Name: Biofunctionalisering van magnetische nanomaterialen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Leer biofunctionalisatie van magnetische nanomaterialen met antilichamen voor gerichte kankerceltherapie met ijzernanodraden. Deze methode maakt veilige, specifieke therapeutische toepassingen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd ondersteund door de King Abdullah University of Science and Technology (KAUST).

LET OP: Raadpleeg voor gebruik altijd alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS). Gebruik alle geschikte veiligheidspraktijken en persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, lange broek, schoenen met gesloten neus). Voer alle biologische reacties uit in de biologische zuurkast.
OPMERKING: Dit protocol is bedoeld om 2 x 10 10 gebiofunctionaliseerde NW's/ml te produceren die overeenkomen met 0.36 mg ijzer/ml gecoat met anti-CD44-antilichamen met een dichtheid van 3 x10 4 antilichamen/NW. De ijzer-ijzeroxide (kern-schaal) NW's zijn 2,5 μm lang en hebben een diameter van 41,5 nm.
1. Vrijkomen van ijzeren nanodraden
OPMERKING: Het fabricageproces van de NW's van ijzer/ijzeroxide is in een eerdere publicatie uitvoerig toegelicht59.
<ol><li>Snijd op een snijmat de aluminium (Al) schijven (Figuur 2A) in kleine stukjes (Figuur 2B) met behulp van een mes met één rand en een kleine hamer om in een buis van 2 ml te passen. Gebruik een pincet om de kleine Al-stukjes over te brengen naar de buis.</li>
	<li>Vul het buisje van 2 ml, met daarin de kleine stukjes Al, met 1 ml natriumhydroxide van 1 M (NaOH). Zorg ervoor dat alle Al-stukken bedekt zijn met de NaOH.</li>
	<li>Laat de oplossing 30 minuten inwerken bij kamertemperatuur in een chemische zuurkast.</li>
	<li>Verwijder alleen de Al-stukken met behulp van het pincet en bewaar de vrijgekomen NW's (zwarte clusters, figuur 3A) nog 30 minuten in de NaOH-oplossing. Verander de NaOH-oplossing niet.</li>
	<li>Verzamel de NW's door de buis van 2 ml in een magnetisch rek te plaatsen en wacht 2 minuten voordat u de oude 1 M NaOH-oplossing verwijdert. Vervang het door verse NaOH-oplossing.</li>
	<li>Sonificeer de buis van 2 ml met de NW's gedurende 30 s en laat deze gedurende 1 uur in een chemische zuurkast staan.</li>
	<li>Herhaal stap 1.5-1.6 minstens vier keer.</li>
	<li>Was de NW's door de slang van 2 ml in het magnetische rek te plaatsen en wacht 2 minuten.</li>
	<li>Gooi de NaOH-oplossing weg en vervang deze door 1 ml absolute ethanol.</li>
	<li>Sonificeer de buis gedurende 30 s.</li>
	<li>Plaats de tube van 2 ml in het magnetische rek en wacht 2 minuten.</li>
	<li>Gooi de oude absolute ethanoloplossing weg en vervang deze door 1 ml verse absolute ethanol en sonicaat gedurende 30 s.</li>
	<li>Herhaal stap 1.11 en 1.12 minstens vier keer.</li>
	<li>Bewaar de NW's in 1 ml absolute ethanol bij kamertemperatuur totdat ze nodig zijn.</li>
	<li>Meet de ijzerconcentratie en dus de NW's met behulp van inductief gekoppelde plasmamassaspectrometrie (ICP-MS). OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. Voor langdurige opslag moet u de NW's echter pas vrijgeven uit de Al-sjabloon als ze nodig zijn. Door de vrijgekomen NW's lange tijd in de ethanol te laten neerslaan zonder frequente sonicatie, ontstaan aggregaties die langere tijden van sonicatie nodig hebben om te worden gescheiden.</li>
</ol>2. Coaten van de nanodraden met APTES
OPMERKING: In dit protocol is 100 μL APTES-oplossing (dichtheid van 0,946 g/ml61) voldoende om 1,6 x 107 m2/g NW's te coaten. Als er een verandering optreedt in de verhouding of de massa van het nanomateriaal, moet het APTES-volume dienovereenkomstig worden aangepast.
<ol><li>Breng de NW's van stap 1.14 over naar een glazen buisje van 5 ml met behulp van een pipet van 1 ml.</li>
	<li>Om eventuele NW's die in de tube van 2 ml zijn achtergebleven op te vangen, wast u de lege tube van 2 ml twee keer door 1 ml absolute ethanol toe te voegen en deze met een pipet van 1 ml over te brengen naar de glazen tube van 5 ml.</li>
	<li>Neem met behulp van de pipet 100 μL APTES en voeg dit rechtstreeks toe aan de NW-oplossing.</li>
	<li>Draai de glazen buis van 5 ml gedurende 10 s.</li>
	<li>Stel de glazen buis van 5 ml af op de klem van een laboratoriumretortstandaard.</li>
	<li>Plaats de helft van de glazen buis van 5 ml in het water van het ultrasoonbad en sonificeer gedurende 1 uur.</li>
	<li>Haal de glazen buis van 5 ml uit het ultrasoonbad en voeg 400 μL gedeïoniseerd (DI) water toe, gevolgd door 20 μL 1 M NaOH (basiskatalyse). LET OP: Het is belangrijk om eerst het DI-water toe te voegen.</li>
	<li>Pas de glazen buis van 5 ml aan, zoals uitgelegd in stap 2.5-2.6, en sonificeer nog eens 1 uur.</li>
	<li>Haal de glazen buis van 5 ml uit het ultrasoonbad.</li>
	<li>Plaats een magneet gedurende 5 minuten naast de glazen buis om de NW's op te vangen.</li>
	<li>Vervang het supernatans door 1 ml verse absolute ethanol en sonificeer gedurende 10 s.</li>
	<li>Herhaal stap 2.10-2.11 vier keer.</li>
	<li>Breng alle NW's gesuspendeerde ethanol over in een nieuwe glazen buis van 5 ml met behulp van een pipet van 1 ml. OPMERKING: De APTES-gecoate NW's kunnen worden bewaard in een glazen buis met ethanol totdat ze nodig zijn. Het protocol kan hier worden gepauzeerd.</li>
</ol>3. Biofunctionalisatie van de nanodraden
<ol><li>Activeren van de antilichamen OPMERKING: Om ongeveer 3 x 104 delen antilichaam/NW te bereiken, gebruikt u 30 μL antilichaam (1 mg/ml) per 0,1 mg ijzer.<ol><li>Los in een buisje van 2 ml 0,4 mg 3-3-dimethylaminopropylcarbodiimide (EDC) en 1,1 mg sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS) op in 1 ml 2-N-morfolino-ethaansulfonzuurhydraat (MES) (pH 4,7). NOTITIE: Het EDC/sulfo-NHS-mengsel moet vers en bereid zijn voor gebruik.</li>
		<li>Voeg in een nieuw buisje van 2 ml respectievelijk 30 μl anti-CD44-antilichaam (1 mg/ml), 960 μl 0,1 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7) en 10 μl EDC/sulfo-NHS-mengsel (bereid in stap 3.1.1) toe.</li>
		<li>Plaats de tube van 2 ml in een tube shaker van 10 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van de APTES gecoate nanodraden<ol><li>Was tijdens de incubatie van 15 minuten in stap 3.1.3 de NW's door gedurende 2 minuten een magneet naast de APTES-gecoate NW-buis (uit stap 2.13) te plaatsen om de NW's op te vangen.</li>
		<li>Gooi de ethanol weg en vervang deze door 1 ml 0.1 M PBS (pH 7) en sonificeer vervolgens gedurende 10 s.</li>
		<li>Herhaal stap 3.2.1-3.2.2 vier keer.</li>
		<li>Verzamel de NW's, zoals uitgelegd in stap 3.2.1, en gooi de 0.1 M PBS weg. Bewaar de NW's in de buis zonder enige oplossing.</li>
	</ol></li>
	<li>Aanhechting van de antilichamen<ol><li>Breng alle geactiveerde antilichaamoplossing (bereid in stap 3.1.3) over in de NWs-buis (bereid in 3.2.4) en sonificeer gedurende 10 s.</li>
		<li>Plaats de glazen buis een nacht in de rotator bij 4 °C.</li>
		<li>Verzamel de NW's met behulp van een magneet zoals in stap 3.2.1 en gooi de supernatant weg.</li>
		<li>Toevoeging van 1 ml 2% runderserumalbumine (BSA)-oplossing gedurende 1 uur bij 4 °C om de reactie te blokkeren.</li>
		<li>Controleer de antigeniciteit van de gefunctionaliseerde NW's van het antilichaam, bijvoorbeeld met behulp van immunoprecipitatie (IP) en western blot (WB) assays. OPMERKING: Gebruik voor betere resultaten de gebiofunctionaliseerde NW's in de IP-, WB- of biocompatibiliteitstest onmiddellijk na de blokkeringsstap.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Biocompatibiliteitstest
OPMERKING: Om de biocompatibiliteit van de NW's te bestuderen, kunnen verschillende cellevensvatbaarheidstests en verschillende cellijnen worden gebruikt. De concentratie van de hier gebruikte NW's is gebaseerd op een eerdere publicatie16. Het zaaien van cellen moet een dag voor de NW-biofunctionalisatie worden gedaan.
LET OP: Alle onderstaande stappen moeten onder de bioveiligheidskast worden uitgevoerd.
<ol><li>Zaai in een plaat met 96 putjes negen putjes met 4 x 104 darmkankercellen (HCT116-cellijn) gesuspendeerd in McCoy's celkweekmedia (100 μL/putje) en plaats het een nacht in de incubator bij 37 °C en 5% kooldioxide (CO2).</li>
	<li>Was de NW's (uit stap 3.3.4) met PBS door ze op te vangen met behulp van een magneet zoals in stap 3.2.1 en vervang de oude oplossing door 1 ml 0,01 M PBS (pH 7). Herhaal deze stap drie keer.</li>
	<li>Was de NW's (uit stap 4.2) met opgewarmde McCoy's media door ze op te vangen met behulp van een magneet zoals in stap 3.2.1 en vervang de oude PBS door 1 ml verwarmde McCoy's media. Herhaal deze stap drie keer.</li>
	<li>Verzamel de NW's (uit stap 4.3) met behulp van een magneet zoals in stap 3.2.1 en vervang de 1 ml opgewarmde McCoy's media door 900 μL verwarmde McCoy's media. De NW-concentratie moet 0,02 mg NW's per ml zijn.</li>
	<li>Breng de plaat met 96 putjes (uit stap 4.1) van de incubator naar de bioveiligheidskast.</li>
	<li>Gooi onder de bioveiligheidskast de oude media uit de cellen en vervang deze door 100 μL gesuspendeerde NW's (voorbereid in stap 4.4).</li>
	<li>Schud de plaat (bereid in stap 4.6) met de hand en incubeer deze vervolgens gedurende 24 uur in de incubator bij 37 °C en 5% CO2 .</li>
	<li>Haal de volgende dag de plaat met 96 putjes (voorbereid in stap 4.7) uit de couveuse. Voeg onder de bioveiligheidskast 11 μL van het cellevensvatbaarheidsreagens (materiaaltabel) toe aan elk putje met behulp van de meerwandige pipet.</li>
	<li>Schud de plaat met de platenschudder met een snelheid van 10 x g gedurende 10 s.</li>
	<li>Incubeer de plaat gedurende 1 uur in de broedstoofmachine.</li>
	<li>Haal de plaat met 96 putjes (voorbereid in stap 4.10) uit de couveuse. Lees de plaat af in de microplaatlezer (Tabel met materialen) door de absorptie van het reagens voor de levensvatbaarheid van de cel te meten (excitatie 540 nm, emissie 590 nm).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Zoals bij elke fabricage- en coatingmethode van nanomaterialen, is een hoge kwaliteit van de gebruikte oplossingen vereist. De release (1 M NaOH) en functionalisatie (MES) oplossingen kunnen meerdere keren worden hergebruikt. Het is echter erg belangrijk om de pH-waarde te controleren voordat een nieuw proces wordt gestart. In de vrijgavestap moeten de NW's met NaOH ten minste vier keer worden gewassen. Hoe beter de wassing, hoe beter de stabiliteit van de NW's en hoe minder ze aggregaat zijn. De oxidelaag verbetert de stabiliteit van de NW's bij onderdompeling in ethanol of water63.
De diameter en de lengte van de NW's werden aangetast nadat ze waren bedekt met APTES en antilichamen. Hier nam de diameter toe van 41,5 nm naar 70 nm en de lengte van 2,5 μm naar 1,6 μm, als gevolg van de sonicatiestappen die de NW's breken. Daarom is het essentieel karakteriseer de morfologie van de NW's na de biofunctionalisatiestap.
De aanhechting van de antilichamen aan de NW's berust op de covalente interactie tussen de aminegroep (op APTES) en de carboxylgroep (op het antilichaam). Daarom is het bevestigen van de aanwezigheid van de APTES-coating een belangrijke stap, waarvoor we EELS-mapping hebben gebruikt. De coatingmethode is veilig en eenvoudig. Het heeft geen hoge temperaturen of lange incubatietijden nodig. APTES-coating werkt ook als een linker om de covalente hechting van andere antilichamen of eiwitten met een carboxylgroep mogelijk te maken.
In het geval van biofunctionalisering van de NW's met een antilichaam, kan de antigeniciteit van de bindingsplaatsen van de antilichamen na het biofunctionalisatieproces worden beïnvloed. De IP- en WB-methode kunnen worden gebruikt om dit probleem te onderzoeken. Door gebruik te maken van de biofunctionalisatiemethode die in dit protocol wordt genoemd, kunnen de antilichamen zich binden aan de NW's met een hoge antigeniciteit aan een specifieke celreceptor. Bovendien voegde het biofunctionaliseren van de NW's met antilichamen het vermogen toe om zich te richten op de cellen met de receptor van belang, CD44 hier. Dit werd bevestigd door confocale microscopie. Hoewel de biocompatibiliteit van de niet-gecoate NW's hoog was (>95%), verbeterde het toevoegen van APTES-coating of antilichamen aan de NW's hun biocompatibiliteit met 100%.
Verder is het coating- en biofunctionaliseringsprotocol efficiënt, economisch en reproduceerbaar. Het moet van toepassing zijn op elk ander ijzer-ijzeroxide-nanomateriaal, waarbij de concentratie van zowel de coating als de aangehechte antilichamen moet worden geoptimaliseerd op basis van het oppervlak en de massa van het nanomateriaal. Dit protocol kan veilig worden uitgevoerd bij omgevingscondities in het algemene laboratorium. De biofunctionalisering heeft de biocompatibiliteit van het nanomateriaal en hun targetingvermogen aanzienlijk verbeterd. Over het algemeen zijn de NW's zeer veelbelovende materialen voor nanomedische toepassingen (waaronder multimodale of combinatorische behandelingen, celdetectie of -geleiding, en biologische detectie). In combinatie met biofunctionalisatie, zoals hier beschreven, kan specifieke celtargeting worden bereikt voor meer precisie en werkzaamheid.

Een unieke eigenschap van magnetische nanomaterialen is hun vermogen om te reageren op magnetische velden1, die nuttig kunnen worden gebruikt om ze op vele manieren te activeren, terwijl ze ook kunnen worden gecontroleerd, bijvoorbeeld door magnetische resonantiebeeldvorming (MRI). Bij het toepassen van een wisselend magnetisch veld met hoge frequentie kunnen ze warmte genereren, wat hyperthermie kan veroorzaken, wat een therapeutische optie1 biedt. Een andere benadering is fotothermische behandeling, die kan worden gerealiseerd met een nabij-infrarood (NIR) laser 2,3.
Van het grote aantal magnetische nanomaterialen heeft ijzeroxide de meeste aandacht gekregen in biologische toepassingen zoals magnetische scheiding, hyperthermie2,4, celgeleiding5, medicijnafgifte 6,7,8 en als contrastmiddel in MRI 9,10. Dit komt door hun hoge biocompatibiliteit 11,12, grote magnetisatie 11,12, het vermogen om te worden gecoat 9,13,14,15, het vermogen om medicijnen te dragen 2,16, het vermogen om te worden gefunctionaliseerd met medicijnen2,16 en/of het targeten van middelen 12,13,17,18, en het vermogen om optische energie om te zetten in warmte2. Onlangs is MagForce begonnen met klinische onderzoeken bij kankerpatiënten die ijzeroxide-nanodeeltjes gebruiken voor de behandeling van hyperthermie19.
De laatste tijd worden magnetische nanodraden (NW's) steeds meer gebruikt voor biomedische toepassingen 3,11,16,20,21,22. Ze hebben vergelijkbare eigenschappen als magnetische nanobolletjes, maar bieden een anisotrope vorm en een zeer groot magnetisch moment, waardoor een zeer efficiënte afstandsbediening door een magnetisch veld23,24 mogelijk is, inclusief laagfrequente bediening om magnetomechanische effecten te induceren 25,26,27,28,29. Als gevolg hiervan zijn de NW's geïmplementeerd voor verschillende biologische toepassingen, zoals exosomenisolatie30 celtracking21, kankerbehandeling 3,11,16, medicijnafgifte16,31,32 en als MRI-contrastmiddel 33.
Biogefunctionaliseerde magnetische nanomaterialen met een specifiek vermogen om cellen te targeten hebben een groot potentieel voor biomedische toepassingen en in precisiegeneeskunde34,35. Om deze targetingmiddelen te bevestigen, is een oppervlaktemodificatie op de nanomaterialen nodig. Meestal hebben ze een coating nodig die zorgt voor een functionele groep, wat de hechting van de behandelaars vergemakkelijkt. In de literatuur is er een groot aantal organische en anorganische coatings voor magnetische nanomaterialen. Op basis van de functionele groep die kan worden geïmmobiliseerd tot het nanomateriaal, kunnen deze coatings worden onderverdeeld in vier hoofdgroepen: moleculen op basis van carbonzuurgroepen, polymeren, histidine en moleculen op basis van silaangroepen.
De moleculen op basis van carbonzuurgroepen is een van de oppervlaktemodificatiemethoden. Het maakt gebruik van de hoge affiniteit tussen de negatieve carbonzuurgroep op de coating en de positieve lading op de magnetische nanomaterialen36,37,38. Het bindingsproces van een carbonzuur aan een metaaloppervlak kan gepaard gaan met het genereren van metaalcarboxylaatzouten of de hechting van de carboxylgroep aan het metaal. Voor NW's met meerdere segmenten, zoals ijzer/goud of nikkel/goud NW's, die uitstekende eigenschappen hebben voor bio-toepassingen39,40, kan dit type coating echter niet gemakkelijk worden aangebracht. Er zijn twee verschillende coatings tegelijk nodig: thiolgroepen voor het modificeren van de goudsegmenten en carboxylgroepen voor magnetische segmenten (ijzer of nikkel)38. Enkele voorbeelden van moleculen op basis van carboxylgroepen zijn hematoporfyrine, pimelzuur, palmitinezuur en 3-[(2-aminoethyl)dithio] propionzuur (AEDP)38. Oppervlaktemodificaties van magnetische nanomaterialen met behulp van polymeren bieden een aantal duidelijke voordelen. Door het grote molecuulgewicht van de polymeren verbetert het de stabiliteit van het magnetische nanomateriaal in een oplossing38. Het zal echter de grootte van het nanomateriaal aanzienlijk vergroten38. Polyvinylpyrrolidon (PVP), polyethyleenimine (PEI), arginine-glycine-D-asparaginezuur (RGD) en polyethyleenglycol (PEG) zijn enkele voorbeelden van de meest gebruikte polymeren voor oppervlaktemodificaties. Elk heeft zijn eigen kenmerken en maakt gebruikvan 38. De derde methode voor oppervlaktemodificatie is het gebruik van een histidinecoating. Histidine is een eiwit met een zijketen van histidine-aminozuren dat een hoge affiniteit heeft met een beperkt aantal magnetische nanomaterialen zoals nikkel38. Het kan worden gebruikt voor eiwitzuiveringsprocessen 38,41,42. Een histidinecoating kan ook worden aangebracht op NW's met meerdere segmenten, zoals nikkel/goud NW's38. De silanisatie van een nanomateriaaloppervlak is een goed ingeburgerd proces 38,43,44. Het is gebaseerd op een siliciumatoom dat via drie enkelvoudige bindingen aan elk metaaloxideoppervlak is gekoppeld, en tegelijkertijd bindt dit siliciumatoom aan het einde aan de functionele groep via eenalkylketen 38,43,44. Het voordeel van deze coating is dat er vrije aminegroepen zijn en dat het de mogelijkheid heeft om zowel magnetische als niet-magnetische materialen te coaten38,45, zoals respectievelijk nikkel en goud. Daarom is het gebruik van moleculen op basis van de zoute groep een praktische route voor het biofunctionaliseren van multi-gesegmenteerde NW's. Enkele voorbeelden van moleculen op basis van silaangroepen zijn (3-aminopropyl) triethoxysilaan (APTES) en (3-aminopropyl) trimethoxysilaan (APTMS)38,45.
De toevoeging van een targetingmiddel aan de coating kan een belangrijke rol spelen bij zowel de diagnose als de behandeling van zieke cellen en tegelijkertijd de bijwerkingen op gezonde weefsels minimaliseren46,47. De toevoeging van een targetingmiddel op het oppervlak van nanomaterialen verbetert zowel cellulaire selectieve binding als internalisatie via endocytosereceptoren7. Zonder deze gerichte liganden interageren nanomaterialen niet-specifiek met celmembranen, die met een lagere snelheid binden in vergelijking met de nanomaterialen met de liganden48. Een van de uitdagingen bij het aanpakken van kankerweefsels is hun karakteristieke gelijkenis met gezonde weefsels. Daarom hangt het succes van targeting voornamelijk af van het bepalen van het juiste ligand om als biologisch doelwit te gebruiken49,50. Er zijn verschillende targetingmiddelen gebruikt om nanomaterialen naar kankercellen te leiden48,51 (bijv. CD44, vanwege de hoge expressie in kankercellen in vergelijking met gezonde cellen52,53,54,55).
Targeting-agenten kunnen worden onderverdeeld in drie hoofdgroepen, op basis van de componenten waaruit ze zijn gemaakt en hun complexiteit: op aptameren gebaseerde targeting, op liganden gebaseerde targeting en op antilichamen gebaseerde targeting. Aptameren zijn korte chemisch gesynthetiseerde strengen DNA of RNA-oligonucleotiden die zijn gevouwen in twee- en driedimensionale structuren, waardoor ze zich kunnen richten op een specifiek antigeen,meestal eiwitten. Ligand-gebaseerde targeting omvat peptiden en korte aminozuurketens57. Op antilichamen gebaseerde targeting omvat het gebruik van een heel antilichaam of antilichaamfragmenten, zoals variabele fragmenten met één keten of antigeenbindende fragmenten51. Het gebruik van deze methode heeft het voordeel dat het twee bindingsplaatsen bezit met een hoge bindingsaffiniteit voor het specifieke doelantigeen, waardoor het een buitengewoon hoge selectiviteit heeft58. De bindingsplaatsen zijn analoog aan een slot en het antigeen aan een sleutel58.
In dit werk werden de gebruikte NW's vervaardigd door elektrodepositie op aluminiumoxidemembranen, een methode die in detail werd beschreven in een eerdere publicatie59. De focus ligt hier op het vrijmaken van deze ijzer-ijzeroxide (kern-schaal) NW's uit de membranen en het biofunctionaliseren ervan met specifieke antilichamen om een targetingvermogen te bieden. De antilichamen kunnen zich niet direct binden aan de ijzer-ijzeroxide NW's en hebben een linker nodig. Het coaten van de NW's met APTES levert vrije aminegroepen op, waardoor de covalente hechting via de carboxylgroep op de antilichamen mogelijk wordt (Figuur 1). Het voordeel van de APTES-coating is dat hij kan werken voor zowel magnetische21 als niet-magnetische60 materialen, zoals ijzer/goud of nikkel/goud NW's45. Alle coating- en biofunctionalisatiestappen die in dit protocol worden uitgelegd, kunnen in het algemeen worden gebruikt met elk ijzer/ijzeroxide-nanomateriaal. IJzer/ijzeroxide NW's werden hier als voorbeeld gebruikt. De resultaten tonen aan dat de antilichaam-gefunctionaliseerde NW's een hoge antigeniciteit hebben tegen specifieke receptoren op het celoppervlak, die voor verschillende toepassingen kunnen worden gebruikt. Voorbeelden hiervan zijn celscheiding, medicijnafgifte, specifieke kankercelbehandeling met behulp van fotothermische en/of magnetomechanische behandelingen.

<table><tbody><tr><td>2 mL tube (snap-cap Microcentrifuge)</td><td>Eppendorf, Fisherscientific</td><td>05-402-7</td><td></td></tr><tr><td>2-N-Morpholino EthaneSulfonic acid hydrate 99% (MES)</td><td>Thermscientific</td><td>AC172590250</td><td>Concentration 0,1 M en pH 4,7</td></tr><tr><td>3-3-Dimethyl-aminopropyl Carbodiimide (EDC)</td><td>Thermofisher</td><td>PG82079</td><td></td></tr><tr><td>3-AminoPropyl-Tri-Ethoxy-Silane (APTES)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>919302</td><td></td></tr><tr><td>5 mL glasbuis</td><td>Fisherscientific</td><td>03-339-22C</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate (platte bodem)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS3595</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44 antilichaam</td><td>BD Biosciences</td><td>550990</td><td>Clone 515, concentratie 1 mg/mL</td></tr><tr><td>APTES ((3-aminopropyl)triethoxysilaan), 99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>919-30-2</td><td>Concentratie 99%</td></tr><tr><td>BCA-test (Pierce BCA-eiwitanalysekit)</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine oplossing (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9048-46-8</td><td>Concentratie 35%</td></tr><tr><td>Cel-incubator</td><td>Thermofisher</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>Celviabiliteitsreagens</td><td>AlamarBlue, Thermofisher</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Darmkankercellen - HCT116-cellijn</td><td>ATCC</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Hardwood Hamer</td><td></td><td></td><td>Elk hamergereedschap kan worden gebruikt, er is geen specifiek merk.</td></tr><tr><td>Inductief gekoppeld plasma massaspectrometer (ICP-MS)</td><td>Perkin Elmer</td><td>ELAN 9000 ICP-MS</td><td>De gebruikte software is 'Elan instrument control session'</td></tr><tr><td>Laboratorium Retort Stand met Klem</td><td>RVFM</td><td>13-0140</td><td>Dit wordt gebruikt om de 5 mL glasbuis in het sonicatorbad te hanteren.</td></tr><tr><td>Magnetisch rek (DynaMag-2 Magneet)</td><td>Thermofisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>McCoy&rsquo;s 5A Medium 1x</td><td>Gibco</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>Microplate lezer (Bio-Rad xMark Absorptie Spectrofotometer)</td><td>Bio-Rad</td><td>1681150</td><td>Microplate Manager 6 software (#168-9520)</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 10x</td><td>Gibco</td><td>14200067</td><td>Concentratie 0,1 M (Geen calcium, geen magnesium)</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) 1x</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td>Concentratie 0,01 M (Geen calcium, geen magnesium)</td></tr><tr><td>Plate shaker (Microplate Genie)</td><td>Scientific Industries (Genie)</td><td>SI-0400</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Scheermessen</td><td>Polysciences</td><td>08410-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodiumhydroxide (NaOH)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2</td><td>Concentratie 1 M, pH 13</td></tr><tr><td>Sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS)</td><td>Thermofisher</td><td>106627-54-7</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>ATCC</td><td>30-2101</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Tube shaker (Eppendorf Thermomixer R Mixer, 2,0 mL)</td><td>Eppendorf, Fisherscientific</td><td>05-400-204</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasoonbad (2510)</td><td>Branson</td><td>2489502</td><td></td></tr></tbody></table>

biofunctionalisering van magnetische nanomaterialen

Biofunctionalization of Magnetic Nanomaterials

Magnetische nanomaterialen hebben veel aandacht gekregen in verschillende biomedische toepassingen. Het biofunctionaliseren van deze nanomaterialen met specifieke doelgerichte middelen is een cruciaal aspect om hun werkzaamheid in diagnostiek en behandelingen te verbeteren en tegelijkertijd de bijwerkingen te minimaliseren. Het voordeel van magnetische nanomaterialen ten opzichte van niet-magnetische nanomaterialen is hun vermogen om contactloos en over grote afstanden te reageren op magnetische velden. Dit maakt het mogelijk om ze te begeleiden of te accumuleren, terwijl ze ook kunnen worden gemonitord. Onlangs zijn magnetische nanodraden (NW's) met unieke eigenschappen ontwikkeld voor biomedische toepassingen. Het grote magnetische moment van deze NW's maakt een efficiëntere afstandsbediening van hun beweging mogelijk door middel van een magnetisch veld. Dit is met groot succes gebruikt bij de behandeling van kanker, medicijnafgifte, celtracering, stamceldifferentiatie of magnetische resonantiebeeldvorming. Bovendien biedt de NW-fabricage door middel van sjabloonondersteunde elektrochemische afzetting een veelzijdige methode met strakke controle over de NW-eigenschappen. Vooral ijzer-NW's en ijzer-ijzeroxide (kern-schaal) NW's zijn geschikt voor biomedische toepassingen, vanwege hun hoge magnetisatie en lage toxiciteit.
In dit werk bieden we een methode om ijzer/ijzeroxide NW's te biofunctionaliseren met specifieke antilichamen gericht tegen een specifieke celoppervlaktemarker die tot overexpressie wordt gebracht in een groot aantal kankercellen. Omdat de methode gebruik maakt van de eigenschappen van het ijzeroxideoppervlak, is het ook van toepassing op superparamagnetische ijzeroxide-nanodeeltjes. De NW's worden eerst gecoat met 3-aminopropyl-tri-ethoxy-silaan (APTES) dat als een linker fungeert, waaraan de antilichamen covalent worden gehecht. De APTES-coating en de biofunctionalisering van antilichamen worden bewezen door elektronenenergieverliesspectroscopie (EELS) en zeta-potentiaalmetingen. Daarnaast wordt de antigeniciteit van de antilichamen op de NW's getest door gebruik te maken van immunoprecipitatie en western blot. De specifieke targeting van de gebiofunctionaliseerde NW's en hun biocompatibiliteit worden bestudeerd door confocale microscopie en een cellevensvatbaarheidstest.

Het is belangrijk om de aluminium (Al) schijven (Figuur 2A) in kleine stukjes (Figuur 2B) te snijden om in de gebruikte buis te passen. Na het toevoegen van 1 M NaOH aan de Al-stukken, moet onmiddellijk een reactie beginnen, die wordt waargenomen door het creëren van bellen. Als er binnen 1 minuut geen reactie optreedt of als de reactie erg snel is en de oplossing volledig troebel wordt met een witte wolk, verwijder dan onmiddellijk de oude NaOH-oplossing en vervang deze door een nieuwe oplossing. Controleer de pH-waarde van de NaOH-oplossing. Het moet pH>12 zijn. Wanneer de NW's in de eerste 30 minuten met NaOH uit de Al-stukken worden losgelaten, zullen de NW's (zwarte clusters, Figuur 3A) in de NaOH-oplossing zweven. In de laatste stap van het vrijgeven van de NW's moet de oplossing homogeen zijn. Er mag geen cluster van NW's zijn (Figuur 3B). Als NW's gedurende 3 minuten met een magneet werden verzameld, moet de oplossing helder zijn en moet de NW-pellet zwart zijn (Figuur 3C). Als de pellet grijs was, gooi dan de buis weg en begin opnieuw met een nieuw Al-monster.
Tijdens het vrijgaveproces verkrijgen de NW's een natuurlijke ijzeroxidelaag met een dikte van ongeveer 5 nm, wat vergelijkbaar is met eerdere rapporten11,16,20. Deze oxidelaag heeft een belangrijke bijdrage aan de biocompatibiliteit 16, functionalisatie16,18 en magnetische eigenschappen20 van de NW's. Door de NW's echter in hun sjabloon te houden (d.w.z. ze niet vrij te geven) totdat ze nodig zijn, worden ze niet beschermd tegen milieueffecten. De gemiddelde diameter en lengte van de NW's na het vrijgaveproces waren respectievelijk 2,5 μm en 41,5 nm. De massa van een enkele NW kan worden berekend zoals uitgelegd in tabel 1 en wordt bevestigd door inductief gekoppelde plasmamassaspectroscopie (ICP-MS). Hier bevatte elke aluminiumoxideschijf ongeveer 0,3 mg ijzer.
Om de aggregatie van de NW's na het vrijgeven te verminderen en verdere functionalisering mogelijk te maken, werden de NW's gecoat met APTES. Deze coating levert vrije aminegroepen en heeft de mogelijkheid om zowel magnetische als niet-magnetische materialen te coaten39,45, waardoor het geschikt is voor het coaten van NW's met meerdere segmenten, zoals ijzer/gouden NW's. Tijdens de coating van nanodraden is het belangrijk om op twee dingen te focussen. Bereken eerst het benodigde volume van APTES-moleculen62 op basis van het oppervlak en de massa van de NW's. Deze berekeningen zijn weergegeven in tabel 2. Ten tweede, houd de nanodraden in een continue beweging om te voorkomen dat ze samenklonteren en dat sommige delen van NW-oppervlakken worden geblokkeerd door APTES-coating. In dit protocol werden de nanodraden bijvoorbeeld geïncubeerd onder het ultrasone bad en de rotator tijdens respectievelijk de APTES-coating en de functionalisering van antilichamen. Elk APTES-molecuul bevat een siliciumatoom en een terminale functionele aminegroep21. Daarom kunnen elektronenenergieverliesspectroscopie (EELS)-kaarten worden gebruikt om de aanwezigheid van de APTES-coating te bevestigen door siliciumatomen (roze kleur) op het NW-oppervlak weer te geven (Figuur 4A). De niet-gecoate NW's tonen daarentegen de ijzeratomen in schorsblauw (Figuur 4B) en ijzer/zuurstofmengselatomen in lichtblauw (Figuur 4B). De overeenkomstige EELS-mapping van niet-gecoate NW's (Figuur 4C,4D) toont een hogere intensiteit van ijzer versus zuurstof in het centrum (Figuur 4C) dan aan het oppervlak (Figuur 4D), wat wijst op een ijzer-ijzeroxide (kern-schaal) structuur. Uit de EELS-mapping (figuur 4 C,4D) bleek dat de ijzeroxidelaag op de NW's Fe 3 O4 meer is dan Fe2O3, wat vergelijkbaar is met een eerdere publicatie20.
De antigeniciteit van de aangehechte antilichamen kan worden bevestigd met behulp van de IP- en WB-assays, waarbij een band kan worden waargenomen op het positieve monster, maar niet op de negatieve controles (figuur 5). Merk op dat om een duidelijke band in acht te nemen, u niet minder dan 0,1 mg NW's/10 x 106 cellen mag gebruiken. De BCA-test (Table of Materials) in combinatie met enkele berekeningen in tabel 3 werd gebruikt om het aantal antilichamen op de NW te kwantificeren.
Verder werd de zeta-potentiaalmeting gebruikt om de oppervlaktefunctionalisatie op te helderen. De terminale aminegroep op APTES verminderde de negatieve lading van de niet-gecoate NW's, zoals weergegeven in figuur 6. De met antilichamen gefunctionaliseerde NW's veranderden ook de lading in vergelijking met de met APTES gecoate NW's (Figuur 6). Alle zeta-potentiaalmetingen werden gedaan bij pH 7.
De specifieke celtargeting van de antilichaam-gefunctionaliseerde NW's kan worden bevestigd met behulp van confocale microscopie (Figuur 7). De biocompatibiliteit van elk nieuw nanomateriaal moet worden getest voordat met een toepassing wordt begonnen. Daarom werd de cellevensvatbaarheidstest gebruikt, die bevestigde dat de niet-gecoate, APTES-gecoate en antilichaam-gecoate NW's biocompatibel waren, zelfs met een hoge concentratie (Figuur 8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig01.jpg"> Figuur 1: Schematisch geeft de coating- en biofunctionalisatiemethode van de nanodraden weer. (A) Strijkijzer NW's coaten met APTES. (B) Het activeren van de antilichamen met behulp van EDC + Sulfo-NHS, om aan het einde (C) een antilichaam gefunctionaliseerde nanodraad te hebben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig02.jpg"> Figuur 2: IJzeren afgezette aluminium schijf. (A) De aluminium schijf voor het snijden. (B) De rode lijnen gaven aan waar de schijf moest worden gesneden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig03.jpg"> Figuur 3: Stappen voor het losmaken van nanodraad. (A) Clusters van nanodraden drijven in de NaOH-oplossing. De foto is gemaakt 10 minuten na het toevoegen van de NaOH en na het verwijderen van het Al-membraan. (B) Nanodraden gesuspendeerd in ethanol. De foto is genomen in de laatste loslaatstap, direct na de sonicatiestap. (C) Zwarte nanodraadkorrel verzameld door een magneet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig04.jpg"> Figuur 4: Elektronen-energieverliesspectroscopie (EELS)-kaart. (A) APTES-gecoate nanodraad (APTES-NW). De blauwe en roze kleuren vertegenwoordigen respectievelijk ijzer- en siliciumatomen. (B) Niet-gecoate nanodraad (NW). De blauwe en lichtblauwe kleuren van de schors vertegenwoordigen respectievelijk de ijzer- en ijzer/zuurstofmixmapping. De bijbehorende EELS-mapping van (C) de kern en (D) de schil van de niet-gecoate NW's. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig05.jpg"> Figuur 5: Bevestiging van functionalisatie en activiteit van antilichaam geconjugeerde nanodraden. De antigeniciteit van CD44-NW's werd bevestigd door gebruik te maken van immunoprecipitatie (IP) en western blot (WB). +Ve: staat voor de positieve controle (volcellig lysaat). -Ve: vertegenwoordigt de negatieve controle (alleen niet-gecoate NW). – CD44-cellen: vertegenwoordigt cellen die geen CD44-antigeen tot expressie brengen; + CD44-cellen: vertegenwoordigt darmkankercellen die CD44-antigeen tot expressie brengen. Dit is een representatieve vlek van n = 3 onafhankelijke experimenten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig06.jpg"> Figuur 6: Zeta-potentiaalwaarden voor NW's, APTES-NW's en antilichamen. De balken vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaardfout. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig07.jpg"> Figuur 7: Confocale microscopische beelden tonen de specifieke targeting. CD44-NW's worden getoond als hechtende (A en C), terwijl de Isotype-NW's (negatieve controle) niet hechten (B en D). De rode, blauwe en groene kleuren vertegenwoordigen respectievelijk het celmembraan, de kern en het cluster van CD44-NW's. A en B zijn de heldere veldbeelden van respectievelijk C en D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61360/61360fig08.jpg"> Figuur 8: Cellevensvatbaarheidsstudie van darmkankercellen (HCT116) geïncubeerd met verschillende formuleringen van nanodraden. De cellen werden na 24 uur incubatie behandeld met NW's en vervolgens 24 uur geïncubeerd met de NW's. Alle experimenten werden uitgevoerd in een incubator bij 37 °C. De balken vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaardfout. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61360/61360fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parameter</td>
			<td>Waarde</td>
			<td>Eenheid</td>
			<td rowspan="6"></td>
			<td rowspan="6"></td>
		</tr><tr><td>Lengte van Fe NW (h)</td>
			<td>2.6</td>
			<td>μm</td>
		</tr><tr><td>Straal (diameter/2) (r)</td>
			<td>0.01679231</td>
			<td>μm</td>
		</tr><tr><td>Fe-dichtheid (D)</td>
			<td>7.87</td>
			<td>g/cm3</td>
		</tr><tr><td>1 Fe NW volume (V)= π r^2h</td>
			<td>2.30E-15</td>
			<td>cm3</td>
		</tr><tr><td>1 Fe NW massa = V x D</td>
			<td>1.80E-08</td>
			<td>μg</td>
		</tr><tr><td>1 Fe NW oppervlakte = 2π r^2 + 2πrh</td>
			<td>2.76E-01</td>
			<td>μm2</td>
			<td>2.8E+05</td>
			<td>NM2</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Berekening van de NW-massa van het ijzer.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Parameter</td>
			<td>Waarde</td>
			<td>Eenheid</td>
		</tr><tr><td>Dichtheid van APTES/100 μL*</td>
			<td>9.50E-01</td>
			<td>g</td>
		</tr><tr><td>Molecuulgewicht (MW) van APTES</td>
			<td>2,21E+02</td>
			<td>g/mol</td>
		</tr><tr><td>Aantal APTES-mol = massa/MW</td>
			<td>4.29E-03</td>
			<td>Mol</td>
		</tr><tr><td>Aantal APTES-moleculen/100 μL**</td>
			<td>2.57E+21</td>
			<td>Moleculen</td>
		</tr><tr><td>APTES maat ***</td>
			<td>5.00E-01</td>
			<td>Nm</td>
		</tr><tr><td>APTES oppervlakte</td>
			<td>2.00E-01</td>
			<td>NM2</td>
		</tr><tr><td>NW oppervlakte****</td>
			<td>2,76E+05</td>
			<td>NM2</td>
		</tr><tr><td>Aantal NW's in 0,3 mg NW ****</td>
			<td>1.70E+10</td>
			<td>Nws</td>
		</tr><tr><td>Aantal APTES-moleculen dat nodig is om één laag rond het NW te creëren</td>
			<td>1,38E+06</td>
			<td>APTES-molecuul</td>
		</tr><tr><td>Aantal APTES-moleculen dat nodig is voor 0,3 mg NW's</td>
			<td>2.35E+16</td>
			<td>APTES-molecuul</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Referentienummer 61</td>
		</tr><tr><td colspan="3">** Aantal moleculen = Aantal mol*avogadro aantal (6E+23)</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Referentienummer 62</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Uit tabel 1</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Bereken het aantal APTES-moleculen dat nodig is voor het coaten van NW's.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> </td>
			<td>Y-vormig IgG-antilichaam</td>
			<td>NW</td>
		</tr><tr><td>Massa voor één antilichaam</td>
			<td>2,3E-13 μg</td>
			<td>1,8E-08 μg*</td>
		</tr><tr><td>Oppervlakte voor één antilichaam</td>
			<td>23 NM2</td>
			<td>2.6E+05 nm2</td>
		</tr><tr><td>Gebaseerd op BCA-test</td>
			<td colspan="2">0,3 mg per 1 mg</td>
		</tr><tr><td>Het getal van het antilichaammolecuul en NW in 0,3 mg antilichaam per mg NW</td>
			<td colspan="2">~1E+15 antilichamen ** per ~5.6E+10 NWs</td>
		</tr><tr><td>Aantal antilichaammoleculen per NW</td>
			<td colspan="2">~2E+04 antilichamen per 1 NW***</td>
		</tr><tr><td colspan="3">*Berekend op basis van tabel 1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">**Het aantal antilichamen in 0,3 mg werd berekend door het aantal antilichamen dat we ontvingen van de BSA-test (0,3 mg) te delen door het gemiddelde molecuulgewicht van Y-vormige IgG-antilichamen (180 kDa = 3E-16 mg).</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Op basis van het oppervlak van één molecuul Y-vormige IgG-antilichamen (~23 nm2) en het oppervlak van één NW (~2.6E+05 nm2), zouden ongeveer 1E+04 antilichamen voldoende zijn om een monolaag op het NW te creëren. In ons geval was de dichtheid van antilichamen twee keer meer dan de verwachte hoeveelheid. Dit kan te maken hebben met de APTES-coating die zorgt voor meer armen die de hoge hechting van de antilichamen mogelijk maken. Dit geval zorgt ervoor dat de NW volledig bedekt is met de antilichamen en dat de kans voor het antilichaam om te binden aan een antigeen op het celoppervlak, ongeacht de oriëntatie van de NW's, hoog zal zijn. Als de dichtheid van de antilichamen echter lager is dan het verwachte aantal (1E+04 molecuul antilichaam), dan zal de bindingskans tussen de cel en de NW's lager zijn.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: Berekening van het aantal antilichamen op de nanodraad.

In dit werk bieden we een protocol om magnetische nanomaterialen te biofunctionaliseren met antilichamen voor specifieke celtargeting. We gebruiken bijvoorbeeld ijzeren nanodraden om kankercellen aan te pakken.

Biofunctionalisering van magnetische nanomaterialen

Magnetic nanomaterials have received great attention in different biomedical applications. Biofunctionalizing these nanomaterials with specific targeting ...

Het belangrijkste kenmerk van dit protocol is dat het toepasbaar is op een breed scala aan ijzer-ijzeroxide nanomateriaal. Ook kan het worden toegepast op meervoudig gesegmenteerde nanomaterialen, zoals ijzer-goud nanodraden. Dit protocol kan veilig worden uitgevoerd in elke standaard biologische laboratorium.De belangrijkste voordelen van deze biofunctionalisatietechniek is de mogelijkheid om een specifiek gericht nanomateriaal te produceren op basis van een sterke covalente binding tussen de nanodraad en de antilichamen. Begin door de aluminium schijven met een enkelzijdig mes en een kleine hamer in kleine stukken te snijden. Plaats de gesneden stukken in een tweeduizend milliliter buis en vul deze met één milliliter een-molar natriumhydroxide, zorg ervoor dat alle aluminium stukken bedekt zijn.Laat de buis gedurende 30 minuten op kamertemperatuur in een chemische afzuigkap. Na de incubatie verwijdert u de aluminium stukken met een pincet en bewaart u de vrijgekomen nanodraden in natriumhydroxide gedurende nog eens 30 minuten. Plaats de buis in een magnetisch droogrek, wacht twee minuten en vervang de oplossing door verse natriumhydroxide.Soniceer de tweeduizend milliliter buis met de nanodraden gedurende 30 seconden en laat het een uur in een chemische afzuigkap staan. Herhaal deze stap minimaal vier keer. Wanneer u klaar bent, plaatst u de tweeduizend milliliter buis in het magnetische rek, gooit u het natriumhydroxide weg en vervangt u het door één milliliter absoluut ethanol.Soniceer de nanodraden gedurende 30 seconden, plaats de buis in het magnetische rek en vervang het ethanol. Herhaal de ethanol wassing minimaal vier keer. Nadat u de nanodraden hebt gewassen, brengt u ze over in een vijf milliliter glazen buis met een een-milliliter pipet.Voeg 100 microliter APTES toe aan de nanodraadoplossing en vortex de glazen buis gedurende 20 seconden. Plaats de buis in een ultrasoon bad en soniceer het gedurende één uur. Neem vervolgens de buis uit het bad en voeg 400 microliter gedeïoniseerd water en 20 microliter een-molar natriumhydroxide toe.Herhaal de een-uur sonicatie. Nadat u de glazen buis uit het ultrasoon bad hebt gehaald, plaatst u deze naast een magneet om de nanodraden te verzamelen. Vervang het supernatant door één milliliter verse absolute ethanol en soniceer de buis gedurende 10 seconden.Herhaal de ethanol wassing en sonicatie twee keer. Los 0,4 milligram EDC en 1,1 milligram Sulfo-NHS en één milliliter MES op in een tweeduizend milliliter buis. In een andere tweeduizend milliliter buis, voegt u 960 microliter 0,1-molar PBS toe en voegt u 30 microliter anti-CD44 antilichaam toe.Voeg vervolgens 10 microliter van het eerder bereide EDC/Sulfo-NHS mengsel toe aan deze buis. Plaats de antilichaam buis in een shaker en schud hem gedurende 15 minuten op kamertemperatuur bij 10 keer G. Plaats ondertussen een magneet naast de buis met de APTES-gecoate nanodraden gedurende twee minuten, gooit u de ethanol weg en vervangt u het door PBS.Soniceer de nanodraden gedurende 10 seconden. Na de laatste wassing met PBS, verzamelt u de nanodraden en brengt u de geactiveerde antilichaamoplossing over naar de nanodradenbuis. Soniceer het vervolgens gedurende 10 seconden.Vervang de buis in de rotator overnacht bij vier graden Celsius. De volgende dag verzamelt u de nanodraden met de magneet en gooit u het supernatant weg. Voeg één milliliter 2% BSA toe en incubeer de buis gedurende één uur bij vier graden Celsius om de reactie te blokkeren.Elektronenenergieverliesspectroscopie of EELS kaarten kunnen worden gebruikt om de siliciumatomen op het nanodraadoppervlak te visualiseren en de aanwezigheid van de APTES coating te bevestigen. Op de niet-gecoate nanodraden zien de ijzeratomen er donkerblauw uit en de ijzer- en zuurstofgemengde atomen zijn lichtblauw. De bijbehorende EELS mapping van niet-gecoate nanodraden toont een hogere intensiteit van ijzer versus zuurstof in het centrum dan op het oppervlak, wat wijst op een ijzer-ijzeroxidestructuur.De mapping toonde aan dat de ijzeroxidelaag meer ijzer(II, III)oxide bevat dan ijzer(III)oxide. De antigeniciteit van de gehechte antilichamen werd bevestigd met behulp van immunoprecipitatie en western blot analyses. De BCA-test werd gebruikt om het aantal antilichamen op de nanodraden te kwantificeren.Meting van zetapotentiaal werd gebruikt om de oppervlaktefunctionalisatie te verduidelijken. De terminale aminegroep op APTES verminderde de negatieve lading in vergelijking met niet-gecoate nanodraden. Antilichaamboxfunctie verminderde de lading verder.De specifieke celtargeting van de antilichaamboxgefunctionaliseerde nanodraden werd bevestigd met behulp van confocale microscopie. Figuren A en B vertegenwoordigen de lichtveldmicroscoopbeelden van specimen C en D respectievelijk. De kleur rood komt overeen met de afbeelding van de celmembraan, blauw vertegenwoordigt de kern en de groene clusters geven de aanwezigheid van gehechtte, gerichte CD44 nanodraden aan.Bovendien werd de cellevensvatbaarheidstest gebruikt om te verifiëren dat de niet-gecoate, APTES-gecoate en antilichaamboxgecoate nanodraden biocompatibel waren. Bij het APTES-procescoating is het erg belangrijk om het gedeïoniseerd water toe te voegen vóór de natriumhydroxide-oplossing om de binding tussen het APTES-molecuul en de nanodraden te verbeteren. Ook is het tijdens het biofunctionalisatieproces noodzakelijk om de nanodraad een paar keer met PBS-buffer te wassen om de covalente binding tussen het antilichaam en de nanodraden te verbeteren.

biofunctionalization-of-magnetic-nanomaterials

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Hier beschrijven we een protocol voor de synthese van magneto-plasmon nanodeeltjes met een sterk magnetisch moment en een sterke nabij-infrarood (NIR) absorptie. Het protocol omvat ook antilichaam conjugatie aan de nanodeeltjes door de Fc eenheid voor diverse biomedische toepassingen die moleculaire specifieke targeting vereisen.

Synthese van Immunotargeted Magneto-plasmonische Nanoclusters

Dit protocol beschrijft de synthese van biofunctionele Pruisisch blauwe nanodeeltjes en hun gebruik als multimodale, moleculaire beeldvormingsmiddelen. De nanodeeltjes hebben een kern-schaal ontwerp waarbij gadolinium- of mangaanionen in de nanodeeltjekern MRI-contrast genereren. De biofunctionele schaal bevat fluoroforen voor fluorescentiebeeldvorming en targeting liganden voor moleculaire targeting.

Biofunctionalized Pruisisch blauw nanopartikels voor Multimodaal Molecular Imaging Toepassingen

Hier presenteren we een protocol om bacteriële nanocellulose (BNC) magnetisch te maken voor toepassingen bij de reconstructie van beschadigde bloedvaten. De BNC werd gesynthetiseerd door de G. xylinus-stam. Aan de andere kant werd de magnetisatie van de BNC gerealiseerd door in situ precipitatie van Fe2+ en Fe3+ ijzerionen binnenin het BNC-maashek.

Fabricage van een gefunctionaliseerd Magnetic Bacterial Nanocellulose met ijzeroxide Nanodeeltjes

Gerichte celbezorging is nuttig in een verscheidenheid aan biomedische toepassingen. Het doel van dit protocol is om superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes (SPION) te gebruiken om cellen te labelen en daardoor magnetische celaanpakbenaderingen mogelijk te maken voor een hoge mate van controle over celbezorging en -lokalisatie.

Cel Labeling en Targeting met superparamagnetische ijzeroxide Nanodeeltjes

Er wordt een protocol voor de synthese en kationisatie van kobalt-gedopeerd magnetoferritine gepresenteerd, evenals een methode om stamcellen snel te magnetiseren met gekationiseerd magnetoferritine.

Synthese van gekationiseerde Magnetoferritin voor ultrasnelle magnetisatie van Cells

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Dit werk beschrijft protocollen voor de bereiding van magnetische nanodeeltjes, de coating met SiO2, gevolgd door de amine functionalisatie met (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) en de vermenging met deferoxamine met behulp van een succinyl moiety als linker. Een diepe structurele karakteriseringsbeschrijving en een vangstbacteriëntest met behulp van Y. enterocolitica voor alle tussenliggende nanodeeltjes en de uiteindelijke conjugaat worden ook in detail beschreven.

Synthese van gefunctionaliseerde magnetische nanodeeltjes, hun vervoeging met de Siderophore Feroxamine en de evaluatie voor bacteriën detectie

IJzeroxide nanodeeltjes worden gesynthetiseerd via een nonaqueous sol gel procedure en bedekt met anionische korte moleculen of polymeer. Het gebruik van magnetometrie voor het monitoren van de integratie en biotransformaties van magnetische nanodeeltjes in menselijke stamcellen wordt aangetoond met behulp van een trillende monstermagnetometer (VSM).

Magnetometrie gebruiken om cellulaire integratie en daaropvolgende biologische afbraak van chemisch gesynthetiseerde ijzeroxide nanodeeltjes te monitoren

Dit werk presenteert een bottom-up benadering van de engineering van lokale magnetische krachten voor controle van neuronale organisatie. Neuron-achtige cellen geladen met magnetische nanodeeltjes (MNP's) worden bovenop geplateerd en bestuurd door een micro-patroon platform met loodrechte magnetisatie. Ook beschreven zijn magnetische karakterisering, MNP cellulaire opname, cel levensvatbaarheid, en statistische analyse.

Fabricage van magnetische platforms voor micronschaalorganisatie van onderling verbonden neuronen

We rapporteren een eenpotige hydrothermale synthese van mangaan ferrietclusters (MFC's) die onafhankelijke controle biedt over de materiaaldimensie en -samenstelling. Magnetische scheiding maakt een snelle zuivering mogelijk, terwijl oppervlaktefunctionalisatie met behulp van gesulfoneerde polymeren ervoor zorgt dat de materialen niet-aggregerend zijn in biologisch relevant medium. De resulterende producten zijn goed gepositioneerd voor biomedische toepassingen.

Stabiele waterige suspensies van mangaan ferrietclusters met instelbare nanoschaaldimensie en -samenstelling

Leer biofunctionalisatie van magnetische nanomaterialen met antilichamen voor gerichte kankerceltherapie met ijzernanodraden. Deze methode maakt veilige, specifieke therapeutische toepassingen mogelijk.

Biofunctionalisering van magnetische nanomaterialen

Meer video's verkennen