetische moleculen in plaats van endogene liganden, zodat systemische toediening van deze liganden de prikkelbaarheid van DREADD-tot expressie brengende neuronen verhoogt of vermindert. Wanneer deze drie technologieën worden gecombineerd in ATAC, kunnen ze worden gebruikt voor de niet-invasieve modulatie van geselecteerde neurale circuits met ruimtelijke, celtype en temporele precisie.
Hier breiden we een eerder gepubliceerd protocol voor FUS-BBBO11 uit en werken we dit bij door een methodologie op te nemen voor het nauwkeurig richten van hersengebieden met FUS-BBBO in muizen met behulp van eenvoudige 3D-geprinte targetingapparatuur. We tonen ook een toepassing van FUS-BBBO op ATAC. We tonen stappen die nodig zijn voor de levering van AAV's met chemogenetische receptoren en evaluatie van genexpressie en neuromodulatie door histologie. Deze techniek is met name toepasbaar voor het richten op grote of meerdere hersengebieden voor genexpressie of neuromodulatie. Een groot gebied van een cortex kan bijvoorbeeld gemakkelijk worden getransduceerd met FUS-BBBO en gemoduleerd met behulp van chemogenetica. Genafgifte met een alternatieve techniek, intracraniële injecties, zou echter een groot aantal invasieve injecties en craniotomieën vereisen. FUS-BBBO en de toepassing ervan, ATAC, kunnen worden geschaald naar dieren van verschillende groottes, waar hersengebieden groter zijn en moeilijker invasief te richten.

<table><tbody><tr><td>21-gauge naalden (BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14826C</td><td></td></tr><tr><td>25-gauge butterflykatheter</td><td>Harvard Bioscience</td><td>725966</td><td></td></tr><tr><td>30-gauge naalden (BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14826F</td><td></td></tr><tr><td>Absorbtieblauwe pad</td><td>Office Depot</td><td>902406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-Fos antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-253-G</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mCherry antilichaam</td><td>Thermofisher</td><td>PA534974</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Biospec 70/30</td><td>Bruker</td><td>custom</td><td>omvat de RF-spoelen</td></tr><tr><td>Clozapine-n-oxide</td><td>Tocris</td><td>4936</td><td></td></tr><tr><td>Op maat gemaakte 3D-geprinte muisharnassen en MRIgFUS-richtcomponenten</td><td>ImageGuidedTherapy, Szablowski lab</td><td>custom</td><td>downloaden van szablowskilab.org/downloads</td></tr><tr><td>Op maat gemaakte MRIgFUS-machine</td><td>ImageGuidedTherapy</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Definity microbubbels</td><td>Lantheus</td><td>DE4</td><td></td></tr><tr><td>Ontgast aquasonic/echografiegel</td><td>Fisher Scientific</td><td>5067714</td><td></td></tr><tr><td>Ontharingscrème</td><td>Nair</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Acht-elementen annulaire array transducer</td><td>Imasonic Inc.</td><td>custom</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol Pads/Alcohol Swabs (70%) (BD)</td><td>Office Depot</td><td>599893</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-890-8598</td><td></td></tr><tr><td>Neutraal gebufferde formaline (10%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Optische vezel hydrofoon</td><td>Precision Acoustics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE10 slang</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1513314</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferd zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>524650-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Prohance contrastmiddel</td><td>Bracco</td><td>0270-1111-04</td><td></td></tr><tr><td>Zoutenoplossing</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9054335</td><td></td></tr><tr><td>Secundair antilichaam, Ezel-anti geit</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Secundair antilichaam, Ezel-anti konijn</td><td>ThermoFisher</td><td>84546</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische schaar (recht)</td><td>Fisher Scientific</td><td>17467480</td><td></td></tr><tr><td>ThermoGuide Software</td><td>ImageGuidedTherapy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Weefsel lijm (Gluture)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9855218</td><td></td></tr><tr><td>Tuberculinese spuit (1 mL) (BD)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14823434</td><td></td></tr><tr><td>VeroClear 3D printbaar materiaal</td><td>Stratasys</td><td>RGD810</td><td></td></tr><tr><td>Vialmix microbubbel activeringsapparaat</td><td>Lantheus</td><td>VMIX</td><td></td></tr><tr><td>Trillende microtoom</td><td>Compresstome</td><td>VF-300</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X1251-1G</td><td></td></tr></tbody></table>

gerichte echografie geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening voor het richten op hersenstructuren en het evalueren van chemogenetische neuromodulatie

Focused Ultrasound Induced Blood-Brain Barrier Opening for Targeting Brain Structures and Evaluating Chemogenetic Neuromodulation

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) maakt de niet-invasieve controle van specifieke neurale circuits mogelijk. ATAC bereikt een dergelijke controle door een combinatie van gerichte echografie (FUS) geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening (FUS-BBBO), genafgifte met adeno-geassocieerde virale (AAV) vectoren en activering van cellulaire signalering met gemanipuleerde, chemogenetische, eiwitreceptoren en hun verwante liganden. Met ATAC is het mogelijk om zowel grote als kleine hersengebieden met millimeterprecisie te transduceren met behulp van een enkele niet-invasieve ultrasone toepassing. Deze transductie kan later een langdurige, niet-invasieve, apparaatvrije neuromodulatie mogelijk maken bij vrij bewegende dieren die een medicijn gebruiken. Aangezien FUS-BBBO, AAV's en chemogenetica bij meerdere dieren zijn gebruikt, moet ATAC ook schaalbaar zijn voor gebruik bij andere diersoorten. Dit artikel borduurt voort op een eerder gepubliceerd protocol en schetst hoe de genafgifte met FUS-BBBO naar kleine hersengebieden kan worden geoptimaliseerd met MRI-begeleiding, maar zonder dat een gecompliceerd MRI-compatibel FUS-apparaat nodig is. Het protocol beschrijft ook het ontwerp van muisgerichte en fixatiecomponenten die door elk laboratorium kunnen worden 3D-geprint en gemakkelijk kunnen worden aangepast voor verschillende soorten of aangepaste apparatuur. Om de reproduceerbaarheid te bevorderen, beschrijft het protocol in detail hoe de microbubbels, AAV's en venapunctie werden gebruikt bij de ontwikkeling van ATAC. Ten slotte worden voorbeeldgegevens getoond die de vooronderzoeken van studies met ATAC begeleiden.

De eerste stap van het uitvoeren van het ATAC-protocol is het richten van de FUS-BBBO op de gewenste hersengebieden. Volgens het beschreven protocol werd de hippocampus bijvoorbeeld aangevallen met FUS-BBBO en werden contrastmiddel en AAV9 met DREADDs in de muizen geïnjecteerd, gevolgd door een FLASH 3D MRI-sequentie die beelden van het muizenbrein verwerft. Een T1-signaalversterking werd bereikt in het hippocampusgebied (figuur 6) en in andere delen van de hersenen (figuur 7). Na enkele weken werden DREADDs uitgedrukt in het doelhersengebied. Hoewel veel DREADD's zijn gefuseerd met een fluorescerende reporter (bijv. mCherry), bleek het proces van perfusie en fixatie met formaldehyde de fluorescentie van deze eiwitten drastisch te verminderen. Immunostaining tegen mCherry of de DREADD leidde tot een betrouwbaardere detectie van de expressie (figuur 8) op basis van eerdere ervaringen. In eerdere experimenten vertoonde ~ 85% van de muizen expressie na FUS-BBBO7. Een eenvoudige test voor voldoende expressieniveaus van DREADDs is het testen van hun functionaliteit op cellulair niveau. Het kan bijvoorbeeld worden gedaan door een chemogenetische ligand of een zoutoplossingcontrole te geven, zoals CNO 19, deschloroclozapine28 of anderen29, en 2 uur te wachten voor een hartperfusie en fixatie. De hersensecties werden vervolgens co-immunogekleurd voor c-Fos-eiwit30, wat wijst op verhoogde activiteit van neuronen, en voor DREADD. Het experiment werd als succesvol beschouwd, als de plaats van de hersenen gericht op DREADDs een significant hoger aantal neuronale kernen vertoonde die c-Fos-positief zijn in de groep die een chemogenetisch ligand ontving in vergelijking met de groep die zoutoplossing7 ontving of vergeleken met een contralaterale site die niet werd onderworpen aan FUS-BBBO. Van belang is dat er een potentieel is voor sommige van deze liganden om neuronen niet-specifiek te activeren zonder expressie van DREADDs. Van CNO is bijvoorbeeld aangetoond dat het wordt gemetaboliseerd tot lage niveaus van clozapine bij muizen, die de BBB kruist en DREADDs met een hoge potentie activeert27. Er werd echter ook aangetoond dat het zich bindt aan niet-specifieke locaties. Zoals in elk experiment is het van cruciaal belang om alle juiste controles op te nemen in chemogenetische studies31. Een mogelijke controle is toediening van het chemogenetische ligand aan wildtype muizen, zonder procedures, om effecten van het medicijn alleen op de gewenste gedrags- of histologische test uit te sluiten. Een andere controle zou de opname van vier groepen kunnen zijn: DREADD + ligand, DREADD + voertuig, EGFP + ligand, EGFP + voertuig, die rekening houden met mogelijke effecten van zowel genafgifte met FUS-BBBO als de chemogenetische ligand.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig1.jpg"> Figuur 1: Het proces van MRI-geleide targeting van FUS in ATAC. (a) Muisplaatsing met oorbalken, een neuskegel en een platform dat in een MRI-scanner kan worden geplaatst. (b) Een 3D-geprinte gids (blauw) die zichtbaar is in MRI werd bevestigd aan de uiteinden van het oorbalkframe en vervolgens op zijn plaats bevestigd met een houder van een oppervlakte-MRI-spoel die vier klikbouten bevat (semi-transparant blauw). c) Weergave van de 3D-geprinte gids in sagittale MRI (linkerpaneel), met een onderkant van de virtuele weergave van een transducer uitgelijnd (gele halve cirkel) met de onderkant van de geleider. Het rechterpaneel toont het uiterlijk van de 3D-geprinte gids op MRI vanuit coronale weergave. De heldere cirkel is gemaakt van een polyjet ondersteuningsmateriaal dat een sterk MRI-contrast heeft. Het kruis was gevormd met plastic. Een gele cirkel vertegenwoordigt de locatie van de transducer die concentrisch was uitgelijnd met de geleider in een stereotaxisch frame. (d) Om hersenstructuren te targeten, werd een virtuele transducer in z-richting boven de muizen verplaatst om overeen te komen met de dikte van een ultrasone kegel / behuizing. In dit geval werd de transducer vanwege de dikte van het waterbad 8,2 mm boven de geleider verplaatst voor nauwkeurige targeting. Hersenstructuren werden geselecteerd met behulp van MRI-beeldvormingsgegevens en hun MRI-coördinaten werden vervolgens opgeschreven en ingevoerd in de stereotaxische machine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig2.jpg"> Figuur 2: Interface van de gebruikte software. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig3.jpg"> Figuur 3: Proces van het matchen van MRI-coördinaatruimte met stereotaxisch instrument. (a) Drie gaten in een transducerhouder werden uitgelijnd met drie gaten in de MRI-geleider en drie conische richtbouten werden ingebracht zonder buiging aan de hele assemblage te veroorzaken. (b) Idealiter zouden alle drie de bouten in het midden van de gaten zitten. c) Als er een onnauwkeurigheid is in de uitlijning, zouden niet alle drie de bouten erin passen, bijvoorbeeld in het geval van een kleine, waarschijnlijk onmerkbare geeuw van 1°, zou er slechts één bout in passen, terwijl de tegenovergestelde bouten aan de MRI-geleider zouden vastzitten. Als alternatief kon er zichtbare flex van de hele assemblage zijn als bouten werden doorgedrukt. d) Verruimde weergave van de boutfitting. De bouten moeten concentrisch worden geplaatst voor de beste nauwkeurigheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig4.jpg"> Figuur 4: Snelle herverdeling van microbubbels in de spuit. (a) De spuit werd 5 s na het mengen gefotografeerd. b) Een minuut later was er een duidelijk zichtbare laag met een deel van het bellenconcentraat aan de bovenkant van 1 ml tuberculinespuit. Met name in dit voorbeeld werd een oplossing van microbubbels gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig5.jpg"> Figuur 5: Proces van het plaatsen van het midden van een transducer over een midden van een MRI-gids. a) In de in dit document getoonde modellen is de rode drager ontworpen om 10,56 mm naar voren te bewegen van de positie in figuur 3b naar de hier afgebeelde positie. (b) De blauwe MRI-gids werd vóór de ultrasoonapparaat verwijderd en een ultrasone gel werd aangebracht tussen de muis en de transducer (oranje) om ultrasone passage te garanderen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig6.jpg"> Figuur 6: MRI-visualisatie van de BBB-opening. a) Axiale weergave van de BBB-opening. Helderder gebied aangeduid met een pijlpunt toont extravasatie van een MRI T1-contrastmiddel . (b) Coronale weergave van de dorsale hippocampus en de cortex boven de hippocampus gericht met FUS-BBBO (pijlpunten). c) Coronale weergave van de centrale hippocampus gericht met FUS-BBBO (pijlpunten). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig7.jpg"> Figuur 7: Voorbeeld van targeting van 4 hersensites met behulp van het driebouts targetingsysteem dat in dit artikel wordt beschreven. Gebieden met pijlpunten toonden BBB geopende plaatsen met diffusie van een MRI-contrastmiddel. De vier sites werden achtereenvolgens getarget, met ~ 150 s tussen elke BBB-opening, van onder naar boven. De foto is genomen binnen 2 minuten na de laatste BBB opening. Schaalbalk is 2 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61352/61352fig8.jpg"> Figuur 8: Detectie van DREADD-expressie.  a) Immunokleuring voor de fluorofoor die aan DREADD's is bevestigd, in dit geval was mCherry in sommige onderzoeken een betrouwbare detectiemethode. b) In een ander representatief gedeelte met DREADD's gericht op de hippocampus onder dezelfde omstandigheden als onder a), produceerde de fluorescentie van mCherry op zichzelf een sterke achtergrond en een relatief zwak signaal. c) Als negatieve controle werd een muis gebruikt die een systemische injectie met AAV kreeg, maar geen FUS-BBBO onderging. Er kan geen significante expressie worden gevonden door mCherry immunostaining. Schaalstaven zijn 500 mm. (Gegevens in a, c aangepast van7 met machtigingen, Copyright 2020 Nature-Springer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61352/61352fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft stappen die nodig zijn voor de genafgifte door middel van gerichte ultrasone bloed-hersenbarrière (BBB) opening, evaluatie van de resulterende genexpressie en meting van neuromodulatie-activiteit van chemogenetische receptoren door middel van histologische tests.

Gerichte echografie geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening voor het richten op hersenstructuren en het evalueren van chemogenetische neuromodulatie

Acoustically Targeted Chemogenetics (ATAC) allows for the noninvasive control of specific neural circuits. ATAC achieves such control through a ...

Ons protocol maakt sub-millimeter nauwkeurige targeting van gerichte echografie bij muizen mogelijk. Het stelt ons in staat om echografie te targeten met behulp van goedkope 3D geprinte onderdelen zonder dat er chirurgische ingrepen of MRI-compatibele echografieapparatuur nodig zijn. Het openen van de bloed-hersenbarrière met behulp van gefocuste echografie kan in eerste instantie best lastig zijn.Het is van cruciaal belang dat de transducer correct op het dier is aangesloten met behulp van ontgaste gel of water en dat de microbellen niet instorten tijdens de injectie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Richard Li, een afgestudeerde student aan Caltech. Na het bevestigen van een gebrek aan reactie op de pedaalreflex bij een verdoofde muis, gebruik 10 eenheden per milliliter heparine-zoutoplossing om een schone 25 tot 35 gauge katheter te wassen en gebruik een ethanolpad om de staart van het dier te desinfecteren.Plaats de katheter in een laterale staartader en gebruik weefsellijm om de katheter op zijn plaats te bevestigen. Als de naald correct is geplaatst, zal een terugstroming van bloed in de katheter worden waargenomen. Wanneer de lijm is opgedroogd, verwijder het haar op het hoofd van het dier met ontharingscreme en plaats de muis in een 3D geprinte MRI-kar, waarbij de voortanden op een beetbalk worden gemonteerd met het hoofd binnen een neuskoker.Bevestig de stompe staven aan de schedel met een veilige hoeveelheid druk en observeer de ademhaling gedurende 30 seconden om te bevestigen dat het dier vrij ademt met een snelheid van één adem per seconde. Verbind de targetgeleidering met de oorstaven en controleer de ademhaling opnieuw. Plaats de MRI-kar in een MRI-houder en plaats de houder in de boring van een magneet.Vervolgens wordt een MRI-sequentie verkregen om de muis in de scanner te lokaliseren, met behulp van de 3D fast low angle shot sequentie om de hele hersenen te beeld te vormen. Om een MRI-gestuurde targeting uit te voeren, plaats de kar binnen een stereotactisch instrument en gebruik een metalen blok met dubbelzijdig plakband om de blok op zijn plaats te bevestigen tegen twee steunposten van het stereotactisch instrument. Breng de MRI-beelden over naar een computer met een draaiende geleide softwareprogramma voor gefocuste echografie en open de beelden.Wanneer alle beelden zijn geladen, klik met de rechtermuisknop en klik op herformatteer om het beeld in drie assen te herformatteren. Klik met de rechtermuisknop om de transducer te lokaliseren naar de ronde targetinggeleidering. In de sagittale weergave, pas de verticale positie van de virtuele transducer aan om rekening te houden met de dikte van het waterbad en de transducerbehuizing.Geef de gebieden aan die moeten worden getargeerd in de trajectplanner en noteer de coördinaten in een spreadsheet. Kies de gewenste diepte van de targeting en noteer de coördinaten zoals eerder gedemonstreerd. Klik vervolgens op traject verzenden en uitvoeren om elk van de punten te targeten.Om de coördinaten van een MRI te correleren met het stereotactische frame, plaats de aangepaste gemonteerde transducer over een targetinggeleidering en vertaal totdat elk van de drie targetingbouten door zowel de transducerhouder als de targetinggeleidering kan gaan. Bevestig dat de bouten niet onder spanning of kantelen staan en vertaal de transducer 10,56 millimeter naar voren in de anterieure-posterieure richting totdat de transducer zich op het punt bevindt waar het centrum van een targetinggeleidering op de MRI verschijnt. Bepaal vervolgens de afstand van het centrum van de virtuele transducer tot het getargeteerde gebied en gebruik het frame om de transducer naar deze coördinaten te verplaatsen.Om de injectieoplossing voor te bereiden, laad 800 microliter zoutoplossing en 100 microliter MRI-contrastmiddel in een 1,5 milliliter buis met mixen. Breng vervolgens een niet-geactiveerde microbellenoplossing op kamertemperatuur, voordat u de microbellen gedurende 45 seconden activeert in een microbellenactivatieapparaat. Na de activering, laad langzaam 100 microliter microbellen vanuit het midden van de oplossing in een tuberculine-spuit van één milliliter, uitgerust met een 21 gauge naald, en voeg 80 microliter van de microbellen toe aan de contrastmiddeloplossing.Meng de bereide oplossing door de 1,5 milliliterbuis gedurende 15 seconden voorzichtig om te keren om drijfvermogen te voorkomen. Aan het einde van de menging, laad 200 microliter van de microbellenoplossing in een spuit zonder naald en keren de spuit om. Druk de zuiger in en trek deze terug om te mengen en bevestig een 30 gauge naald aan de spuit terwijl deze nog omgekeerd is.Duwt vervolgens langzaam de microbellenoplossing uit totdat er druppels verschijnen aan het uiteinde van de naald. Zodra de microbellen klaar zijn, stel de pulsduur voor de insonaties in op 10 milliseconden, met 120 herhalingen per seconde, met 0,3 tot 0,45 mega pascals druk op de schedel. Verwijder de targetinggeleidering en breng ontgaste echografiegel aan op het hoofd van de muis, en zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan.Laat de transducer zakken totdat deze direct op het platte deel van de oorstaafhouder ligt en draai de coördinaten in op de stereotactische instrumenten. Verdun het adeno-geassocieerde virus van belang tot een concentratie van 0,5 tot 2 keer 10 tot de 10e virale deeltjes per gram lichaamsgewicht en laad de virusdeeltjes in een spuit van één milliliter, uitgerust met een 30 gauge naald. Injecteer de oplossing in de staarvenekatheter en injecteer 80 microliter van de microbellenoplossing in de muis.Om de opening van de bloed-hersenbarrière door MRI te evalueren, neemt u een fast low angle shot-sequentie op zoals gedemonstreerd. Voor DREADD-stimulatie, lost u clozapine N-oxide op in steriele zoutoplossing met een concentratie van één milligram per milliliter en injecteert u deze intraperitoneal. 15 tot 45 minuten na levering, begint u met het opnemen van de gedragsactiviteit van het dier.Voor neuronale activeringsanalyse, gebruik hersenweefsel. Volgend het protocol zoals gedemonstreerd, kan een T1 signaalversterking worden bereikt in het hippocampusgebied en in andere delen van de hersenen. Zoals waargenomen, leidt immunokleuring tegen mCherry tot een betrouwbaardere detectie van D

focused-ultrasound-induced-blood-brain-barrier-opening-for-targeting

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Insonation van microbellen is een veelbelovende strategie voor tumor ablatie op kortere gemiddelde akoestische bevoegdheden, alsmede voor de gerichte toediening van geneesmiddelen. Het doel van deze studie is het ontwikkelen van low duty cycle echografie pulserende strategieën en nanocarriers aan niet-thermische microvasculair ablatie en laadvermogen levering aan subcutane C6 glioma te maximaliseren.

Contrast Echografie doelgerichte behandeling van gliomen in Muizen via Drug-Bearing Nanodeeltje Levering en microvasculaire Ablation

Microbellen-gemedieerde focused ultrasound verstoring van de bloed-hersen barrière (BBB) ​​is een veelbelovende techniek voor niet-invasieve gerichte toediening van medicijnen in de...

MRI-geleide Verstoring van de bloed-hersen barrière met behulp van Transcraniële Focused Ultrasound in een ratmodel

This video describes a method of temporarily disrupting the blood-brain barrier (BBB) by creating transient openings using microbubble-mediated focused ultrasound (FUS). These transient local BBB openings can eventually be used to deliver larger-sized drug molecules directly into the brain parenchyma.

Focus Ultrasound Based Microbubble Mediated Blood-Brain Barrier Opening: A Technique to Create Localized Transient Openings in Blood-Brain Barrier of Mouse by Sonoporation

Gerichte echografie met microbubble-middelen kan de bloed-hersenbarrière focal en voorbijgaand openen. Deze techniek is gebruikt om een breed scala aan middelen over de bloed-hersenbarrière te leveren. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor de gelokaliseerde levering aan de knaagdierhersenen met of zonder MRI-begeleiding.

Een benchtop benadering van de locatie specifieke bloed hersenbarrière opening met behulp van gerichte echografie in een rat model

De bloed-hersenbarrière (BBB) kan tijdelijk worden verstoord met microbubble-gemedieerde gerichte echografie (FUS). Hier beschrijven we een stapsgewijs protocol voor BBB-opening met hoge doorvoer in vivo met behulp van een modulair FUS-systeem dat toegankelijk is voor niet-echografie-experts.

Een high-throughput beeldgeleide stereotactische neuronavigatie en gericht echografiesysteem voor het openen van bloed - hersenbarrière bij knaagdieren

Hier wordt een protocol gepresenteerd om de bloed-hersenbarrière (BBB) tijdelijk te openen, hetzij focale of door een muizenbrein om fluorescerend gelabelde antilichamen af te leveren en microglia te activeren. Ook gepresenteerd is een methode om de afgifte van antilichamen en microglia-activering door histologie te detecteren.

Levering van antilichamen in de hersenen met behulp van gerichte scanning echografie

Dit protocol beschrijft de chirurgische en technische procedures die real-time in vivo multifotonenfluorescentiebeeldvorming van de knaagdierhersenen mogelijk maken tijdens gerichte echografie en microbubbelbehandelingen om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te verhogen.

Real-time intravitale multifotonenmicroscopie om gerichte echografie en microbubbelbehandelingen te visualiseren om de permeabiliteit van de bloed-hersenbarrière te vergroten

Deze studie beschrijft een gecombineerd protocol van magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en laag-intensiteit gepulseerde gerichte ultrasone golf (FUS), gebruikmakend van levende ratten met katheterisatie van de halsader om de opening van de bloed-hersenbarrière (BBB) te monitoren.

Monitoring van de bloed-hersenbarrièreopening bij ratten met een preklinisch gerichte echografiesysteem

Wordt een techniek beschreven voor het in grote lijnen het openen van de bloed-hersen barrière in de muis met behulp van microbellen en ultrageluid. Met deze techniek kan mangaan worden toegediend aan de hersenen van muizen. Omdat mangaan is een MRI-contrastmiddel dat zich ophoopt in gedepolariseerd neuronen, deze aanpak maakt beeldvorming van neuronale activiteit.

Functionele neuroimaging Met behulp van ultrasone bloed-hersen barrière verstoring en mangaan-enhanced MRI

In deze studie presenteren wij een gemakkelijke en efficiënte procedure voor de beoordeling van de verstoring van de bloed - hersenbarrière neurodegeneratieve omstandigheden. Onze om doel te bereiken, we geïnfundeerd ultrahoog moleculair gewicht fluoresceïne isothiocyanaat geëtiketteerd (FITC)-albumine in muis jugular ader en de lekkage in de hersenen parenchym door fluorescentie microscopie geëvalueerd.

Beoordeling van de bloed - hersenbarrière permeabiliteit door intraveneuze infusie van FITC-geëtiketteerden albumine in een muismodel van neurodegeneratieve ziekte

Leer hoe je met MRI-geleide gefocusseerde echografie de bloed-hersenbarrière opent in muizen voor gerichte gendelivery en chemogenetische neuromodulatie. Deze methode valideert DREADD-expressie via histologie.

Gerichte echografie geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening voor het richten op hersenstructuren en het evalueren van chemogenetische neuromodulatie (Video) | JoVE Journal

Gerichte echografie geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening voor het richten op hersenstructuren en het evalueren van chemogenetische neuromodulatie

Meer video's verkennen