Toepassing van lasermicrodissectie om regionale transcriptomics in menselijk nierweefsel te ontdekken
9 juni 2020
We beschrijven een protocol voor lasermicrodissectie van subsegmenten van de menselijke nier, waaronder de glomerulus, proximale tubulus, dikke opgaande ledemaat, het verzamelen van kanaal en interstitium. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit de verkregen compartimenten en RNA-sequencing wordt uitgevoerd om wijzigingen in de transcriptomische handtekening binnen elk subsegment te bepalen.
Laser microdissectie maakt transcriptomische analyse mogelijk van ruimtelijk gedefinieerde regio's binnen de nierweefselmonsters. Dit biedt ons de unieke kans om structuren van belang te identificeren, zelfs nadat door ziekte veroorzaakte veranderingen hebben plaatsgevonden. De belangrijkste voordelen van deze methodologie zijn de complementariteit met andere omics-technologieën, zoals single-cell RNA-sequencing.
Het biedt opmerkelijke weefseleconomische voordelen en maakt zelfs de detectie van zwak geëxprimeerde transcripten mogelijk. Na het verkrijgen van het weefselmonster, gebruik een cryostaat ingesteld op min 20 graden Celsius om het specimen in een dikte van 12 micrometer te snijden en gebruik de glijadapter om het specimen op een gespecialiseerde laser microdissectieschuif te bevestigen. Binnen 10 dagen na cryosectie, meng 89,2 microliter RNase-vrij 10%BSA in PBS met vier microliter FITC phalloidin, 1,5 microliter DAPI, twee microliter van het antilichaam van belang direct geconjugeerd aan Alexa Fluor 546, en 3,3 microliter RNase-remmer.
Was de glij in min 20 graden Celsius 100% aceton gedurende één minuut en plaats de glij in een vochtigheidskamer. Was de bovenkant van de glij twee keer met vers RNase-vrij PBS gedurende 30 seconden per wassing, gevolgd door twee 30 seconde wasbeurten met 10%BSA in RNase-vrij PBS. Na de laatste wasbeurt, behandel het monster met de bereide antilichaamoplossing gedurende vijf minuten op kamertemperatuur voordat u nogmaals twee keer wast met 10%BSA in RNase-vrij PBS.
Na de tweede wasbeurt, laat de glij vijf minuten drogen in een weefselkweekhood voordat u de glij op de laser microdissectiesnijplatform laadt. Installeer autoclaved 500 microliter microcentrifuge collectiebuizen, geschikt voor PCR-werk, bevattende 50 microliter extractiebuffer van een RNA isolatiekit op het apparaat. Na het laden, identificeer gebieden van belang binnen het monster door kleuring, morfologie en locatie.
Gebruik immunofluorescence om minimaal 500.000 micrometer vierkante segmenten van belang te omlijnen. Start vervolgens de laser microdissectie om het gebied uit te snijden met een laservermogen van meer dan 40. Na voltooiing van het laser microdissectieproces, sluit de microcentrifuge collectiebuizen af en sla de buizen krachtig om ervoor te zorgen dat de inhoud van de doppen naar de bodem van de buizen beweegt.
Na centrifugatie, incubeer de buizen gedurende 30 minuten in een 42 graden Celsius waterbad voordat u de buizen opnieuw centrifugeert. Breng vervolgens de supernatanten over naar nieuwe 500 microliter buizen vanuit min 80 graden Celsius opslag. De identificatie van tubulaire sub-segmenten in de nier wordt bereikt door middel van antilichaamkleuring van unieke tubulaire markeringen naast celmorfologie en structurele oriëntatiepunten.
Fluorescentielabeling in combinatie met morfologische weefselkennen en de ruimtelijke positionering van de beeldstructuren vergemakkelijkt de visualisatie van renale sub-segmenten met een hoge mate van zekerheid. In deze representatieve downstream sequencing analyse was de succesratio van het bereiken van de minimale dissectiegebiedinput meer dan 90%, resulterend in een hoge totale mRNA-hoeveelheid beschikbaar voor gendetectie. In deze analyse voldeed 100% van de monsters aan de minimale detectiedrempel van minimaal 10.000 genen.
Na laser microdissectie kan verrijkingsanalyse van de genexpressie van bekende markeringen worden vergeleken met die van andere compartimenten. In deze analyse werd één marker voor elk sub-segment geïdentificeerd via laser microdissectie regionale transcriptomiek die ook een specifieke immunohistochemische kleuring van het corresponderende nierlichaampje sub-segment opleverde. Het is belangrijk op te merken dat laser microdissectie sterk afhankelijk is van de expertise van de gebruiker om de te dissecteren structuren van belang nauwkeurig te identificeren.
Deze techniek maakt het mogelijk om specifieke regionale genregulatiesignaturen te bestuderen die kunnen worden gebruikt om mogelijke routes betrokken bij ziekteprogressie te beoordelen, evenals de biologie van gezond weefsel.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor laser-microdissectie van specifieke subsegmenten binnen menselijk nierweefsel, waaronder de glomerulus en de proximale tubulus. Het geïsoleerde RNA uit deze compartimenten maakt transcriptomische analyse mogelijk om veranderingen in genexpressiepatronen te onthullen die geassocieerd zijn met verschillende nierstructuren.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Transcriptoomanalyse
- Nierbiologie
- Onderzoek naar ziekteprogressie
Achtergrond
- Belang van het bestuderen van nier-subsegmenten
- Uitdagingen bij het analyseren van ruimtelijk gedefinieerde structuren na ziekte
- Complementariteit met andere omics-technologieën
Gebruikte methoden
- Laser-microdissectie
- Menselijke nierweefselmonsters
- RNA-isolatie en sequencing
Belangrijkste resultaten
- Hoge succesratio bij dissectie en RNA-herstel
- Identificatie van genexpressiemarkers voor nier-subsegmenten
- Aantoonbare potentiële pathways gerelateerd aan ziekteprogressie
Conclusies
- Dit protocol demonstreert een effectieve methode voor het bestuderen van regionale genexpressie in de nier.
- De bevindingen dragen bij aan het begrip van de renale biologie en potentiële ziekte mechanismen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Laser-microdissectie maakt ruimtelijk opgeloste transcriptomische profilering van menselijk nierweefsel mogelijk, waarmee een kritisch hiaat in de ontdekkingsbiologie wordt opgevuld waar dissociatiegebaseerde methoden de anatomische context verliezen. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie door genexpressiesignaturen te koppelen aan gedefinieerde nefron-subsegmenten, wat de mechanistische risicoreductie in modellen voor nierziekten verbetert. De methode biedt voorspellende zekerheid voor het onderzoeken van signaalpaden en de prioritering van portfolio's in vroege discovery-workflows.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door genexpressie te koppelen aan anatomisch gedefinieerde nierscompartimenten.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie via ruimtelijk verankerde transcriptomische signaturen die de weefselcontext behouden.
- Voorspellende waarde: Verhoogt het vertrouwen in targets door regionale marker-expressie te correleren met de functionele identiteit van subsegmenten.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream omics-workflows door RNA met een hoge integriteit te isoleren uit gemicrodissecteerde regio's.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid van assays via QC-parameters die de adequaatheid van het monster en de succespercentages van de dissectie beoordelen.
- Schaalbaarheid: Maakt betrouwbare evaluatie van verbindingen mogelijk door kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste transcriptomische outputs te leveren voor screeningscampagnes.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Verbindt ontdekkingsbevindingen met preklinische validatie door middel van ziektespecifieke systeemmodellering met gebruik van menselijke nier-subsegmenten.
- Afstemming van biomarkers: Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers door compartimentspecifieke genexpressieprofielen te identificeren die in weefsel detecteerbaar zijn.
- Risicogebaseerde voortgang: Informeert de preklinische besluitvorming door pathway-activiteit te onthullen in anatomisch nauwkeurige, door ziekte aangetaste regio's.
Integratie van pijplijn en workflow
Lasermicrodissectie past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, wat ruimtelijk opgeloste moleculaire profilering mogelijk maakt die beeldvorming en omics overbrugt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door genexpressie te koppelen aan structurele kenmerken in nierweefsel.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid door een hoge succesrate bij dissectie (>90%) en voldoende RNA-opbrengst voor sequencing-applicaties.
- Analytiek: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen (gendetectiedrempels ≥10.000 genen), waardoor vergelijkingen tussen condities mogelijk worden.
- Translationeel onderzoek: Bevordert preklinische continuïteit door de ruimtelijke context te behouden die verloren gaat bij dissociatiegebaseerde methoden.
- Hergebruik binnen de organisatie: Functioneert als een herbruikbare capaciteit over verschillende weefseltypen heen via substitutie van antilichaammarkers, wat adoptie op platformniveau ondersteunt.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanistische ambiguïteit bij de validatie van renale targets te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde workflowparameters en QC-controlepunten.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk te maken op basis van subsegment-specifieke biologie.
- Impact op portfolio: Ondersteunt kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van renale targets middels ruimtelijk opgeloste bewijsvoering.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in immunofluorescent kleuring en morfologische identificatie van renale subsegmenten.
- Afhankelijk van laser-microdissectieplatforms en RNA-isolatiekits die geschikt zijn voor monsters met een lage input.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor kleuringsprotocollen, dissectiedrempels en QC-metrieken.
- Aanpassing aan verschillende modellen vereist validatie van antilichaamsmarkers en structurele oriëntatiepunten in doelweefsels.
- Praktische beperkingen omvatten gebruikersafhankelijke precisie bij de identificatie van regio's en het behoud van de RNA-integriteit tijdens de verwerking.
