Karakterisering van immuuncellen en pro-inflammatoire mediatoren in de pulmonale omgeving

Dit protocol kan worden gebruikt om veranderingen in de pulmonaire omgeving na een ischemische beroerte te onderzoeken. Deze methode maakt het mogelijk om 13 longimmuunceltypen en 13 verschillende cytokinen en chemokinen in dezelfde muis te identificeren via flowcytometrische analyse. Deze methode is gebruikt om veranderingen in de pulmonaire omgeving na een ischemische beroerte te beoordelen.

Het kan echter ook dienen om veranderingen tijdens allergische reacties of infecties te onderzoeken. Om een gehele lichaam transcardiale perfusie uit te voeren, bevestigt u een gebrek aan reactie op de pedale reflex bij een verdovde muis en bevestigt u de muis aan een chirurgische platform. Bevochtig de vacht met 70% ethanol om de verspreiding van vacht in de lichaamsholte te verminderen en maak een verticale middenlijn incisie in de huid om het intacte peritoneum bloot te leggen, stop de incisie zodra de borstholte is bereikt.

Gebruik fijne dissectiescharen om een middenlijn incisie in het peritoneum te maken en stop voor de borstholte en gebruik forceps om het distale uiteinde van het borstbeen vast te pakken. Gebruik de schaar om door het diafragma te snijden zonder het hart, de longen of de bloedvaten te beschadigen. Wanneer de onderliggende weefsels zichtbaar zijn, maak een incisie door de ribbenkast en bevestig de zijden van de ribben zodat het hart en de longen volledig blootliggen.

Maak voorzichtig een kleine incisie in het rechter atrium nabij de aortaboog om als uitstroom voor de perfusie te dienen en steek snel maar voorzichtig een naald van 25 gauge in het distale superieure oppervlak van het linker ventrikel. Zodra de naald op zijn plaats is, spoelt u voorzichtig 10 milliliter koude PBS in het hart. Het weefsel zou moeten beginnen te klaren van bloed.

Wanneer het volledige volume is aangeleverd, perfundeert u een tweede aliquot van 10 milliliter koude PBS totdat de lever een lichtbruine kleur vertoont en de longen zijn overgegaan van een roodachtig roze naar een meestal witte kleur. Gebruik forceps en fijne dissectiescharen om voorzichtig alle omringende weefsels te verwijderen voordat u de longkwabben scheidt en ze in een petrischaal plaatst met een tot twee milliliter koud longcelmedium op ijs. Om het longweefsel voorbereiden voor multiplex bead arrays voegt u 200 microliter koude homogenisatiebuffer toe aan een tweeduizend milliliter buisje met drie steriele 2,3 milliliter Zirconia/Silica kralen en weegt u de longkwab van belang.

Breng 50 tot 100 milligram longweefsel over naar het voorgekoelde buisje met kralen en homogenisatiebuffer en homogeniseer de kwab met een kralen gebaseerde homogenisator bij 4.000 rotaties per minuut gedurende ten minste twee minuten. Wanneer het weefsel volledig gehomogeniseerd is, centrifugeert u het buisje om het weefsel te sedimenteren en brengt u het supernatant over naar een voorgekoelde 1,5 milliliter microbuis op ijs. Voor longweefsel dissociatie decant u voorzichtig het longcelmedium van de resterende longkwab en steekt u een naald van 25 gauge in het weefsel.

Injecteer 200 tot 250 microliter volumes dissociatiebuffer in elke longkwab om de longen op te blazen totdat elk van de kwabben twee tot drie keer zijn geïnjecteerd. Na een incubatie van twee minuten bij kamertemperatuur snijdt u de longen in kleine stukken met fijne dissectiescharen en brengt u de weefseloplossing over in een 15 milliliter chroniclebuis. Voeg zes milliliter extra dissociatiebuffer toe aan het monster en vortext u krachtig gedurende één minuut.

Vervolgens incubeert u de weefselstukken gedurende 45 minuten bij 37 graden Celsius met vortexen elke zeven tot acht minuten. Aan het einde van de incubatie, vortext u het monster krachtig gedurende één minuut en passeert u het monster door een 100 micron celzeef om eventueel resterend ongewenst bind- en interstitieel weefsel te verwijderen. Verzamel het weefsel door centrifugatie en suspendeer het pellet met vijf milliliter koud longmedium.

Centrifugeer het monster opnieuw en suspendeer het pellet in één milliliter koud longmedium met voorzichtig vortexen. Filter vervolgens de cellen door een 100 micron zeef voor het tellen. Om de immuuncelpopulaties binnen het geïsoleerde longweefsel te evalueren, zaait u één tot twee keer 10 tot de zesde macht cellen antilichaamset in het juiste aantal putjes met een 96-well ronde bodemplaat en plaatst u de cellen op de bodem van de plaat door centrifugatie.

Voeg 25 microliter van de juiste antilichaamcocktail in koud FACS-buffer toe aan elk putje en meng voorzichtig met pipetting. Na 20 minuten, suspendeert u de cellen in 100 microliter koud FACS-buffer per putje en brengt u de monsters over naar individuele vijf milliliter polystyreen ronde bodembuisjes met 150 microliter extra FACS-buffer per buisje. Analyseer vervolgens de monsters onmiddellijk op een flowcytometer volgens standaard flowcytometrische analyseprotocollen.

In deze representatieve analyse werden 13 verschillende populaties immuuncellen geïdentificeerd in de longen met behulp van drie sets van vijf tot zeven antilichaamcombinaties. Dode cellen werden uitgesloten met behulp van een levend dood kleuring en de verschillende immuuncelsoorten werden onderscheiden met behulp van de antilichamen en markers die in de tabel zijn vermeld. Alveolaire en interstitiële macrofagen, CD103 positieve en CD11B positieve dendritische cellen en eosinofielen werden geïdentificeerd in set één.

Pro-inflammatoire monocyten en neutrofielen werden geïdentificeerd in set twee en CD4 positieve en CD8 positieve T-cellen, B-cellen, plasmacytoide dendritische cellen, NK-cellen en NKT-cellen werden geïdentificeerd in set drie. Het totale aantal levensvatbare cellen, percentage van CD45 positieve cellen en totaal aantal CD45 positieve cellen dat werd verkregen, waren vergelijkbaar tussen celpopulaties die werden geïsoleerd zoals aangetoond en celpopulaties die werden geïsoleerd met behulp van een commercieel beschikbare weefsel dissociator. Bovendien was het percentage celdood onder CD45 positieve cellen minder dan 10% voor beide protocollen, wat suggereert dat het aangetoonde protocol een hoge opbrengst en hoge kwaliteit celherstel mogelijk ma