Biofunctionalisering van magnetische nanomaterialen
16 juli 2020
In dit werk bieden we een protocol om magnetische nanomaterialen te biofunctionaliseren met antilichamen voor specifieke celtargeting. We gebruiken bijvoorbeeld ijzeren nanodraden om kankercellen aan te pakken.
Het belangrijkste kenmerk van dit protocol is dat het toepasbaar is op een breed scala aan ijzer-ijzeroxide nanomateriaal. Ook kan het worden toegepast op meervoudig gesegmenteerde nanomaterialen, zoals ijzer-goud nanodraden. Dit protocol kan veilig worden uitgevoerd in elke standaard biologische laboratorium.
De belangrijkste voordelen van deze biofunctionalisatietechniek is de mogelijkheid om een specifiek gericht nanomateriaal te produceren op basis van een sterke covalente binding tussen de nanodraad en de antilichamen. Begin door de aluminium schijven met een enkelzijdig mes en een kleine hamer in kleine stukken te snijden. Plaats de gesneden stukken in een tweeduizend milliliter buis en vul deze met één milliliter een-molar natriumhydroxide, zorg ervoor dat alle aluminium stukken bedekt zijn.
Laat de buis gedurende 30 minuten op kamertemperatuur in een chemische afzuigkap. Na de incubatie verwijdert u de aluminium stukken met een pincet en bewaart u de vrijgekomen nanodraden in natriumhydroxide gedurende nog eens 30 minuten. Plaats de buis in een magnetisch droogrek, wacht twee minuten en vervang de oplossing door verse natriumhydroxide.
Soniceer de tweeduizend milliliter buis met de nanodraden gedurende 30 seconden en laat het een uur in een chemische afzuigkap staan. Herhaal deze stap minimaal vier keer. Wanneer u klaar bent, plaatst u de tweeduizend milliliter buis in het magnetische rek, gooit u het natriumhydroxide weg en vervangt u het door één milliliter absoluut ethanol.
Soniceer de nanodraden gedurende 30 seconden, plaats de buis in het magnetische rek en vervang het ethanol. Herhaal de ethanol wassing minimaal vier keer. Nadat u de nanodraden hebt gewassen, brengt u ze over in een vijf milliliter glazen buis met een een-milliliter pipet.
Voeg 100 microliter APTES toe aan de nanodraadoplossing en vortex de glazen buis gedurende 20 seconden. Plaats de buis in een ultrasoon bad en soniceer het gedurende één uur. Neem vervolgens de buis uit het bad en voeg 400 microliter gedeïoniseerd water en 20 microliter een-molar natriumhydroxide toe.
Herhaal de een-uur sonicatie. Nadat u de glazen buis uit het ultrasoon bad hebt gehaald, plaatst u deze naast een magneet om de nanodraden te verzamelen. Vervang het supernatant door één milliliter verse absolute ethanol en soniceer de buis gedurende 10 seconden.
Herhaal de ethanol wassing en sonicatie twee keer. Los 0,4 milligram EDC en 1,1 milligram Sulfo-NHS en één milliliter MES op in een tweeduizend milliliter buis. In een andere tweeduizend milliliter buis, voegt u 960 microliter 0,1-molar PBS toe en voegt u 30 microliter anti-CD44 antilichaam toe.
Voeg vervolgens 10 microliter van het eerder bereide EDC/Sulfo-NHS mengsel toe aan deze buis. Plaats de antilichaam buis in een shaker en schud hem gedurende 15 minuten op kamertemperatuur bij 10 keer G. Plaats ondertussen een magneet naast de buis met de APTES-gecoate nanodraden gedurende twee minuten, gooit u de ethanol weg en vervangt u het door PBS.
Soniceer de nanodraden gedurende 10 seconden. Na de laatste wassing met PBS, verzamelt u de nanodraden en brengt u de geactiveerde antilichaamoplossing over naar de nanodradenbuis. Soniceer het vervolgens gedurende 10 seconden.
Vervang de buis in de rotator overnacht bij vier graden Celsius. De volgende dag verzamelt u de nanodraden met de magneet en gooit u het supernatant weg. Voeg één milliliter 2% BSA toe en incubeer de buis gedurende één uur bij vier graden Celsius om de reactie te blokkeren.
Elektronenenergieverliesspectroscopie of EELS kaarten kunnen worden gebruikt om de siliciumatomen op het nanodraadoppervlak te visualiseren en de aanwezigheid van de APTES coating te bevestigen. Op de niet-gecoate nanodraden zien de ijzeratomen er donkerblauw uit en de ijzer- en zuurstofgemengde atomen zijn lichtblauw. De bijbehorende EELS mapping van niet-gecoate nanodraden toont een hogere intensiteit van ijzer versus zuurstof in het centrum dan op het oppervlak, wat wijst op een ijzer-ijzeroxidestructuur.
De mapping toonde aan dat de ijzeroxidelaag meer ijzer(II, III)oxide bevat dan ijzer(III)oxide. De antigeniciteit van de gehechte antilichamen werd bevestigd met behulp van immunoprecipitatie en western blot analyses. De BCA-test werd gebruikt om het aantal antilichamen op de nanodraden te kwantificeren.
Meting van zetapotentiaal werd gebruikt om de oppervlaktefunctionalisatie te verduidelijken. De terminale aminegroep op APTES verminderde de negatieve lading in vergelijking met niet-gecoate nanodraden. Antilichaamboxfunctie verminderde de lading verder.
De specifieke celtargeting van de antilichaamboxgefunctionaliseerde nanodraden werd bevestigd met behulp van confocale microscopie. Figuren A en B vertegenwoordigen de lichtveldmicroscoopbeelden van specimen C en D respectievelijk. De kleur rood komt overeen met de afbeelding van de celmembraan, blauw vertegenwoordigt de kern en de groene clusters geven de aanwezigheid van gehechtte, gerichte CD44 nanodraden aan.
Bovendien werd de cellevensvatbaarheidstest gebruikt om te verifiëren dat de niet-gecoate, APTES-gecoate en antilichaamboxgecoate nanodraden biocompatibel waren. Bij het APTES-procescoating is het erg belangrijk om het gedeïoniseerd water toe te voegen vóór de natriumhydroxide-oplossing om de binding tussen het APTES-molecuul en de nanodraden te verbeteren. Ook is het tijdens het biofunctionalisatieproces noodzakelijk om de nanodraad een paar keer met PBS-buffer te wassen om de covalente binding tussen het antilichaam en de nanodraden te verbeteren.
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor de biofunctionalisering van magnetische nanomaterialen met antilichamen om specifieke celtargeting te bereiken, met name door het gebruik van ijzeren nanodraden om kankercellen te targeten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Nanotechnologie
- Biomaterialen
- Celbiologie
Achtergrond
- Magnetische nanomaterialen hebben potentiële toepassingen in doelgerichte medicijnafgifte.
- Biofunctionalisatie verhoogt de specificiteit van nanomaterialen voor specifieke celtypen.
- IJzeren nanowires kunnen worden gemodificeerd om hun targetingsmogelijkheden te verbeteren.
- Het begrijpen van de interactie tussen nanomaterialen en biologische systemen is cruciaal voor hun toepassing.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een betrouwbaar protocol voor de biofunctionalisatie van ijzer-nanodraden.
- Het aantonen van de effectiviteit van antilichaam-gefunctionaliseerde nanodraden bij het targeten van kankercellen.
- Het beoordelen van de biocompatibiliteit van de gemodificeerde nanodraden.
Gebruikte methoden
- Bereiding van ijzernanodraden via chemische processen.
- Coating van nanodraden met APTES om de binding van antilichamen te vergemakkelijken.
- Gebruik van EDC/Sulfo-NHS voor het activeren van antilichamen.
- Karakterisering van nanodraden met behulp van elektronenenergieverliesspectroscopie en zetapotentiaalmetingen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol heeft succesvol antilichaam-gefunctionaliseerde ijzer-nanodraden geproduceerd.
- Confocale microscopie bevestigde de specifieke targeting van kankercellen door de gemodificeerde nanodraden.
- Biocompatibiliteitstests gaven aan dat de nanodraden veilig waren voor cellulaire toepassingen.
- De oppervlaktefunctionalisering werd gevalideerd via verschillende karakteriseringstechnieken.
Conclusies
- Deze biofunctionalisatietechniek maakt de gerichte toediening van therapeutische middelen mogelijk.
- Het protocol kan worden aangepast voor diverse soorten nanomaterialen.
- Toekomstige toepassingen kunnen gerichte kankertherapieën met behulp van deze nanodraden omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Dit protocol maakt de productie van specifiek gerichte magnetische nanomaterialen mogelijk via covalente antilichaamkoppeling, wat de ontwikkeling van precisietherapieën en diagnostiek ondersteunt. Door de doelspecificiteit te verhogen en remote magnetische controle mogelijk te maken, draagt deze methode bij aan mechanisch de-risking in oncologieprogramma's in een vroeg stadium. De aanpak verbetert het voorspellend vertrouwen in interventies op basis van nanomaterialen door zowel de targeting-efficiëntie als de biocompatibiliteit te valideren.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van specifieke targeting van celoppervlaktemarkers, zoals CD44-overexpressie in kankercellen.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door de antigeniciteit van gekoppelde antilichamen te bevestigen via immunoprecipitatie en western blot.
- Voorspellende waarde: Vergemakkelijkt de triage van het portfolio door specifieke targeting en biocompatibiliteit aan te tonen in relevante cellulaire modellen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gevalideerde biologische systemen op die klaar zijn voor downstream workflows, waarbij oppervlaktefunctionalisering is bevestigd via EELS en zeta-potentiaalmetingen.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays mogelijk door gecontroleerde covalente binding en blokkeringsstappen met BSA.
- Schaalbaarheidswaarde: Ondersteunt hergebruik van het platform voor ijzer-ijzeroxide en multi-gesegmenteerde nanomaterialen, inclusief ijzer-goud nanodraden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Demonstreert continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie via tracking met confocale microscopie en assays voor celviabiliteit.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen door de biocompatibiliteit van niet-gecoate, APTES-gecoate en antilichaam-gecoate nanomaterialen te verifiëren.
- Mechanistische risicoreductie: Vermindert onduidelijkheid over targeting-mechanismen door de binding van antilichamen te koppelen aan specifieke celbinding waargenomen in beeldvorming.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie, waardoor een betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk wordt gemaakt via kwantificeerbare, magnetisch responsieve nanomaterialen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door specifieke aflevering aan CD44-positieve kankercellen mogelijk te maken.
- Screening: Realiseert assay-gereedheid en kwantitatieve outputs via verschuivingen in het zetapotentieel en EELS-bevestigde oppervlaktemodificatie.
- Analytiek: Biedt meetbare resultaten zoals antilichaamhoeveelheden via de BCA-assay en cellulaire opname via confocale microscopie.
- Translationeel onderzoek: Legt een verbinding met preklinische continuïteit door aangetoonde biocompatibiliteit en specifieke targeting in cellulaire modellen.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor het genereren van getargete nanomaterialen over meerdere projecten en nanomateriaalformaten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen, targetvalidatie, vermindering van mechanistische ambiguïteit bij interacties tussen nanomaterialen en cellen.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van biofunctionalisatie in verschillende laboratoriumomgevingen.
- Strategische waarde: Betere go/no-go-beslissingen, kapitaalefficiëntie en verminderd biologisch risico in een laat stadium bij de ontwikkeling van nanotherapeutica.
- Impact op portfolio: Risicogecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van gevalideerde targeting- en veiligheidsprofielen.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering van nanomaterialen, antilichaamconjugatie en oppervlaktekarakteriseringstechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot ultrasoonbaden, magnetische rekken en instrumentatie voor EELS, zetapotentiaal en western blot-analyse.
- Vereist standaardisatie tussen teams van was-, blokkerings- en incubatieprotocollen om batchconsistentie te waarborgen.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op verschillende vormen, samenstellingen of oppervlaktechemieën van nanomaterialen.
- Bevat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van een zorgvuldige volgorde van reagentia (bijv. gedeïoniseerd water vóór natriumhydroxide) om de APTES-binding te verbeteren.
