Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus
May 24th, 2020
Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.
Embryo-microinjectietechnieken hebben de weg gebaand voor de ontwikkeling van talrijke op genetica gebaseerde vectorcontrole-instrumenten. Hoewel er al goed ontwikkelde protocollen zijn voor talrijke insectensoorten, blijft Culex quinquefasciatus relatief onderbelicht. Dit micro-injectieprotocol is specifiek ontworpen om tegemoet te komen aan de unieke biologische eigenschappen van Culex quinquefasciatus, inclusief eierverzameling, scheiding van eiervlotten en procedures na de injectie.
Deze methode kan waarschijnlijk worden aangepast aan elke Culex-soort van belang en kan worden gebruikt om genfunctie te bestuderen of om genetisch gebaseerde controletechnologieën voor Culex-soorten te genereren. Begin met het scheiden van de eieren van de vlotten. Gebruik pincetten of een penseel om op het vlot te drukken en de individuele eieren uit elkaar te halen.
Lignen de eieren op een dunne strook dubbelzijdig plakband dat over de bovenkant van een glazen plaatje is geplaatst, waarbij u ervoor zorgt dat de voorste kant van elk ei in dezelfde richting wijst. Bereid het halocarbonmengsel voor door halocarbonreagentia voorzichtig te mengen met water en de mixtuur gedurende een nacht bij 25 graden Celsius te incuberen. Bedek de uitgelijnde eieren met de halocarbonoliemengsel.
Om naalden voor de micro-injecties te genereren, plaatst u een aluminosilicaat capillair glas in een naaldtrekker, volgens de instructies van de fabrikant. Stel de hitte in op 560, snelheid op 100, vertraging op 70, trek op 97 en druk op 500. Activeer vervolgens de naaldtrekker.
Raak voorzichtig met de punt van de getrokken naald gedurende ongeveer 10 seconden op een hoek van 50 graden de roterende diamantschuurplaat om de naaldpunt te schuinen. Bevestig getrokken en geschuind naalden in lijnen van modelleerklei in een petrischaal. Bereid het injectiemengsel voor, bestaande uit genoommodificatiereagentia, en bewaar het op ijs.
Gebruik een microloadertip om twee microliters injectiemengsel in de injectienaad te laden. Plaats de gevulde injectienaad in een micromanipulator gekoppeld aan een elektronische micro-injector en plaats de glazen plaat met de uitgelijnde eieren op het podium van een samengesteld microscoop. Gebruik de micromanipulator om de naald uit te lijnen om op het achterste uiteinde van het embryo te richten onder een hoek van 25 tot 35 graden.
Breng de naald voorzichtig in het embryo in en injecteer het mengsel in een hoeveelheid van ongeveer 10% van het volume van het embryo. Injecteer 20 eieren tegelijk, stop vervolgens en voer embryoherstelprocedures uit. Verwijder binnen 20 minuten na de injectie voorzichtig het halocarbonolie uit de eieren door ze lichtjes te borstelen met een schone penseel.
Til de eieren op met het penseel en plaats ze in een kopje dubbel gedistilleerd water, waarbij u ervoor zorgt dat de eieren op het oppervlak blijven. Controleer de eieren gedurende de volgende zeven dagen op het uitkomen en volg normale larfverzorgingsprocedures. Zicht de geïnjecteerde muggen op mutatiefenotypen met behulp van een stereoscoop.
Deze methode is met succes gebruikt om somatische en erfelijke mutaties te genereren van een gen dat cruciaal is voor de ontwikkeling van donkere oogpigmentatie. CRISPR-Cas9-geproduceerde somatische mutaties werden geteld door te screenen op verlies van pigmentatie in de pupilstadiumogen van geïnjecteerde individuen. Somatische mutaties waren over het algemeen aanwezig als mozaïekfenotypen, waarbij sommige maar niet alle cellen het mutante fenotype hebben.
Erfelijke mutatiesnelheden werden bepaald door mozaïsche G nul-individuen te kruisen en per volledig witoog-nakomelingen te scoren. Deze experimenten resulteerden in een embryo-overlevingspercentage van 64 tot 82%, een somatische mutagenesepercentage van 37 tot 57% en een erfelijke mutagenesepercentage van meer dan 61%. Door multiplexing van sgRNA's om meerdere loci in hetzelfde gen te targeten, stegen de somatische en erfelijke mutagenesepercentages tot wel 86%. Bovendien zijn er gedurende vele generaties levensvatbare homozygote stam van de witte mutanten met succes in het laboratorium bewaard gebleven.
Om de overlevings- en mutagenesepercentages te optimaliseren, moeten alle materialen, inclusief halocarbonolie, injectievloeistof en naalden, goed worden voorbereid voordat micro-injecties worden uitgevoerd. Dit zorgt voor een meer gestroomlijnd en gericht micro-injectieproces.
Overzicht
Dit protocol beschrijft micro-injectietechnieken voor Culex quinquefasciatus-embryo's, geoptimaliseerd voor CRISPR/Cas9-genbewerking. Het maakt een efficiënte generatie van erfelijke geslachtslijnmutaties mogelijk voor genetisch onderzoek en vectorbestrijdingstechnologieën.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genetische manipulatie
- Vectorbiologie
- CRISPR/Cas9-technologie
Achtergrond
- Culex quinquefasciatus is een onvoldoende bestudeerde ziektevector.
- Micro-injectietechnieken zijn cruciaal voor de ontwikkeling van genetische besturingsmiddelen.
- Bestaande protocollen voor andere insectensoorten zijn goed gevestigd.
- Deze methode past zich aan de unieke biologische eigenschappen van Culex-soorten aan.
Doel van het onderzoek
- Om een micro-injectieprotocol voor Culex quinquefasciatus te ontwikkelen.
- Om genfunctiestudies en genetische besturingstechnologieën te faciliteren.
- Om overlevings- en mutagenesepercentages in geïnjecteerde embryo's te optimaliseren.
Gebruikte methoden
- Ei-verzameling en vlotterscheidingstechnieken.
- Bereiding van halocarbon-olie en injectiemengsel.
- Micro-injectie van embryo's met behulp van een micromanipulator.
- Screening op mutante fenotypes na injectie.
Belangrijkste resultaten
- Een overlevingspercentage van 64-82% bij embryo's bereikt.
- Somatische mutagenesepercentages varieerden van 37-57%.
- Germline mutagenesepercentages overschreden 61%.
- Multiplexen van sgRNA's verhoogde mutagenesepercentages tot 86%.
Conclusies
- Het protocol genereert succesvol somatische en germline-mutaties.
- Viabele homozygote voorraden van mutanten werden in het lab onderhouden.
- Goede voorbereiding van materialen verbetert het micro-injectieproces.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient embryo microinjection enables site-specific mutagenesis in Culex quinquefasciatus, a key vector for diseases such as West Nile virus and lymphatic filariasis. This capability supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery by generating heritable mutations for functional gene studies. The protocol addresses species-specific barriers, improving predictive confidence in vector control target identification and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through precise gene knockout in a disease-relevant insect vector.
- Operational Value: Provides a reproducible method to generate germline mutations for functional validation of targets involved in pathogen transmission.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking gene disruption to phenotypic outcomes critical for vector competence.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces quantifiable mutagenesis readouts (somatic and germline rates) to assess editing efficiency across guide RNA designs.
- Operational Value: Standardizes embryo handling and injection conditions, improving assay reproducibility across experimental batches.
- Scalability: Enables multiplexed sgRNA delivery to increase mutagenesis rates, supporting high-throughput target screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Generates heritable white-eye mutants to establish stable genetic lines for long-term phenotypic and transmission studies.
- Operational Value: Achieves embryo survival rates of 64–82%, ensuring sufficient viable mutants for downstream phenotypic screening.
- Translational Continuity: Maintains viable homozygous mutant stocks across generations, supporting preclinical evaluation of genetic control strategies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis to lead identification by enabling functional genomics in an understudied vector species.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis to clarify gene function in pathogen-vector interactions.
- Screening: Delivers quantitative mutagenesis rates (37–57% somatic, >61% germline) to compare guide RNA efficacy and optimize editing conditions.
- Analytics: Enables scoring of mutant phenotypes through stereoscopic screening, providing measurable outputs for hit validation.
- Translational Research: Facilitates continuity from gene discovery to preclinical model development by generating stable mutant lines.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized microinjection workflow adaptable across Culex species, reducing redundant protocol development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by enabling direct genotype-phenotype linkage in a vector-borne disease model.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized egg alignment, halocarbon overlay, and needle preparation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional validation of targets essential for vector survival or pathogen transmission.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on heritable mutation rates and phenotypic severity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling, micromanipulation, and fluorescent or stereoscopic screening.
- Dependent on needle puller, microinjector, and halocarbon oil preparation for embryo viability.
- Necessitates cross-team standardization of egg collection and raft separation techniques.
- Adaptation across Culex species may require adjustments to injection volume and needle geometry.
- Practical limitations include embryo fragility and the need for immediate post-injection recovery to maintain survival rates.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Alignment of C. quinquefasciatus Pre-blastoderm Stage Embryos
1:46
Embryo Microinjection
3:32
Embryo Recovery and Hatching
4:08
Results: Survival and Mutation Rates of Embryos Injected with Single and Multiplexed gRNAs Targeting White
5:25
Conclusion
