Name: Live-Cell Forward Genetische Benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in Chlamydia trachomatis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Leer een live-cel forward genetische methode om ontwikkelingsmutanten in Chlamydia trachomatis te identificeren en isoleren. Deze techniek maakt real-time tracking van celtype-ontwikkeling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Anders Omsland van de Washington State University voor het leveren van de CIP-1 axenic media. Dit werk werd ondersteund door NIH grant R01AI130072, R21AI135691 en R21AI113617. Aanvullende ondersteuning werd geboden door startkapitaal van de Universiteit van Idaho en het Center for Modeling Complex Interactions via hun NIH-subsidie P20GM104420.

<ol><li>AbdelRahman, Y., Belland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chlamydial+developmental+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The chlamydial developmental cycle.</a> FEMS Microbiology Reviews. 29 (5), 949-959 (2005).</li>
<li>Clifton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chlamydial+type+III+translocated+protein+is+tyrosine-phosphorylated+at+the+site+of+entry+and+associated+with+recruitment+of+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).</li>
<li>Yu, H. H. Y., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CF%8328+RNA+polymerase+regulates+hctB%2C+a+late+developmental+gene+in+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">σ28 RNA polymerase regulates hctB, a late developmental gene in Chlamydia.</a> Molecular Microbiology. 50 (2), 577-584 (2003).</li>
<li>Koo, I., Stephens, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Developmentally+Regulated+Two-component+Signal+Transduction+System+in+Chlamydia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A Developmentally Regulated Two-component Signal Transduction System in Chlamydia.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 17314-17319 (2003).</li>
<li>Grieshaber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Active+Metabolism+on+Elementary+Body+Transcript+Profile+and+Infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity.</a> Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065(2018).</li>
<li>Belland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+transcriptional+profiling+of+the+developmental+cycle+of%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 100 (14), 8478-8483 (2003).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transformation+system+for+Chlamydia+trachomatis%3A+restoration+of+glycogen+biosynthesis+by+acquisition+of+a+plasmid+shuttle+vector%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Development of a transformation system for Chlamydia trachomatis: restoration of glycogen biosynthesis by acquisition of a plasmid shuttle vector.</a> PLoS Pathogens. 7 (9), 1002258(2011).</li>
<li>Nguyen, B., Valdivia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+determinants+in+the+obligate+intracellular+pathogen+Chlamydia+trachomatis+revealed+by+forward+genetic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Virulence determinants in the obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis revealed by forward genetic approaches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (4), 1263-1268 (2012).</li>
<li>Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Deletion+by+Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> MBio. 7 (1), 01817(2016).</li>
<li>Rosario, C. J., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+gene+product+EUO+is+a+transcriptional+repressor+that+selectively+regulates+promoters+of+Chlamydia+late+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes.</a> Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).</li>
<li>Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+expression+of+hctB+encoding+a+strain-variant+chlamydial+histone-like+protein+with+DNA-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity.</a> Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).</li>
<li>Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+metabolic+and+transcriptional+activity+of+Chlamydia+trachomatis+in+an+axenic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+binds+to+heparan+sulfate+receptors+on+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).</li>
<li>Edelstein, A., et al. Computer control of microscopes using µManager. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEdelstein%2C+A+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , Chapter 14-20 (2010).</li>
<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
<li>Plotly Technologies Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Collaborative+data+science%22">Collaborative data science</a>. , Montréal, QC. https://plot.ly (2015).</li>
<li>Lam, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+FRET+dynamic+range+with+bright+green+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).</li>
<li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-red+fluorescent+tags+for+protein+imaging+in+living+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues.</a> Biochemical Journal. 418 (3), 567-574 (2009).</li>
<li>Sega, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+genetic+effects+of+ethyl+methanesulfonate%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">A review of the genetic effects of ethyl methanesulfonate.</a> Mutation Research. 134 (2-3), 113-142 (1984).</li>
<li>Ferguson, L., Denny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutagenesis+by+acridines+and+other+reversibly+binding+DNA+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands.</a> Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het ontleden van de mechanismen die de chlamydial ontwikkelingscyclus controleren is belemmerd door de beperkingen van de momenteel beschikbare genetische hulpmiddelen. In dienst van onze promotor-reporter Chlamydia in combinatie met live-cel geautomatiseerde microscopie, werd een systeem gebouwd dat het mogelijk maakt monitoring van cel-type ontwikkeling in individuele insluitsels over een periode van 24 uur. Dit systeem, in combinatie met chemische mutagenese en directe inclusieisolatie, heeft een methode ontw...

Chlamydia trachomatis (Ctr) is een obligate intracellulaire ziekteverwekker die vordert door middel van een bifasische ontwikkelingscyclus die essentieel is voor zijn voortbestaan en proliferatie1. Deze cyclus bestaat uit twee ontwikkelingsvormen, het elementaire lichaam (EB) en het reticulate lichaam (RB). De EB is replicatie incompetent, maar bemiddelt celinvasie door middel van effector geïnduceerde endocytose2. Eenmaal in de gastheer, de EB rijpt om de replicative RB. De RB voert meerdere rondes van replicatie voorafgaand aan het omzetten terug naar de EB om latere rondes van infectie te starten.
De beperkte reeks van genetische hulpmiddelen heeft beperkt het grootste deel van het chlamydial onderzoek tot biochemische studies of het gebruik van surrogaatsystemen. Als gevolg daarvan was de opheldering van de genregulatie en de controle van de ontwikkelingscyclus moeilijk3,4. Een van de belangrijkste uitdagingen op chlamydial gebied is de hoge resolutie temporele tracking van de chlamydial ontwikkelingscyclus en de identificatie van de eiwitten die betrokken zijn bij de regelgeving. Genexpressie tijdens de chlamydial ontwikkelingscyclus wordt traditioneel uitgevoerd door destructieve "eindpunt"-methoden, waaronder RNAseq, qPCR en vaste celmicroscopie5,6. Hoewel deze methoden waardevolle informatie hebben verstrekt, zijn de gebruikte technieken moeizaam en hebben ze een lage temporele resolutie5,6.
In het afgelopen decennium is de genetische manipulatie van Ctr gevorderd met de invoering van plasmidetransformatie en methoden voor mutagenesis7,8,9. Voor deze studie werd een plasmidengebaseerd systeem ontwikkeld om de chlamydial ontwikkeling in individuele insluitsels in real time in de loop van een infectie te monitoren. Er werd een chlamydial transformant gecreëerd die zowel een RB als een EB-celtype specifieke promotor-reporter uitdrukte. De RB specifieke verslaggever werd gebouwd door het fuseren van de promotor van de vroege RB gen euo stroomopwaarts van het fluorescerende eiwit Clover. EUO is een transcriptie regulator die onderdrukt een subset van late EB geassocieerde genen10. De promotor van hctB, die codeert een histone-achtige eiwit betrokken bij EB nucleoïde condensatie, werd gekloond direct stroomopwaarts van mKate2 (RFP) om de EB specifieke verslaggever11te creëren . De ruggengraat voor hctBprom-mKate2/euoprom-Clover was p2TK2SW27. De hctB en euo promotors werden versterkt uit Ctr-L2 genomic DNA. Elke promotor sequentie bestond uit ~ 100 basisparen stroomopwaarts van de voorspelde transcriptie startplaats voor het opgegeven chlamydial gen plus de eerste 30 nucleotide (10 aminozuren) van de respectieve ORF. De fluorescerende FP varianten werden commercieel verkregen als Ctr codon geoptimaliseerde genblokken en gekloond in frame met de eerste 30 nucleotide van elk chlamydial gen en promotor. De incD terminator werd gekloond direct stroomafwaarts van mKate2. De tweede promotor-verslaggever werd ingevoegd stroomafwaarts van de incD terminator. Het ampicilline resistentiegen(bla)in p2TK2SW2 werd vervangen door het aadA-gen (Spectinomycin resistance) van pBam4. Dit resulteerde in de uiteindelijke construct p2TK2-hctBprom-mKate2/euoprom-Clover (Figuur 1A) die werd omgezet in Ctr-L27. Deze RB/EB reporter stam zorgde voor de observatie van de ontwikkelingscyclus binnen enkele insluitsels met behulp van live-cel microscopie (figuur 1B,C).
Met behulp van onze promotor-reporter constructie in combinatie met chemische mutagenese, werd een protocol bedacht om individuele klonen te volgen en te isoleren die ontwikkelingsafwijkingen vertoonden van gemutagenized populaties van Ctr serovar L2. Dit protocol maakt het mogelijk voor de directe monitoring van individuele chlamydia-opnemingen, het bijhouden van de genexpressieprofielen in de tijd, het identificeren van chlamydia klonen die een veranderd ontwikkelingsgenexpressiepatroon uitdrukken, en kloonisolatie van Chlamydia van individuele insluitsels.
Hoewel dit protocol speciaal is gemaakt voor de identificatie van genen die betrokken zijn bij chlamydial ontwikkeling, kan het gemakkelijk worden aangepast om een willekeurig aantal chlamydial genetische trajecten te ondervragen.

<table><tbody><tr><td>24-wells polystyreen platen</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>Celcultuur groei voor herinfectie van isolaten</td></tr><tr><td>6-wells glazen bodemplaten</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>Celcultuur groei voor beeldvorming</td></tr><tr><td>96-wells glazen bodemplaten</td><td>Nunc</td><td>165305</td><td>Celcultuur groei voor beeldvorming</td></tr><tr><td>Bold line CO2 Unit</td><td>OKO Labs</td><td>CO2 UNIT BL</td><td>Stage incubator CO2 controle</td></tr><tr><td>Bold line T Unit</td><td>OKO Labs</td><td>H301-T-UNIT-BL-PLUS</td><td>Stage incubator temperatuur controle</td></tr><tr><td>Borosilicaat glazen capillaire buizen</td><td>Sutter Instrument</td><td>B1005010</td><td>Capillaren</td></tr><tr><td>BrightLine bandpass emissiefilter (514/30nm)</td><td>Semrock</td><td>FF01-514/30-25</td><td>Fluorescentie filter cube</td></tr><tr><td>BrightLine bandpass emissiefilter (641/75nm)</td><td>Semrock</td><td>FF02-641/75-25</td><td>Fluorescentie filter cube</td></tr><tr><td>CellTram Vario</td><td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjector</td></tr><tr><td>Chlamydia trachmatis serovar L2</td><td>ATCC</td><td>VR-577</td><td>Chlamydia trachomatis</td></tr><tr><td>CIP-1 media</td><td>In house</td><td>NA</td><td>Axeen media. IPB aangevuld met 1% FBS, 25 &mu;M aminozuren, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT en 50 &mu;M GTP, UTP en CTP. (Omsland, A. 2012) zelf gemaakt.</td></tr><tr><td>Cos-7 cellen (ATCC)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>Afrikaanse groene aapniercel (gastheercellen)</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>MP Biomedicals</td><td>194527</td><td>Gastheercel groei remmer</td></tr><tr><td>Ethyl methanesulfonaat, 99%</td><td>Acros Organics</td><td>AC205260100</td><td>Mutagen</td></tr><tr><td>Fetal Plex</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-602</td><td>Aanvulling op basisgroeimedia</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>NA</td><td>Open source beeldanalysesoftware. https://imagej.net/Fiji</td></tr><tr><td>Galaxy 170 S CO2 incubator</td><td>Eppendorf</td><td>CO1700100X</td><td>Celcultuur incubatie</td></tr><tr><td>gblocks (Fluorescente FP varianten: Clover en mKate2)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td><td>gblock ORF's van Ctr geoptimaliseerde FP varianten voor klonen in p2TK2SW2</td></tr><tr><td>Gentamycine 10mg/ml</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td>Antibioticum voor groeimedia</td></tr><tr><td>HBSS (Hank's Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td>Gastheercellen spoelen</td></tr><tr><td>Heparine-natrium</td><td>Amersham Life Science</td><td>16920</td><td>Inhibeert en keert de vroege elektrostatische interacties tussen de gastheercel en EB's om</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30237.01</td><td>pH buffer voor groeimedia</td></tr><tr><td>InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5179 000.018</td><td>Micromanipulator</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>https://jupyter.org/</td><td>NA</td><td>Visualisatie van inclusiesporingen. https://jupyter.org/</td></tr><tr><td>Lambda 10-3</td><td>Sutter Instrument</td><td>LB10-3</td><td>Filterwiel controller</td></tr><tr><td>Oko Touch</td><td>OKO Labs</td><td>Oko Touch</td><td>Interface om de Bold line T en CO2 Unit te bedienen</td></tr><tr><td>Prior XY stage</td><td>Prior</td><td>H107</td><td>Gemotoriseerde XY microscooptafel</td></tr><tr><td>PrismR Centrifuge</td><td>Labnet</td><td>C2500-R</td><td>Temperatuur gecontroleerde microcentrifuge</td></tr><tr><td>Problot Hybridisatie oven</td><td>Labnet</td><td>H1200A</td><td>Rotsachtige incubator voor infectie met Chlamydia</td></tr><tr><td>Proscan II</td><td>Prior</td><td>H30V4</td><td>XYZ microscooptafel controller</td></tr><tr><td>Purifier Class 2 Biosafety Cabinet</td><td>Labconco</td><td>362804</td><td>Celcultuurwerk</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (geen fenolrood)</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>Basisgroeimedia voor beeldvorming</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (fenolrood)</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td>Basisgroeimedia</td></tr><tr><td>scopeLED excitatie LEDs (470nm,595nm)</td><td>scopeLED</td><td>F140</td><td>Excitatielucht</td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator Model 500</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-338-550</td><td>Sonicator, hersuspensie van chlamydiale pellet</td></tr><tr><td>Stage incubator</td><td>OKO Labs</td><td>H301-K-FRAME</td><td>Cluster welplaat incubatiekamer</td></tr><tr><td>sucrose-fosfaat-glutamaat buffer 1X (SPG)</td><td>In house</td><td>NA</td><td>Chlamydia opslagbuffer. (10 mM natriumfosfaat [8 mM K 2HPO 4, 2 mM KH 2PO 4], 220 mM sucrose, 0.50 mM L-glutaminezuur; pH 7.4)</td></tr><tr><td>T-75 Flacons</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td>Celcultuur groei</td></tr><tr><td>TE 300 omgekeerde microscoop</td><td>Nikon</td><td>16724</td><td>microscoop</td></tr><tr><td>THOR LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDD1B</td><td>Witte licht</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>Verstoort gastheercellen uit fles voor zaaien in platen</td></tr><tr><td>Zyla sCMOS</td><td>Andor</td><td>ZYLA-5.5-USB3</td><td>beeldvormingscamera</td></tr><tr><td>&micro;Manager 2.0gamma</td><td>https://github.com/micro-manager/micro-manager</td><td>NA</td><td>Open source geautomatiseerde microscoopbesturingssoftwarepakket</td></tr></tbody></table>

live-cell forward genetische benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in chlamydia trachomatis

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

De intracellulaire bacteriële ziekteverwekker Chlamydia trachomatis ondergaat een ontwikkelingscyclus bestaande uit twee morfologisch discrete ontwikkelingsvormen. Het niet-replicante elementaire lichaam (EB) initieert infectie van de gastheer. Eenmaal binnen onderscheidt de EB zich in het reticulerende lichaam (RB). De RB ondergaat vervolgens meerdere replicatierondes, voordat het zich onderscheidt van de besmettelijke EB-vorm. Deze cyclus is essentieel voor chlamydial overleving als het niet schakelen tussen celtypen voorkomt dat gastheer invasie of replicatie.
Beperkingen in genetische technieken als gevolg van de obligate intracellulaire aard van Chlamydia hebben belemmerd identificatie van de moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij de cel-type ontwikkeling. We ontwierpen een nieuwe dual promoter-reporter plasmid systeem dat, in combinatie met live-cel microscopie, zorgt voor de visualisatie van celtype schakelen in real time. Om genen te identificeren die betrokken zijn bij de regulering van de ontwikkeling van het celtype, werd het live-cel promotor-reporter systeem ingezet voor de ontwikkeling van een voorwaartse genetische benadering door chemische mutagenese van de dubbele reporter stam, beeldvorming en tracking van Chlamydia te combineren met veranderde ontwikkelingskinetiek, gevolgd door kloonisolatie van mutanten. Deze voorwaartse genetische workflow is een flexibel instrument dat kan worden aangepast voor gerichte ondervraging in een breed scala van genetische trajecten.

Directe EMS mutagenesis van onze promotor-reporter chlamydial stam resulteerde in een ~ 75% vermindering van de infectiviteit. Met behulp van de beschreven live-cell imaging protocol, ~ 600 insluitsels werden afgebeeld en bijgehouden over een periode van 24 uur. De fluorescerende expressie kinetiek van beide verslaggevers in elke opname werd gevisualiseerd met behulp van aangepaste Python notebook scripts. Twee visualisatiebenaderingen werden uitgevoerd om kandidaat mutagenized Chlamydia voor isolatie te identif...

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende promotor-verslaggevers, live-cel microscopie, en individuele opname extractie in een gerichte voorwaartse genetische benadering te identificeren en isoleren van ontwikkelingsmutanten van Chlamydia trachomatis.

Live-Cell Forward Genetische Benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in Chlamydia trachomatis

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

Dit protocol biedt een uniek hulpmiddel voor de generatie en isolatie van Chlamydia met gewijzigde ontwikkelingsprofielen, waardoor uiteindelijk de identificatie mogelijk is van de genen die de ontwikkelingscyclus reguleren. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn de mogelijkheid om chlamydia cel type ontwikkeling in real time en de mogelijkheid om chlamydia te isoleren, met alter developmental programma's te volgen. Om een chlamydia trachomatis reporter te mutageniseren, zag een chlamydial voorraad met ongeveer drie keer 10e tot de zevende elementaire lichamen.Getransformeerd met de verslaggever plasma van belang en pellet, de gedachte is gevuld door centrofugation. gebruik sonicatie op 10% vermogen gedurende 10 seconden, om de elementaire lichamen opnieuw op te stellen in 100 microliter van accidentele metabolisme buffer en split de resulterende elementaire lichaamssuspensie even, tussen twee 1,5 milliliter micro centrifuge buizen. Voeg 50 microliters van vers bereide EMS metabolisme oplossing in de chlamydia aliquots voor mutagenese en 50 microliter van vaccinic metabolisme buffer aan de chlamydial aliquot alleen voor voorraad mutagenesis en incubate beide monsters gedurende 20 minuten, bij kamertemperatuur.EMS is een bekende kankerverwekkende slijtage handschoenen tijdens het hanteren, en weken alle EMS verontreinigde apparatuur en medium, in een molaire natriumhydroxide gedurende 24 uur voor verwijdering. Het opzetten van een groothandelscultuur, voor de beeldvorming en isolatie van de gemutigeniseerde chlamydia trachometers. Zaad zes goed glazen bodemplaten, met zes keer 10 tot de vijfde kosten zeven cellen, in twee milliliter van volledige medium per put en zaad een 24 goed polystyreen plaat met 10 tot de vijfde oorzaak zeven cellen in een milliliter van volledige medium per put.Om de cultuur van de gastheercel met mutagenized te infecteren ontkent chlamydia trachomatis infecteert, vijf Putten van een glasbodemplaat met ongeveer zes keer 10 aan vijfde, van mutagenized elementaire organismen. In 1,5 milliliter ijskoude HBSS per put. en infecteren de resterende put, met ongeveer twee keer 10 tot de vijfde mock mutagenized elementaire lichamen in 1,5 milliliter ijskoude HBSS per put, na een 15 minuten incubatie bij 37 graden Celsius, met schommelen, was de geïnfecteerde cellen met 37 graden Celsius HBSS aangevuld met een milligram per milliliter heparine, onmiddellijk gevolgd door een HBSS spoeling.was de cellen opnieuw met heparine, onmiddellijk gevolgd door twee spoelingen met HBSS alleen om ervoor te zorgen dat alle heparine wordt verwijderd. Voeg na de laatste wasbeurt vier milliliter van 37 graden Celsius beeldvormingsmedium toe, aan elke put. En vul de inter well ruimtes met 37 graden Celsius gedeïstiseerd water en plaats de platen 10 uur in de couveuse van de celcultuur.Aan het einde van de incubatie zet de microscoop stadium incubator tot 5% kooldioxide, en 37 graden Celsius. En plaats de zes goed glazen bodemplaat, in de fase incubator. In de imaging software, Gebruik de high content screening plugin om de zes put plaat sjabloon te selecteren, en het genereren van een imaging positie lijst bestaande uit 12 gezichtsvelden per goed gebruik maken van de autofocus optie om de focus voor de geautomatiseerde beeldvorming in te stellen en de blootstelling in te stellen op 250 milliseconden op een 4%-intensiteit in het GFB-kanaal en een 18% in dichtheid in het RFP-kanaal.Dus op de beeldcyclus gedurende 24 uur, met intervallen van 30 minuten, om de kinetiek van de ontwikkelingscyclus vast te leggen en de beeldopname in te stellen op meerdere Z-stacks met een reeks focus die eindigt aan weerszijden van het InFocus-segment, selecteer dan relatieve Z voor beeldvorming, meerdere segmenten in het acquisitievenster en gebruik de optie afbeeldingsstackbestand. om de afbeeldingen in te stellen die moeten worden opgeslagen als TIFF-stackbestanden. Om inclusietracks te identificeren, met gewijzigde ontwikkelingsprofielen, gebruikt u de importcel in het EMS-scherm, markdown Python-notebook, om de inclusietrackgegevens van de spots in trackstatistieken te importeren, CSV-bestanden in het gegevensframe van de Panda.Gebruik de rekencel om de tijd te berekenen om maximale expressie te hebben voor zowel de vroege als de late verslaggevers voor elk nummer en gebruik het bokeh-plottenpakket, in de half max plotcel, om de tijd twee halve max expressie te visualiseren tot halve maximale expressie ten opzichte van die van hctB-prom. Gebruik de bokeh interactieve track ID Explorer, om insluitsels van de mutant populatie te identificeren, die vallen buiten de mock behandelde scatter cloud. Om veranderingen in de promotorexpressie kinetiek dynamisch in de geanimeerde bloedcelgrafiek te visualiseren de expressieintensiteiten van het prom EOU tegen hctB prom.Visualiseer vervolgens een momentopname van de geanimeerde grafiek, in de opnamezoeklos. Om de ontwikkelings newtons te isoleren, van de insluitsels van belang, positie het gezichtsveld over een put met een geïdentificeerde opname, en geef de naald over de fase differentiële interferentie contrast witte lichtkanaal lichtbron, om de naald te visualiseren, gebruik maken van de 595 nanometer, excitatie kanaal, om de elementaire lichamen te visualiseren voor extractie. En gebruik de fijne aanpassing en de micro manipulator, om de capillaire naald te manoeuvreren om de opname, breuk de opname met de naald, en gebruik de micro-injector om de elementaire lichamen te trekken in de capillaire naald tip.Verdrijft de geëxtraheerde elementaire lichamen, uit de capillaire naald in een enkele put, van de bereid op 24 put polystyreen plaat, en gebruik een nieuwe capillaire naald voor de volgende extractie. Na een voldoende uitbreiding van elk isolaat, verstoren de geïnfecteerde monolaag met een een milliliter micropipet tip en breng de medium cel puin en vrijgegeven chlamydia in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis. Pellet de geoogste chlamydia door centrifugatie, en resuspend de pellet in 75 microliters van ijskoude, sacharose fosfaat glutamaat buffer, dan split de opneming suspensie even, tussen drie nieuwe 1,5 milliliter schroef dop microcentrifuge buizen, en bewaar de buizen op min 80 te lezen Celsius.Het opzetten van een gastheercelcultuur voor de beeldvorming van mutagen ISED isoleert zaad een 96 goed glazen bodemplaat met 1,6 keer 10 tot de vierde kosten zeven cellen, in 100 microliter van compleet medium per put. Nadat de gastheercelmonolaag samenvloeiing heeft bereikt, ontdooien de geoogste gemuteerde klonen en chlamydiavoorraden in het wildtype op ijs en gebruiken ze één kolom per isolaat om uit te voeren, een tweevoudige seriële verdunning van elk gemuteerd isolaat. Infecteer, de resterende kolom met wild-type chlamydia, bij een veelheid van infectie van ongeveer 0,5, en plaats een plaat in de celcultuur incubator gedurende 10 uur aan het einde van de incubatie, selecteer drie putten per mutant isoleren die overeenkomen met een veelheid van infectie van minder dan een, en het genereren van een beeldvorming positie lijst.bestaande uit twee gezichtsvelden per put. In dit scatterplot, de tijd tot de helft maximale expressie van de EOU en hctB promotors van individuele chlamydia isolaten kan worden waargenomen klonen A3667 en B3858 werd gekozen voor isolatie als ze kortere tijden geproduceerd om maximale expressie, van de EOU promotor en langere tijden vier hctB. Insluitsels met gewijzigde kinetiek kunnen worden geïdentificeerd op basis van de visualisatie, van de dynamische genexpressie van de twee promotors en een momentopname van de geanimeerde grafiek kan worden gebruikt om de locatie van de insluitsels van belang te identificeren.In deze representatieve visualisaties werden in totaal 24 insluitsels geïdentificeerd voor isolatie, waarvan er 10 differentiële kinetiek vertoonden, bij herkeuring in drie verschillende fenotypische categorieën, acht isolaten die de EOU-promotoruitdrukking vertoonden na ongeveer 24 uur na infectie. Zoals aangetoond door de A3667 kloon, de B3858 isolaat, ook tentoongesteld een verminderde EOU promotor expressie, op ongeveer 24 uur na infectie. Maar een algehele toename van hctB promotor expressie, terwijl de B3662 isoleren, uitgedrukt verhoogde niveaus van florescence van de EOU promotor gevolgd door een plotseling verlies van expressie in beide promotors.Analyse van de levende celmicrografen voor mutant B3662, toont aan dat gastheercellyse zich voordeed, in cellen die besmet zijn met deze mutant, veel eerder dan in in het wildtype geïnfecteerde cellen. Celtype ontwikkeling gebrekkig chlamydia herstel, mogelijk niet mogelijk, omdat deze cellen niet kunnen opnieuw de gastheer. Genoom brede associatie studies kunnen worden gebruikt na isolatie, om ontwikkelingsgenen te identificeren, door middel van statistische correlatie, met de integratie van alternatieve promotor verslaggevers.Deze methode kan worden uitgebreid, tot het indringende van tal van genetische trajecten, in de dissectie van genetische circuit mechanismen, en andere intracellulaire ziekteverwekkers.

live-cell-forward-genetic-approach-to-identify-isolate-developmental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven een methode om genetische analyse in Chlamydia op basis van chemische mutagenese en hele genoom sequencing uitvoeren. Bovendien wordt een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen beschreven die kunnen worden gebruikt voor genetische mapping. Deze methode kan breed toepasbaar microbiële systemen ontbreekt transformatiesystemen en moleculair genetische hulpmiddelen.

Forward Genetische technieken in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Een methode op basis van fluorescente eiwitten in levende cellen voor het verlichten van cellulaire vacuolen (insluitsels) die Chlamydia bevatten, wordt beschreven. Deze strategie maakt een snelle, geautomatiseerde bepaling van Chlamydia-infectiviteit in monsters mogelijk en kan worden gebruikt om de groeidynamiek van insluitsels kwantitatief te onderzoeken.

Met behulp van fluorescerende eiwitten te visualiseren en te kwantificeren<em&gt; Chlamydia</em&gt; Vacuole groeidynamiek in levende cellen

Stressbestendigheid is een van de kenmerken voor een lange levensduur en is bekend genetisch geregeld. Hier, een onbevooroordeelde high-throughput methode ontwikkelden we voor het screenen op mutaties die stress-resistentie in ES-cellen waarmee de muis modellen te ontwikkelen voor een lange levensduur studies.

Forward Genetische Aanpak stress resistentiegenen in Muizen Ontdek - Een High-throughput scherm in ES-cellen

Temperatuurgevoelige (ts) letale mutanten zijn waardevolle hulpmiddelen om essentiële functies te identificeren en te analyseren. Hier beschrijven we methoden om ts letale mutanten op grote schaal te genereren en te classificeren.

High-throughput Robotisch Assisted Isolatie van temperatuurgevoelige Lethal Mutants in<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Hier presenteren we een methode om het genoom van C. elegans ingenieur met behulp van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins en homologie afhankelijke reparatie sjablonen.

Een snelle en Facile pijpleiding voor het genereren van Genomic punt mutanten in C. elegans met behulp van CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Bacteriële pathogenen scheiden eiwitten in de gastheer die gericht zijn op cruciale biologische processen. Het identificeren van de gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten is de sleutel tot het aanpakken van moleculaire pathogenese. Hier wordt een methode beschreven met behulp van een gemodificeerde gist suppressor en toxiciteits scherm om gastheer trajecten te verhelderen die zijn gericht op toxische bacteriële Effector eiwitten.

Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Forward genetica is een krachtige methode om moleculair niveau te ontrafelen van...

Een genetische screen te isoleren Toxoplasma gondii Host-cel Egress Mutants

Virus-geïnduceerde gene silencing is een nuttig hulpmiddel voor het identificeren van genen betrokken bij nonhost resistentie van planten. We demonstreren het gebruik van bacteriële pathogenen tot expressie GFPuv het identificeren gen zwijgen planten vatbaar voor nonhost pathogenen. Deze benadering is eenvoudig, snel en faciliteert grootschalige screening en soortgelijk protocol kan worden toegepast op het bestuderen van verschillende andere planten-microbe interacties.

VIGS-Mediated Forward Genetics Screening voor de identificatie van genen betrokken bij Nonhost Resistance

Forward genetics is een krachtige aanpak om genen in intracellulaire pathogenen te identificeren die belangrijk zijn voor resistentie tegen celautonome immuniteit. De huidige aanpak maakt gebruik van aangeboren immuuncellen, specifiek macrofagen, om nieuwe Toxoplasma gondii genen te identificeren die belangrijk zijn voor immuunontwijking.

Forward Genetica Schermen Met behulp van macrofagen te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genen Belangrijk voor Weerstand tegen IFN-γ-Dependent Cell Autonome Immuniteit

Leer een live-cel forward genetische methode om ontwikkelingsmutanten in Chlamydia trachomatis te identificeren en isoleren. Deze techniek maakt real-time tracking van celtype-ontwikkeling mogelijk.

Live-Cell Forward Genetische Benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in Chlamydia trachomatis

Meer video's verkennen