Levering van antilichamen in de hersenen met behulp van gerichte scanning echografie
18 juli 2020
Hier wordt een protocol gepresenteerd om de bloed-hersenbarrière (BBB) tijdelijk te openen, hetzij focale of door een muizenbrein om fluorescerend gelabelde antilichamen af te leveren en microglia te activeren. Ook gepresenteerd is een methode om de afgifte van antilichamen en microglia-activering door histologie te detecteren.
Slechts een klein deel van therapeutische antilichamen wordt opgenomen door de hersenen. Met onze methode worden antilichamen in de hersenen gebracht door tijdelijk de bloed-hersenbarrière te openen. Deze techniek stelt ons in staat om op een niet-invasieve manier antilichamen in de muizenhersenen te brengen.
Om kwaliteitscontrole van de microbubbels uit te voeren met behulp van een celteller, verwijdert u de microbubbeloplossing uit de amalgamator en gebruikt u een naald met een diameter van 19 gauge om het septum van de microbubbeloplossingsfles te doorboren. Gebruik een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 19 gauge om 100 microliters van de microbubbels te verdunnen in vijf milliliters gefilterde flowsoplossing en pipet 100 microliters van de verdunde microbubbeloplossing in 10 milliliters gefilterde flowsoplossing in een cuvet. Vergrendel de cuvet op de celtellerplatform en zorg ervoor dat een opening van 30 micron zal worden gebruikt voor de monsteropname.
Laad in de software de standaard werkmethode en selecteer standaard werkmethode bewerken en concentratie. Voer 5.000 keer in voor de verdunning en klik op toepassen en OK. Klik op info bewerken om een geschikte bestandsnaam te selecteren. Selecteer voorbeeld en controleer of de concentratie van het microbubbelmonster minder dan 10% is. Selecteer start en OK om te beginnen met de monsteropname.
Na de meting spoelt u de opening van de celteller met gefilterde flowsoplossing. Soniceer de cuvet met verdunde microbubbeloplossing gedurende 30 seconden in een waterbad. Meet de gesoniceerde microbubbeloplossing zoals gedemonstreerd en klik op info bewerken om de gegevens als blanco te labelen.
Na het meten van de blanco, trekt u het laatste resultaat af van het eerste resultaat om alle deeltjes die geen microbubbels zijn uit te sluiten. Om de secties te labelen met fluorescerend anti-muis IgG-antilichaam, labelt u één milligram muis IgG-antilichaam met Alexa Flour 647 in 0,1 molaire natriumbicarbonaatbuffer volgens de instructies van de fabrikant gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, laadt u de fluorescent gelabelde antilichaamoplossing op een spinkolom en zuivert u het antilichaam door centrifugatie.
Gebruik vervolgens een spectrofotometer om de eiwitconcentratie te meten. Om het gefocuste scanning-ultrasone systeem op te zetten, voegt u een ruimte van vijf millimeter toe aan de waterbolus om de ultrasone focus negen millimeter onder de bodem van de waterbolus te plaatsen. Vul de waterbolus met ongeveer 300 milliliter ontgast gedeïoniseerd water en plaats de ringvormige array in de gevulde waterbolus.
Gebruik een tandheelkundig spiegeltje om te controleren of er geen luchtbellen op het oppervlak zitten en start de applicatiesoftware. Selecteer in het menu golfvorm de golfvormduurcyclus instellen en stel de pulsrepetitiefrequentie in op 10 Hertz, de duurcyclus op 10%, de focus op 80 millimeter, de centrumfrequentie op één megahertz, de amplitude op 0,65 megapascal en de mechanische index op 0,65. Druk op instellen om de golfvorm te definiëren en sla de golfvorm op in het geheugen.
Na het selecteren van het behandelingsplan, opent u het scantabblad in het venster van de bewegingscontroller en voert u start-, stop- en incrementwaarden in voor de beweging in de X-dimensie en start-, stop- en incrementwaarden voor de beweging in de Y-richting. Om de acties voor de behandelingslocaties te definiëren, klikt u op gebeurtenis en opent u het scriptbewerkingsvenster. Selecteer een lijst met acties die in de geselecteerde volgorde op elke behandelingslocatie worden uitgevoerd en stelt u het bewegingstype in op rasterraster.
Selecteer in het tabblad gebeurtenissen acties toevoegen en verplaats de gelijktijdig starttrigger ARB wachten en stoptrigger ARB-acties naar het scriptpaneel. Klik vervolgens op wachtactie en selecteer een wachttijd van 6.000 milliseconden. Om een dier voor te bereiden op de analyse, gebruikt u na het bevestigen van een gebrek aan reactie op teenprik bij een geanesthetiseerde muis, een permanente marker om het midden van het hoofd te labelen, lijm vervolgens plasticfolie op de bodem van een kleine weegboot met de bodem afgesneden en vul de weegboot met ultrasone gel.
Voor behandeling met gefocuste echografie, draait u de fles met microbubbels om en laadt u voorzichtig één microliter van de oplossing per gram lichaamsgewicht van de muis in een insulinespuit met een diameter van 29 gauge. Voeg 100 microliters van fluorescent gelabeld antilichaam toe aan de spuit en draai en rol voorzichtig de spuit tussen duim en wijsvinger om het antilichaam en de microbubbels in de spuit te mengen. Injecteer voorzichtig en langzaam retro-orbitaal 150 microliters van de microbubbel en antilichaamoplossing in de muis en stel een timer in op twee minuten.
Breng oftalmische zalf aan en plaats vervolgens de muis in de hoofdhouder en fixeer zijn neus in de houder. Plaats de kleine met ultrasone gel gevulde weegboot op het hoofd en laat de waterbolus zakken tot deze op het ultrasone gel in de weegboot zit. Gebruik vervolgens de joystick om de focus van de transducer visueel te richten in het midden van het hoofd.
Wanneer de timer afgaat, selecteert u in het bewegingstabblad van de software herkomst resetten en selecteert u een complete scan. Wanneer de behandeling voltooid is, brengt u oftalmische zalf aan op de ogen van het dier en plaatst u de muis in een verwarmde herstelkamer. Hier worden representatieve resultaten van de meetresultaten van de grootte en concentratie die kunnen worden verkregen wanneer de microbubbels correct worden geproduceerd, weergegeven.
Opname van antilichamen door de hersenen kan eenvoudig worden gevisualiseerd in de hele hersenen of weefselsecties met behulp van een infraroodscanner of fluorescente microscopie van de secties. Zoals gedemonstreerd in deze afbeeldingen, kan representatieve kleuring voor microglia-markers worden gebruikt om te bepalen of microglia fagocytischer worden na de toediening van het antilichaam. Het is belangrijk om de welzijn en veiligheid van de dieren te waarborgen, vooral bij het uitvoeren van de retro-orbitale injecties en het aanbrengen van de transducer boven de hoofden van de muizen.
Deze methode maakt de toepassing van verschill
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor het tijdelijk openen van de bloed-hersenbarrière (BBB) in muismodellen om de aflevering van fluorescent gelabelde antilichamen te vergemakkelijken en microglia te activeren. De methode maakt niet-invasieve aflevering en monitoring van de antilichamenopname in de hersenen mogelijk via histologische technieken.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Immunologie
- Therapeutische toediening
Achtergrond
- De bloed-hersenbarrière beperkt de opname van therapeutische antilichamen in de hersenen.
- Microglia spelen een cruciale rol in de immuunresponsen van de hersenen.
- Huidige methodologieën voor het openen van de bloed-hersenbarrière en de toediening van antilichamen zijn beperkt.
- Fluorescente markering helpt bij de visualisatie van de opname van antilichamen en de activatie van microglia.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een protocol om de BBB tijdelijk te openen voor de toediening van antilichamen.
- Het activeren van microglia in een gecontroleerde experimentele setting.
- Het evalueren van de effectiviteit van deze toedieningsmethode via histologie.
Gebruikte methoden
- De methodologie omvat gefocuste echografie en de injectie van microbellen in de hersenen van de muis.
- Het belangrijkste gebruikte biologische model bestaat uit genarceerde muizen.
- De belangrijkste stappen omvatten de preparatie van microbellen en antilichamen, en nauwkeurige echografische targeting.
- Fluorescerende antilichamen worden gezuiverd en gevisualiseerd om de interactie met microgliare cellen te meten.
Belangrijkste resultaten
- De techniek demonstreerde succesvol de aflevering van antilichamen in de hersenen.
- Microglia vertoonden een verhoogde fagocytische activiteit na toediening van antilichamen.
- Visualisatietechnieken bevestigden de effectieve lokalisatie en opname van antilichamen.
- Scanpatronen maakten het mogelijk om specifieke hersenregio's te targeten, waardoor de potentiële therapeutische toepassingen werden uitgebreid.
Conclusies
- Deze studie biedt een betrouwbare methode om de aflevering van therapeutische antilichamen over de bloed-hersenbarrière te verbeteren.
- Het opent wegen voor toekomstig onderzoek naar geneesmiddelenontwikkeling en het begrijpen van hersenmechanismen.
- De bevindingen benadrukken het potentieel van deze methode bij het bestuderen van neuro-immunologische interacties.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Gefocuste scanning ultrasound (SUS) met microbubbels maakt een tijdelijke opening van de bloed-hersenbarrière mogelijk om de aflevering van antilichamen in de hersenen te verbeteren, waarmee een belangrijke beperking in de therapie voor neurodegeneratieve ziekten wordt aangepakt. Deze niet-invasieve benadering verbetert de target-interactie en ondersteunt mechanische risicoreductie door een kwantitatieve beoordeling van de biodistributie en cellulaire opname van antilichamen mogelijk te maken. De methode biedt voorspellende zekerheid in een vroege ontdekkingsfase door de hersenpenetratie van antilichaamkandidaten te valideren voordat er kostbare preklinische stappen worden ondernomen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de toegang van therapeutische antilichamen tot hersendoelen te onderzoeken, wat bijdraagt aan de validatie van doelen in modellen voor neurodegeneratieve ziekten.
- Operationele waarde: Biedt een reproduceerbare methode om de biodistributie van antilichamen en de target engagement in vivo te beoordelen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Faciliteert de preparatie van hersenweefsel met toegediende antilichamen voor daaropvolgende histologische en imaging-assays.
- Operationele waarde: Standaardiseert de toedieningsparameters om een consistente blootstelling aan antilichamen over de experimentele groepen heen te waarborgen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de toediening van ziekterelateerde antilichamen om doelwitmodulatie en pathway-activatie in preklinische modellen te evalueren.
- Operationele waarde: Maakt regio-specifieke toediening mogelijk (bijv. hippocampus, cortex) om aan te sluiten bij de ziektepathologie en biomarkerstudies.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm door vroege validatie van de penetratie van antilichamen in de hersenen mogelijk te maken, beslissingen bij de identificatie van lead-verbindingen te informeren en preklinische continuïteit te ondersteunen via regio-specifieke aflevering en read-outs van de microgliële activiteit.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests met betrekking tot de toegang van antilichamen tot hersendoelen en de verduidelijking van pathways via verbeterde aflevering.
- Screening: Levert antilichamen consistent af aan hersenweefsel, wat een betrouwbare evaluatie van verbindingen of doelen in vivo mogelijk maakt.
- Analytics: Biedt kwantitatieve readouts van de antilichaamconcentratie in de hersenen en microgliële fagocytose als een functionele biomarker voor binding.
- Translationeel onderzoek: Verbindt afleveringsefficiëntie met preklinische validatie door toegang van antilichamen tot ziekterelevante hersengebieden mogelijk te maken.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het beoordelen van de BBB-permeabiliteit van diverse antilichaamformaten over meerdere projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in de opname van antilichamen in de hersenen, waardoor mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie wordt verminderd.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare blootstelling aan antilichamen over verschillende studies heen door middel van gecontroleerde parameters voor ultrasone geluiden en microbellen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege gegevens over de blootstelling van de hersenen te verschaffen, waardoor het risico op falen in een laat stadium door een slechte penetratie van het centrale zenuwstelsel wordt verminderd.
- Impact op de portfolio: Maakt risicogestuurde prioritering van antilichaamkandidaten mogelijk op basis van gevalideerde efficiëntie van de afgifte aan de hersenen.
Overwegingen voor implementatie
- Expertise in echografische fysica, de hantering van microbellen en in vivo imaging is vereist voor een nauwkeurige opstelling en uitvoering.
- De instrumentatie omvat een gefocusde ultrasone transducer, een waterbolus, een systeem voor de bereiding van microbellen en fluorescentiedetectietools.
- Standaardisatie tussen teams is noodzakelijk voor de echografieparameters (frequentie, amplitude, duty cycle) en injectieprotocollen om reproduceerbaarheid te waarborgen.
- Aanpassing over verschillende modellen vereist de wijziging van scanpatronen en ultrasone targeting om aan te sluiten bij de hersenanatomie en ziekte-relevante regio's.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in de efficiëntie van de opening van de BBB en de noodzaak van zorgvuldige monitoring van het dierenwelzijn tijdens retro-orbitale injectie en het aanbrengen van de transducer.
