Live-Cell Forward Genetische Benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in Chlamydia trachomatis

Dit protocol biedt een uniek hulpmiddel voor de generatie en isolatie van Chlamydia met gewijzigde ontwikkelingsprofielen, waardoor uiteindelijk de identificatie mogelijk is van de genen die de ontwikkelingscyclus reguleren. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn de mogelijkheid om chlamydia cel type ontwikkeling in real time en de mogelijkheid om chlamydia te isoleren, met alter developmental programma's te volgen. Om een chlamydia trachomatis reporter te mutageniseren, zag een chlamydial voorraad met ongeveer drie keer 10e tot de zevende elementaire lichamen.

Getransformeerd met de verslaggever plasma van belang en pellet, de gedachte is gevuld door centrofugation. gebruik sonicatie op 10% vermogen gedurende 10 seconden, om de elementaire lichamen opnieuw op te stellen in 100 microliter van accidentele metabolisme buffer en split de resulterende elementaire lichaamssuspensie even, tussen twee 1,5 milliliter micro centrifuge buizen. Voeg 50 microliters van vers bereide EMS metabolisme oplossing in de chlamydia aliquots voor mutagenese en 50 microliter van vaccinic metabolisme buffer aan de chlamydial aliquot alleen voor voorraad mutagenesis en incubate beide monsters gedurende 20 minuten, bij kamertemperatuur.

EMS is een bekende kankerverwekkende slijtage handschoenen tijdens het hanteren, en weken alle EMS verontreinigde apparatuur en medium, in een molaire natriumhydroxide gedurende 24 uur voor verwijdering. Het opzetten van een groothandelscultuur, voor de beeldvorming en isolatie van de gemutigeniseerde chlamydia trachometers. Zaad zes goed glazen bodemplaten, met zes keer 10 tot de vijfde kosten zeven cellen, in twee milliliter van volledige medium per put en zaad een 24 goed polystyreen plaat met 10 tot de vijfde oorzaak zeven cellen in een milliliter van volledige medium per put.

Om de cultuur van de gastheercel met mutagenized te infecteren ontkent chlamydia trachomatis infecteert, vijf Putten van een glasbodemplaat met ongeveer zes keer 10 aan vijfde, van mutagenized elementaire organismen. In 1,5 milliliter ijskoude HBSS per put. en infecteren de resterende put, met ongeveer twee keer 10 tot de vijfde mock mutagenized elementaire lichamen in 1,5 milliliter ijskoude HBSS per put, na een 15 minuten incubatie bij 37 graden Celsius, met schommelen, was de geïnfecteerde cellen met 37 graden Celsius HBSS aangevuld met een milligram per milliliter heparine, onmiddellijk gevolgd door een HBSS spoeling.

was de cellen opnieuw met heparine, onmiddellijk gevolgd door twee spoelingen met HBSS alleen om ervoor te zorgen dat alle heparine wordt verwijderd. Voeg na de laatste wasbeurt vier milliliter van 37 graden Celsius beeldvormingsmedium toe, aan elke put. En vul de inter well ruimtes met 37 graden Celsius gedeïstiseerd water en plaats de platen 10 uur in de couveuse van de celcultuur.

Aan het einde van de incubatie zet de microscoop stadium incubator tot 5% kooldioxide, en 37 graden Celsius. En plaats de zes goed glazen bodemplaat, in de fase incubator. In de imaging software, Gebruik de high content screening plugin om de zes put plaat sjabloon te selecteren, en het genereren van een imaging positie lijst bestaande uit 12 gezichtsvelden per goed gebruik maken van de autofocus optie om de focus voor de geautomatiseerde beeldvorming in te stellen en de blootstelling in te stellen op 250 milliseconden op een 4%-intensiteit in het GFB-kanaal en een 18% in dichtheid in het RFP-kanaal.

Dus op de beeldcyclus gedurende 24 uur, met intervallen van 30 minuten, om de kinetiek van de ontwikkelingscyclus vast te leggen en de beeldopname in te stellen op meerdere Z-stacks met een reeks focus die eindigt aan weerszijden van het InFocus-segment, selecteer dan relatieve Z voor beeldvorming, meerdere segmenten in het acquisitievenster en gebruik de optie afbeeldingsstackbestand. om de afbeeldingen in te stellen die moeten worden opgeslagen als TIFF-stackbestanden. Om inclusietracks te identificeren, met gewijzigde ontwikkelingsprofielen, gebruikt u de importcel in het EMS-scherm, markdown Python-notebook, om de inclusietrackgegevens van de spots in trackstatistieken te importeren, CSV-bestanden in het gegevensframe van de Panda.

Gebruik de rekencel om de tijd te berekenen om maximale expressie te hebben voor zowel de vroege als de late verslaggevers voor elk nummer en gebruik het bokeh-plottenpakket, in de half max plotcel, om de tijd twee halve max expressie te visualiseren tot halve maximale expressie ten opzichte van die van hctB-prom. Gebruik de bokeh interactieve track ID Explorer, om insluitsels van de mutant populatie te identificeren, die vallen buiten de mock behandelde scatter cloud. Om veranderingen in de promotorexpressie kinetiek dynamisch in de geanimeerde bloedcelgrafiek te visualiseren de expressieintensiteiten van het prom EOU tegen hctB prom.

Visualiseer vervolgens een momentopname van de geanimeerde grafiek, in de opnamezoeklos. Om de ontwikkelings newtons te isoleren, van de insluitsels van belang, positie het gezichtsveld over een put met een geïdentificeerde opname, en geef de naald over de fase differentiële interferentie contrast witte lichtkanaal lichtbron, om de naald te visualiseren, gebruik maken van de 595 nanometer, excitatie kanaal, om de elementaire lichamen te visualiseren voor extractie. En gebruik de fijne aanpassing en de micro manipulator, om de capillaire naald te manoeuvreren om de opname, breuk de opname met de naald, en gebruik de micro-injector om de elementaire lichamen te trekken in de capillaire naald tip.

Verdrijft de geëxtraheerde elementaire lichamen, uit de capillaire naald in een enkele put, van de bereid op 24 put polystyreen plaat, en gebruik een nieuwe capillaire naald voor de volgende extractie. Na een voldoende uitbreiding van elk isolaat, verstoren de geïnfecteerde monolaag met een een milliliter micropipet tip en breng de medium cel puin en vrijgegeven chlamydia in een nieuwe 1,5 milliliter microcentrifuge buis. Pellet de geoogste chlamydia door centrifugatie, en resuspend de pellet in 75 microliters van ijskoude, sacharose fosfaat glutamaat buffer, dan split de opneming suspensie even, tussen drie nieuwe 1,5 milliliter schroef dop microcentrifuge buizen, en bewaar de buizen op min 80 te lezen Celsius.

Het opzetten van een gastheercelcultuur voor de beeldvorming van mutagen ISED isoleert zaad een 96 goed glazen bodemplaat met 1,6 keer 10 tot de vierde kosten zeven cellen, in 100 microliter van compleet medium per put. Nadat de gastheercelmonolaag samenvloeiing heeft bereikt, ontdooien de geoogste gemuteerde klonen en chlamydiavoorraden in het wildtype op ijs en gebruiken ze één kolom per isolaat om uit te voeren, een tweevoudige seriële verdunning van elk gemuteerd isolaat. Infecteer, de resterende kolom met wild-type chlamydia, bij een veelheid van infectie van ongeveer 0,5, en plaats een plaat in de celcultuur incubator gedurende 10 uur aan het einde van de incubatie, selecteer drie putten per mutant isoleren die overeenkomen met een veelheid van infectie van minder dan een, en het genereren van een beeldvorming positie lijst.

bestaande uit twee gezichtsvelden per put. In dit scatterplot, de tijd tot de helft maximale expressie van de EOU en hctB promotors van individuele chlamydia isolaten kan worden waargenomen klonen A3667 en B3858 werd gekozen voor isolatie als ze kortere tijden geproduceerd om maximale expressie, van de EOU promotor en langere tijden vier hctB. Insluitsels met gewijzigde kinetiek kunnen worden geïdentificeerd op basis van de visualisatie, van de dynamische genexpressie van de twee promotors en een momentopname van de geanimeerde grafiek kan worden gebruikt om de locatie van de insluitsels van belang te identificeren.

In deze representatieve visualisaties werden in totaal 24 insluitsels geïdentificeerd voor isolatie, waarvan er 10 differentiële kinetiek vertoonden, bij herkeuring in drie verschillende fenotypische categorieën, acht isolaten die de EOU-promotoruitdrukking vertoonden na ongeveer 24 uur na infectie. Zoals aangetoond door de A3667 kloon, de B3858 isolaat, ook tentoongesteld een verminderde EOU promotor expressie, op ongeveer 24 uur na infectie. Maar een algehele toename van hctB promotor expressie, terwijl de B3662 isoleren, uitgedrukt verhoogde niveaus van florescence van de EOU promotor gevolgd door een plotseling verlies van expressie in beide promotors.

Analyse van de levende celmicrografen voor mutant B3662, toont aan dat gastheercellyse zich voordeed, in cellen die besmet zijn met deze mutant, veel eerder dan in in het wildtype geïnfecteerde cellen. Celtype ontwikkeling gebrekkig chlamydia herstel, mogelijk niet mogelijk, omdat deze cellen niet kunnen opnieuw de gastheer. Genoom brede associatie studies kunnen worden gebruikt na isolatie, om ontwikkelingsgenen te identificeren, door middel van statistische correlatie, met de integratie van alternatieve promotor verslaggevers.

Deze methode kan worden uitgebreid, tot het indringende van tal van genetische trajecten, in de dissectie van genetische circuit mechanismen, en andere intracellulaire ziekteverwekkers.