Toepassing van lasermicrodissectie om regionale transcriptomics in menselijk nierweefsel te ontdekken
June 9th, 2020
We beschrijven een protocol voor lasermicrodissectie van subsegmenten van de menselijke nier, waaronder de glomerulus, proximale tubulus, dikke opgaande ledemaat, het verzamelen van kanaal en interstitium. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit de verkregen compartimenten en RNA-sequencing wordt uitgevoerd om wijzigingen in de transcriptomische handtekening binnen elk subsegment te bepalen.
Laser microdissectie maakt transcriptomische analyse mogelijk van ruimtelijk gedefinieerde regio's binnen de nierweefselmonsters. Dit biedt ons de unieke kans om structuren van belang te identificeren, zelfs nadat door ziekte veroorzaakte veranderingen hebben plaatsgevonden. De belangrijkste voordelen van deze methodologie zijn de complementariteit met andere omics-technologieën, zoals single-cell RNA-sequencing.
Het biedt opmerkelijke weefseleconomische voordelen en maakt zelfs de detectie van zwak geëxprimeerde transcripten mogelijk. Na het verkrijgen van het weefselmonster, gebruik een cryostaat ingesteld op min 20 graden Celsius om het specimen in een dikte van 12 micrometer te snijden en gebruik de glijadapter om het specimen op een gespecialiseerde laser microdissectieschuif te bevestigen. Binnen 10 dagen na cryosectie, meng 89,2 microliter RNase-vrij 10%BSA in PBS met vier microliter FITC phalloidin, 1,5 microliter DAPI, twee microliter van het antilichaam van belang direct geconjugeerd aan Alexa Fluor 546, en 3,3 microliter RNase-remmer.
Was de glij in min 20 graden Celsius 100% aceton gedurende één minuut en plaats de glij in een vochtigheidskamer. Was de bovenkant van de glij twee keer met vers RNase-vrij PBS gedurende 30 seconden per wassing, gevolgd door twee 30 seconde wasbeurten met 10%BSA in RNase-vrij PBS. Na de laatste wasbeurt, behandel het monster met de bereide antilichaamoplossing gedurende vijf minuten op kamertemperatuur voordat u nogmaals twee keer wast met 10%BSA in RNase-vrij PBS.
Na de tweede wasbeurt, laat de glij vijf minuten drogen in een weefselkweekhood voordat u de glij op de laser microdissectiesnijplatform laadt. Installeer autoclaved 500 microliter microcentrifuge collectiebuizen, geschikt voor PCR-werk, bevattende 50 microliter extractiebuffer van een RNA isolatiekit op het apparaat. Na het laden, identificeer gebieden van belang binnen het monster door kleuring, morfologie en locatie.
Gebruik immunofluorescence om minimaal 500.000 micrometer vierkante segmenten van belang te omlijnen. Start vervolgens de laser microdissectie om het gebied uit te snijden met een laservermogen van meer dan 40. Na voltooiing van het laser microdissectieproces, sluit de microcentrifuge collectiebuizen af en sla de buizen krachtig om ervoor te zorgen dat de inhoud van de doppen naar de bodem van de buizen beweegt.
Na centrifugatie, incubeer de buizen gedurende 30 minuten in een 42 graden Celsius waterbad voordat u de buizen opnieuw centrifugeert. Breng vervolgens de supernatanten over naar nieuwe 500 microliter buizen vanuit min 80 graden Celsius opslag. De identificatie van tubulaire sub-segmenten in de nier wordt bereikt door middel van antilichaamkleuring van unieke tubulaire markeringen naast celmorfologie en structurele oriëntatiepunten.
Fluorescentielabeling in combinatie met morfologische weefselkennen en de ruimtelijke positionering van de beeldstructuren vergemakkelijkt de visualisatie van renale sub-segmenten met een hoge mate van zekerheid. In deze representatieve downstream sequencing analyse was de succesratio van het bereiken van de minimale dissectiegebiedinput meer dan 90%, resulterend in een hoge totale mRNA-hoeveelheid beschikbaar voor gendetectie. In deze analyse voldeed 100% van de monsters aan de minimale detectiedrempel van minimaal 10.000 genen.
Na laser microdissectie kan verrijkingsanalyse van de genexpressie van bekende markeringen worden vergeleken met die van andere compartimenten. In deze analyse werd één marker voor elk sub-segment geïdentificeerd via laser microdissectie regionale transcriptomiek die ook een specifieke immunohistochemische kleuring van het corresponderende nierlichaampje sub-segment opleverde. Het is belangrijk op te merken dat laser microdissectie sterk afhankelijk is van de expertise van de gebruiker om de te dissecteren structuren van belang nauwkeurig te identificeren.
Deze techniek maakt het mogelijk om specifieke regionale genregulatiesignaturen te bestuderen die kunnen worden gebruikt om mogelijke routes betrokken bij ziekteprogressie te beoordelen, evenals de biologie van gezond weefsel.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor laser microdissectie van specifieke sub-segmenten binnen menselijk nierweefsel, inclusief de glomerulus en proximale tubulus. Het geïsoleerde RNA uit deze compartimenten maakt transcriptomische analyse mogelijk om veranderingen in genexpressiepatronen te onthullen die geassocieerd zijn met verschillende nierstructuren.
Belangrijkste Studie Componenten
Onderzoeksgebied
- Transcriptomische analyse
- Nier biologie
- Onderzoek naar ziekteprogressie
Achtergrond
- Belang van het bestuderen van nier sub-segmenten
- Uitdagingen bij het analyseren van ruimtelijk gedefinieerde structuren na ziekte
- Complementariteit met andere omics technologieën
Gebruikte Methoden
- Laser microdissectie
- Menselijke nierweefselmonsters
- RNA isolatie en sequencing
Belangrijkste Resultaten
- Hoge succesratio in dissectie en RNA herstel
- Identificatie van genexpressiemarkers voor nier sub-segmenten
- Mogelijke paden gerelateerd aan ziekteprogressie gedemonstreerd
Conclusies
- Dit protocol demonstreert een effectieve methode voor het bestuderen van regionale genexpressie in de nier.
- De bevindingen dragen bij aan het begrijpen van nier biologie en mogelijke ziektemechanismen.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Laser microdissection enables spatially resolved transcriptomic profiling of human kidney tissue, addressing a critical gap in discovery biology where dissociation-based methods lose anatomical context. This approach supports target validation by linking gene expression signatures to defined nephron sub-segments, enhancing mechanistic de-risking in renal disease models. The method provides predictive confidence for pathway interrogation and portfolio prioritization in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping gene expression to anatomically defined kidney compartments.
- Operational Value: Supports biological de-risking through spatially anchored transcriptomic signatures that maintain tissue context.
- Predictive Value: Facilitates target confidence by correlating regional marker expression with functional sub-segment identity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream omics workflows by isolating high-integrity RNA from microdissected regions.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through QC parameters assessing specimen adequacy and dissection success rates.
- Scalability: Enables reliable compound evaluation by providing quantitative, spatially resolved transcriptomic outputs for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery findings to preclinical validation through disease-relevant system modeling using human kidney sub-segments.
- Biomarker Alignment: Supports translational biomarker development by identifying compartment-specific gene expression profiles detectable in tissue.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs preclinical decision-making by revealing pathway activity in anatomically precise disease-affected regions.
Pipeline & Workflow Integration
Laser microdissection fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification, enabling spatially resolved molecular profiling that bridges imaging and omics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking gene expression to structural landmarks in kidney tissue.
- Screening: Delivers assay readiness through high-success-rate dissection (>90%) and sufficient RNA yield for sequencing applications.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (gene detection thresholds ≥10,000 genes) enabling cross-condition comparison.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by preserving spatial context lost in dissociation-based methods.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across tissue types via antibody marker substitution, supporting platform-wide adoption.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in renal target validation.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined workflow parameters and QC checkpoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling risk-adjusted prioritization based on sub-segment-specific biology.
- Portfolio Impact: Supports capital efficiency through early de-risking of renal targets using spatially resolved evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence staining and morphological identification of renal sub-segments.
- Dependent on laser microdissection platforms and RNA isolation kits compatible with low-input samples.
- Necessitates cross-team standardization for staining protocols, dissection thresholds, and QC metrics.
- Adaptation across models requires validation of antibody markers and structural landmarks in target tissues.
- Practical limitations include user-dependent precision in region identification and RNA integrity maintenance during processing.
