Een kwantitatieve detectiemethode voor microRNA's in de nier van een ischemisch nierletsel muismodel

Veranderde expressie van microRNA bij AKI kan nuttig zijn voor biomarkers en therapie. Dit protocol is eenvoudig en bereikt constante resultaten tussen laboratoria. IRI van de nier vertegenwoordigt een van de belangrijkste risicofactoren voor AKI. Het kwantificeren van microRNA's die veranderd zijn door IRI leidt tot een diagnose. MicroRNA's gezuiverd uit niermonster worden toegepast op een ander systeem. Zorgvuldig monitoren voor hypothermie, darmbevochtiging en diepte van anesthesie gedurende de hele procedure. Dit komt omdat er veel handmatige technieken zijn om aan te wennen.

[Verteller] Na bevestiging van gebrek aan reactie op teenknijpen, plaats de verdoofde muis op een verwarmd chirurgisch kussen in de liggende positie. Na het maken van een midline abdominale incisie, gebruik een wattenstaafje bevochtigd met PBS om voorzichtig de darm naar de linkerkant van de extra abdominale holte te duwen om de rechter nier en ureter bloot te leggen en gebruik hoekige forceps om de rechter ureter op te tillen. Liga de ureter op twee plaatsen met 4-0 zijde gevlochten hechtdraad, laat langere knopen achter voor de hechting die dichter bij de nier zit, en snijd tussen de hechtingen. Houd voorzichtig de resterende hechting vast, dissecteer het bindweefsel en vet langs de nier en identificeer een bloedvat dat niet de renale slagaders of aderen zijn die bloed naar de rechter nier leveren. Liga het bloedvat en, wanneer de rechter nier voldoende is losgemaakt, liga de nierslagader en -ader. Met behulp van een wattenstaafje bevochtigd met PBS, duw voorzichtig de darm naar de rechterkant van de extra abdominale holte om de linker nier bloot te leggen en dek het darmkanaal af met een bevochtigd doek. Nadat de linker nier is voorbereid zoals gedemonstreerd, klemmen de renale slagader en -ader een centimeter van de nier om linkernierischemie te induceren. Een succesvolle ischemie kan visueel worden bevestigd door een geleidelijke uniforme donkerder wording van het nierweefsel. Wanneer ischemie is bevestigd, breng het darmweefsel terug in de buikholte, zorg ervoor darmen niet draaien, en sluit en drapeer tijdelijk de buikhuid. Na 25 tot 45 minuten, verwijder de klem en bevestig dat de doorbloeding van het bloed en de kleur van de nier verbeteren. Na bevestiging dat de darm niet gedraaid is, instilleer intraperitoneaal PBS en sluit de buikspier en huid in twee lagen met behulp van 4-0 nylon hechtingen. 24 uur na inductie van ischemische schade, open de midline incisie opnieuw en gebruik een 27-gauge naald om het bloed uit de inferieure vena cava te verzamelen. Maak een midline incisie in de borstwand en steek een 23-gauge naald in het linker ventrikel. Na bevestiging van terugstroming in de naald, maak een incisie in de rechter lob van de lever en injecteer 20 milliliter PBS. De lever zal rood naar roze veranderen, wat bevestigt dat voldoende bloed is afgevoerd. Gebruik forceps en schaar om de linker nier te verwijderen en was het verwijderde weefsel in een schaal met PBS. Gebruik vervolgens de forceps om de nierfascie te verwijderen zonder de nier uit te drogen en snijd de nier in tweeën langs de verticale middenlijn. Voor microRNA-zuivering, plaats 30 milligram van het bevroren niermonster in een glazen homogenisator met 700 microliters fenylguanidine-gebaseerde lysisreagens op ijs en draai langzaam en herhaaldelijk de stamper om het monster volledig te homogeniseren. Wanneer het weefsel volledig is gedissocieerd, breng de gehomogeniseerde lysate over naar het biopolymeer-vergruizingssysteem in een microcentrifuge spinkolom in een tweeduizend milliliter opvangbuis en verzamel het monster op de bodem van de buis door centrifugatie. Breng de lysate over naar een nieuwe microcentrifugebuis met 140 microliters chloroform en meng de buis door omkering gedurende 15 seconden met de dop stevig vastgedraaid. Na een incubatie van twee tot drie minuten bij kamertemperatuur, sedimenteer het monster door centrifugatie en breng de supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis met 1,5 keer het volume van 100% ethanol zonder het pellet te verstoren. Meng het monster gedurende vijf seconden door middel van vortexen voordat u 700 microliters van het monster overbrengt naar een silica-membraangebaseerde spinkolom in een tweeduizendmilliliter opvangbuis. Na een korte centrifugatie, gooi de doorstroming weg en was het monster twee keer met 500 microliters wasbuffer 2 in een nieuwe silica-membraangebaseerde spinkolom per was om eventuele sporen van zout te verwijderen. Na de tweede was, centrifugeer de silica-membraangebaseerde spinkolom opnieuw en, na het weggooien van de doorstroming, breng de kolom over naar een nieuwe 1,5 milliliter opvangbuis. Voeg 25 microliter RNase-vrij water toe aan de kolom en incubeer het monster gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur voordat het monster opnieuw wordt gecentrifugeerd. Breng vervolgens de 25 microliter microRNA-bevattende eluaat over naar een nieuwe microcentrifugebuis. In deze studie werden zeven microRNA's onderzocht die in mensen tot expressie worden gebracht en die in de nieren van muizen met acute nierbeschadiging waren opgereguleerd. De niveaus van zes van de microRNA's bleken significant verhoogd in de nieren van ischemie-reperfusie-verwonding muizen in vergelijking met die in mock-muizen met behulp van kwantitatieve real-time PCR zoals gedemonstreerd. Serum bloed ureum stikstof en creatinine niveaus en acute tubulaire necrose waren ook significant opgereguleerd.

De biomarkers voor IRI-diagnose en specifieke behandeling van AKI blijven onduidelijk. Ik hoop dat microRNA-onderzoek zal vorderen en bijdragen aan de diagnose en behandeling van AKI.