Name: Het creëren van gematchte in vivo/in vitro patiënt-afgeleide modelparen van PDX en PDX-afgeleide organoïden voor kankerfarmacologisch onderzoek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: Leer hoe je PDX-afgeleide organoïden creëert voor kankerfarmacologisch onderzoek. Deze methode genereert gematchte in vivo/in vitro modelparen voor nauwkeurige in vitro screening en validatie van therapeutische middelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Dr. Jody Barbeau, Federica Parisi en Rajendra Kumari bedanken voor het kritisch lezen en redigeren van het manuscript. De auteurs willen ook het Crown Bioscience Oncology in vitro en in vivo team bedanken voor hun grote technische inspanningen.

Alle protocollen en wijzigingen of procedures met betrekking tot de verzorging en het gebruik van dieren werden voorafgaand aan het uitvoeren van de studies beoordeeld en goedgekeurd door het Crown Bioscience Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). De verzorging en het gebruik van dieren werd uitgevoerd in overeenstemming met aaalac (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) Internationale richtlijnen zoals gerapporteerd in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Research Council (2011). Alle dierproefprocedures werden onder steriele omstandigheden uitgevoerd in SPF-faciliteiten (specifieke ziekteverwekkervrije) faciliteiten en uitgevoerd in strikte overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van verschillende overheidsinstellingen (bijv. de Nationale Instituten voor Gezondheid). De protocollen werden goedgekeurd door de Commissie ethiek van dierproeven van de instelling van de faciliteit (bv. het institutioneel IACUC-comité).
1. Voorbereiding op tumortransplantatie
<ol><li>
Huisvesting van dieren
	<ol>
<li>HuisBalb/c naakte muizen (n=5) in individuele geventileerde kooien, bij 20-26 °C, 30-70% vochtigheid, en een verlichtingscyclus van 12-h licht/12-h donker, met maïskolf beddengoed wekelijks verschoond, en bestraling gesteriliseerd droog korrelvoer plus steriel drinkwater ad libitum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding donortumorfragment
	<ol>
<li>Houd tumordragende donormuizen nauwlettend in de gaten op lichaamsgewicht (BW, via weegbalans) en tumorvolume (tv, door remklauwmeting).</li>
		<li>Wanneer tv 800-1000 mm3bereikt, euthanaseer dan de tumordragende dieren in een biogevaarlijke kap.<ol>
<li>Plaats muizen in een euthanasiekamer met een deksel dat CO2-gas in de kamer levert. Ontlaad gas in de kamer met een debiet dat snelle bewusteloosheid produceert met minimale nood voor het dier. Het optimale debiet voor CO2 ligt rond 2-2,5 Lpm.</li>
			<li>Zorg voor euthanasie door te observeren dat de dieren niet bij bewustzijn komen.</li>
			<li>Na schijnbare klinische dood, houd de gasstroom gedurende >1 min in stand om de kans te minimaliseren dat een dier kan herstellen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Steriliseer de huid rond de tumor met behulp van iodofordoekjes. Verzamel tumoren door aangrenzende niet-tumorweefsels te verwijderen en in een petrischaaltje te plaatsen met 20 ml PBS, voorgekoeld (4 °C) vóór euthanasie.</li>
		<li>Was de tumoren met PBS in een andere Petrischaal om bloedbestanddelen te verwijderen, gevolgd door het doormidden snijden en verwijderen van eventuele extra huid, bloedvaten, verkalking en/of necrose.</li>
		<li>Plaats alleen intacte tumorstukken in een steriele centrifugebuis van 50 ml met 20 ml PBS, voordat u ze naar een aparte dierenruimte voor transplantatie transporteert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Subcutane tumorgroei
<ol><li>
Subcutane inenting van tumorstuk in immunocompromitteerde muizen
	<ol>
<li>Snijd de PDX-tumor in stukken van 2 mm met een scalpel en plaats ze in trocars voor subcutane (SC) implantatie.</li>
		<li>Verdoof de ontvangende dieren met 5% isofluraan (onderhouden door een neuskegel op 1%). De dieren ontspannen, verliezen hun juiste reflex en worden uiteindelijk onbeweeglijk, totdat ze niet reageren op pijn. Bevestig de verdoofde muizen op een experimenteerbord in de juiste laterale positie en steriliseer met iodofordoekjes, met name de gebieden rond de plaats van tumorenting.</li>
		<li>Op de linkerflankhuid net schedel tot aan de heup, maak een incisie van 0,5 cm met een scalpel en maak een tunnel onder de huid naar de voorpoten, 2-3 cm, met behulp van stompe tang.</li>
		<li>Breng aseptisch één kubus van tumorfragment per inentingsplaats over van het medium en plaats diep in de onderhuidse tunnel. Bevestig visueel de positie van het fragment voorafgaand aan het sluiten van de wond met wondclips.</li>
		<li>Bewaak de geïmplanteerde muizen (5) totdat ze zich bewust worden van het behoud van sternale ligfiets en breng ze pas terug naar hun kooi na hun volledige herstel van anesthesie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tumordragende muizen gezondheidsmonitoring
	<ol>
<li>Controleer dagelijks de water- en voedselconsumptie en registreer wekelijks het lichaamsgewicht.</li>
		<li>Controleer de muizen tijdens routinematige controle. Registreer eventuele effecten op mobiliteit, ademhaling, verzorging en algemene verschijning, voedsel- en waterconsumptie, BW winst / verlies, ascites, enz.</li>
		<li>Meet tv twee keer per week met remklauwen en druk uit in mm3 per: TV = 0,5 a × b2, waarbij a en b respectievelijk de lengte en breedte van de tumor zijn.</li>
		<li>Offer dieren op om monsters te verzamelen wanneer een van de volgende tekenen verschijnt: BW-verlies >20%; verminderde mobiliteit (niet in staat om te eten of te drinken); niet in staat om normaal te bewegen als gevolg van significante ascites of vergrote buik; inspanning bij de ademhaling; dood.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Obductie en tumoroogst
<ol><li>Wanneer het tumorvolume 200-800 mm3bereikte, euthanaseer muizen volgens goedgekeurde protocollen (zie stap 1.2.2).</li>
	<li>Verzamel tumorweefsels door aangrenzende niet-tumorweefsels te verwijderen, gevolgd door het weefsel in een plastic buis van 50 ml met AD +++ (op ijs) te plaatsen vóór dissociatie.</li>
</ol>4. Voorbereiding op PDX-afgeleide organoïde cultuur
OPMERKING: Alle volgende stappen werden uitgevoerd in een bioveiligheidskast volgens de standaardrichtlijnen voor weefselkweek. Bewaar voorverwarmde voorraden van 96-, 24- en 6-putplaten in een incubator van 37 °C voor gebruik.
<ol><li>Reagenspreparaten<ol>
<li>Bereid keldermembraanextract (BME) oplossing (groeifactor verminderd, Fenol roodvrij). Bewaar 10 ml BME 's nachts in een koelkast van 4 °C. Eenmaal ontdooid, wervelt u de BME-fles om verspreiding te garanderen.</li>
		<li>Bereid basismedia/wasbuffer AD+++. Voeg 5 ml L-glutamine van 200 mM, 1 M HEPES en Pen/Strep toe aan geavanceerde DMEM/F12-media door te pipetten met een pipet van 5 ml.</li>
		<li>Bereid colon organoïde medium zoals beschreven door Sato et al.18 door aanvulling van basismedia met N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EFG (50 ng/ml), Noggin (100 ng/ml), Nicotinamide (10 mM), SD202190 (10 nM), R-spondin (500 ng/ml), L-glutamine (2 mM), HEPES (10 μM), penicilline-streptomycine (1x) en Y-27623 (10 μM)19.</li>
		<li>Bereid AD+++Digestiemedium voor: 10 ml 1x organoïde kweekmedia met 500 μL collagenase type II (20 mg/ml) en 10 μL RhoKI Y-27632 (10 mM).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tumordissociatie20<ol>
<li>Breng de tumor over in een plastic buis van 50 ml naar een petrischaal van 10 cm. Maak een macroscopische foto naast een liniaal en noteer een beschrijving van de omstandigheden (d.w.z. grootte, vetweefsels, vascularisatie, necrose, enz.).</li>
		<li>Verwijder overtollige AD+++ door aspiratie en snijd het tumorweefsel in kleine stukjes met een schaar, gevolgd door het overbrengen van 1-2 stukken in een microtube van 2 ml voor het invriezen op droog ijs. Bewaren bij -80 °C voor genomische profilering. Gehakt de resterende stukken in fijnere stukken door een schaar voordat u ze met AD+++ overbrengt naar een plastic buis van 50 ml.</li>
		<li>Was gehakt weefsel 2-3 keer met 35 ml AD+++, gevolgd door toevoeging van 10 ml spijsverteringsmedium (zie stap 4.1.4) en plaatsing op een orbitale shaker bij 4 x g gedurende 1 uur bij 37 °C.</li>
		<li>Homogeniseer het verteerd weefsel door op en neer te pipetten met behulp van een steriele plastic pipet van 5 ml, gevolgd door toevoeging van 20 ml AD+++ en filtratie met een 100 μm celzeef.</li>
		<li>Was de doorvoer tweemaal met AD+++ (draai gedurende 5 min op 450 x g), gevolgd door resuspensie in BME (voeg 4x volume BME toe aan de pellet voor suspensie) en blijf op ijs19.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van organoïde cultuur<ol>
<li>Voeg de BME-celsuspensie in 6-putplaat in meerdere druppels toe tot een totaal van 200 μL per put.</li>
		<li>Breng de plaat over in een incubator van 37 °C. Na 30 minuten stollen de geldruppels.</li>
		<li>Voeg 2 ml organoïde media toe aan elke put, waarbij de representatieve druppels worden geregistreerd door microscopische fotografie voordat ze worden overgebracht naar een incubator (37 °C en 5% CO2).</li>
		<li>Onderhoud de organoïde culturen met gemiddelde verandering om de 3-4 dagen en passage op een 1:2 verhouding om de 7 dagen of afhankelijk van hun groei en dichtheid.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Histopathologie en next generation sequencing (NGS) analyse
<ol><li>Histopathologie<ol>
<li>Verzamel organoïden uit de put met het bestaande medium met behulp van een P1000 pipet, gevolgd door centrifugeren (draaien op 450 x g gedurende 5 min), wassen met PBS en fixatie in 10% formaline gedurende 1 uur.</li>
		<li>Plaats de vaste organoïden in 100% gelatine op de bodem van 50 ml conische buis, gevolgd door routinematige weefselverwerking en inbedding.</li>
		<li>Voer hematoxyline-eosine (H&E) kleuring uit met behulp van standaardprotocollen op 4 mm paraffinesecties.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNAseq en hele exoomsequencing<ol>
<li>Verzamel organoïden uit de put met het bestaande kweekmedium met behulp van een P1000 pipet, gevolgd door centrifugeren met behulp van een microcentrifuge op maximale snelheid (12.000 x g) gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Verzamel de pellet door het medium supernatant te verwijderen om er zeker van te zijn dat er geen zichtbare BME aanwezig was, gevolgd door het invriezen in een microtube (droogijs) en vervolgens overbrengen naar een vriezer van -80 °C.</li>
		<li>Extract RNA of DNA met behulp van standaardprocedure van fabrikanten en voer NGS-analyse uit voor zowel RNAseq als whole exome sequencing (WES).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. IC50 test20
<ol><li>Organoïde zaaien in 384-put plaat voor IC50 test<ol>
<li>Dissocieer organoïden in BME-druppels uit elke put (vertering van BME) door 20 μL 100x dispaseoplossing toe te voegen aan elke put (6-putplaat), die 2 ml organoïde medium bevatte, gevolgd door 10 minuten incubatie bij 37 °C.</li>
		<li>Pipet verteerde organoïden uit alle putten via een filter van 70 μm in een plastic buis van 50 ml om de organoïden te verzamelen.</li>
		<li>Tel de organoïden onder microscopie voor de bepaling van de organoïde concentratie. Schors de organoïden met behulp van kweekmedium, voordat u BME toevoegt om de uiteindelijke concentratie van 5% (v/v) op ijs te bereiken.</li>
		<li>Voeg 50 μL van de organoïde suspensie toe aan elke 384-putplaat met de vloeistofdispenser, volgens de plaatkaart met een zaaidichtheid van 200 CR2110 PPO's per put in het overeenkomstige organoïde kweekmedium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Behandeling met Cisplatine en irinotecan<ol>
<li>Gebruik cisplatine (met de hoogste concentratie van 100 μM) en "irinotecan" (met de hoogste concentratie van 10 μM). Voeg SN-38 (een metaboliet van irinotecan, in tegenstelling tot irinotecan die meestal wordt gebruikt voor in vivo studies) toe aan elke put volgens het geneesmiddelverdunningsschema voor 9 doses, in seriële verdunning door digitale dispener.</li>
		<li>Maak de platemap met behulp van de digitale dispensersoftwaretool. Neem een negatief controlevoertuig op met 100% levensvatbaarheid en postieve controle van 5 μM starurosporine, dat 0% levensvatbaarheid toonde.</li>
		<li>Plaats de met medicijnen behandelde 384-putplaten terug in de incubator van 37 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bepaling van de levensvatbaarheid van organoïdcellen na medicamenteuze behandeling<ol>
<li>Bepaal aan het einde van de 5 dagen van de medicamenteuze behandeling de levensvatbaarheid van organoïde cellen met behulp van luminescente celreagentia volgens de aanbevolen procedure van de fabrikant. Voeg luminescent reagens toe aan elke put met de vloeibare dispener en meng gedurende 5 minuten op een bordschudder, gevolgd door een incubatietijd van 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.</li>
		<li>Neem het lichtgevende signaal op op een luminescentie multi-well plaatlezer.</li>
		<li>Bereken de genormaliseerde viabilities van elke put met behulp van de ruwe metingen van de plaatlezer en creëer een dosis-responscurve en IC50-waarden door niet-lineaire curve-fitting.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tentler, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+tumour+xenografts+as+models+for+oncology+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 9 (6), 338-350 (2012).</li>
<li>Gao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+using+patient-derived+tumor+xenografts+to+predict+clinical+trial+drug+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening using patient-derived tumor xenografts to predict clinical trial drug response.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1318-1325 (2015).</li>
<li>Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+erlotinib+resistance+with+tailored+treatment+regimen+in+patient-derived+xenografts+from+naive+Asian+NSCLC+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Overcoming erlotinib resistance with tailored treatment regimen in patient-derived xenografts from naive Asian NSCLC patients.</a> International Journal of Cancer. 132 (2), 74-84 (2013).</li>
<li>Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+animal+modeling+for+immuno-oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Experimental animal modeling for immuno-oncology.</a> Pharmacology & Therapeutics. 173, 34-46 (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+Cancer+Researchearch%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in Cancer Researchearch.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
<li>Muthuswamy, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+Models+of+Cancer+Explode+with+Possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid Models of Cancer Explode with Possibilities.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 290-291 (2018).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Weeber, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+genetic+diversity+in+organoids+cultured+from+biopsies+of+human+colorectal+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (43), 13308-13311 (2015).</li>
<li>Vlachogiannis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+model+treatment+response+of+metastatic+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids model treatment response of metastatic gastrointestinal cancers.</a> Science. 359 (6378), 920-926 (2018).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Derived+Organoids+Predict+Chemoradiation+Responses+of+Locally+Advanced+Rectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-Derived Organoids Predict Chemoradiation Responses of Locally Advanced Rectal Cancer.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 17-26 (2020).</li>
<li>Ganesh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rectal+cancer+organoid+platform+to+study+individual+responses+to+chemoradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A rectal cancer organoid platform to study individual responses to chemoradiation.</a> Nature Medicine. 25 (10), 1607-1614 (2019).</li>
<li>van de Wetering, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+derivation+of+a+living+organoid+biobank+of+colorectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients.</a> Cell. 161 (4), 933-945 (2015).</li>
<li>Yang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+RNAi+library+based+on+partially+randomized+consensus+sequences+of+nuclear+receptors%3A+identifying+the+receptors+involved+in+amyloid+beta+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A novel RNAi library based on partially randomized consensus sequences of nuclear receptors: identifying the receptors involved in amyloid beta degradation.</a> Genomics. 88 (3), 282-292 (2006).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subset+of+gastric+cancers+with+EGFR+amplification+and+overexpression+respond+to+cetuximab+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A subset of gastric cancers with EGFR amplification and overexpression respond to cetuximab therapy.</a> Scientific Reports. 3, 2992(2013).</li>
<li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+set+of+defined+oncogenic+mutation+alleles+seems+to+better+predict+the+response+to+cetuximab+in+CRC+patient-derived+xenograft+than+KRAS+12%2F13+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">A set of defined oncogenic mutation alleles seems to better predict the response to cetuximab in CRC patient-derived xenograft than KRAS 12/13 mutations.</a> Oncotarget. 6 (38), 40815-40821 (2015).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Pathology+of+Patient+Tumors%2C+Patient-Derived+Xenografts%2C+and+Cancer+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular Pathology of Patient Tumors, Patient-Derived Xenografts, and Cancer Cell Lines.</a> Cancer Research. 76 (16), 4619-4626 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Tiriac, H., French, R., Lowy, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Patient-derived+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma+Organoid+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models.</a> Journal of Visualized Experiments. (155), (2020).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nature Medicine. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Corcoran, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+BRAF+and+MEK+Inhibition+With+Dabrafenib+and+Trametinib+in+BRAF+V600-Mutant+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Combined BRAF and MEK Inhibition With Dabrafenib and Trametinib in BRAF V600-Mutant Colorectal Cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. , (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
</ol>

Alle auteurs zijn de huidige fulltime medewerkers van Crown Bioscience, Inc.

De voorlopige gegevens voor PDX-/PDXO-CR2110 in dit rapport ondersteunen de biologische gelijkwaardigheid tussen PDX en zijn derivaat PDXO, met betrekking tot genomica, histopathologie en farmacologie, aangezien beide modellen de ziektevormen vertegenwoordigen die zijn afgeleid van de oorspronkelijke CSC van de patiënt. Beide modellen zijn patiënt-afgeleide ziektemodellen, potentieel voorspellend voor de klinische respons van patiënten10,11,<sup class=...

Kankers zijn een verzameling van verschillende genetische en immunologische aandoeningen. Succesvolle ontwikkeling van effectieve behandelingen is sterk afhankelijk van experimentele modellen die klinische resultaten effectief voorspellen. Grote bibliotheken van goed gekarakteriseerde patiënt-afgeleide xenografts (PDX) worden al lang gezien als het translationele in vivo systeem bij uitstek om chemo- en/of gerichte therapieën te testen vanwege hun vermogen om patiënttumorkenmerken, heterogeniteit en respons van patiëntengeneesmiddelen samen tevatten 1, waardoor fase II-achtige muis klinische studies het klinische succes kunnen verbeteren2,3. PDX's worden over het algemeen beschouwd als kankerstamcelziekten, met genetische stabiliteit, in tegenstelling tot cellijn afgeleide xenografts2. In de afgelopen decennia zijn over de hele wereld grote collecties PDX's gemaakt, die vandaag de dag het werkpaard worden van de ontwikkeling van kankermedicijnen. Hoewel ze veel worden gebruikt en met een grote vertaalwaarde, zijn deze diermodellen intrinsiek duur, tijdrovend en lage doorvoer, daarom ontoereikend voor grootschalige screening. PDX zijn ook ongewenst voor immuno-oncologie (IO) testen als gevolg van een immuun-gecompromitteerd karakter4. Het is dus onpraktisch om ten volle te profiteren van de beschikbare grote bibliotheek met PDX's.
Recente ontdekkingen, die door het laboratorium van Hans Clevers5zijn geïntroduceerd, hebben geleid tot de oprichting van in vitro culturen van organoïden die worden gegenereerd uit volwassen stamcellen in de meeste menselijke organen van epitheliale oorsprong5. Deze protocollen zijn verder verfijnd om de groei van organoïden van veronderstelde CSC 's in menselijke carcinomen van verschillende indicaties6,7mogelijk te maken . Deze patiënt-afgeleide organoïden (BOB 's) zijn genomisch stabiel8,9 en zijn zeer voorspellend gebleken voor klinische behandelingsuitkomsten10,11,12. Bovendien maakt het in vitro karakter van BOB's screening met hoge doorvoer (HTS)13mogelijk, waardoor mogelijk een voordeel wordt geboden ten opzichte van in vivo modellen en grote organoïde bibliotheken worden gebruikt als surrogaat van de patiëntenpopulatie. PPO's staan op het punt om een belangrijk ontdekkings- en vertaalplatform te worden en de vele beperkingen van PDX's die hierboven worden beschreven, te overwinnen.
Zowel BOB als PDX zijn patiënt- en CSC-gestuurde modellen, met de mogelijkheid om therapeutische onderzoeken te evalueren in de context van een gepersonaliseerde behandeling of een klinisch onderzoeksformaat. Bestaande grote bibliotheken van PDX's, zoals de eigen collectie van >3000 PDXs14,15,16,17, zijn daarom geschikt voor de snelle generatie van bibliotheken van tumororganoïden (PDX-afgeleide organoïden, of PDXO), wat resulteert in een bijpassende bibliotheek van gekoppelde PDX- en PDXO-modellen. Dit rapport beschrijft de procedure voor het maken en karakteriseren van colorectale kanker PDXO-CR2110 in relatie tot het ouderlijke PDX-CR2110 model16.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634028</td><td>Basismedium</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td>Wassmedium</td></tr><tr><td>Collagenese type II</td><td>Invitrogen</td><td>17101015</td><td>Tumor verteren</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Organoïde kweekmatrix (Basement Membrane Extract, groeifactor verminderd)</td></tr><tr><td>N-Ac</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7076</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>Gastrine</td><td>Sigma</td><td>G9145</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>Rspondin</td><td>Peprotech</td><td>120-38-1000</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Life Technologies</td><td>15630056</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>penicilline-streptomycine</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole</td><td>M1817</td><td>Organoïde kweekmedium</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105041</td><td>Screeningsassay</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td>Screeningsassay (luminescerend ATP-indicator)</td></tr><tr><td>Multidrop dispenser</td><td>Thermo Fisher</td><td>Multidrop combi</td><td>Organoïde platen/CellTiter-Glo 3D toevoeging</td></tr><tr><td>Digital dispener</td><td>Tecan</td><td>D300e</td><td>Verbinding toevoeging</td></tr><tr><td>Envision Plate reader</td><td>Perkin Elmer</td><td>2104</td><td>Luminescentie meting</td></tr><tr><td>Balb/c naaktmuizen</td><td>Beijing HFK Bio-Technology Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>tRNA zuiveringskit</td></tr><tr><td>DNAeasy Blood &amp; Tissue Kit</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>DNA zuiveringskit</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Fisher</td><td>HG-4000-012</td><td>Organoïde inbedding</td></tr></tbody></table>

het creëren van gematchte in vivo/in vitro patiënt-afgeleide modelparen van pdx en pdx-afgeleide organoïden voor kankerfarmacologisch onderzoek

Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research

Patiënt-afgeleide tumor xenografts (PDXs) worden beschouwd als de meest voorspellende preklinische modellen, grotendeels verondersteld te worden aangedreven door kanker stamcellen (CSC) voor conventionele kanker drug evaluatie. Een grote bibliotheek van PDX's weerspiegelt de diversiteit van patiëntenpopulaties en maakt zo populatiegebaseerde preklinische studies mogelijk ("Fase II-achtige muis klinische studies"); PDX heeft echter praktische beperkingen van lage doorvoer, hoge kosten en lange duur. Tumororganoïden, ook door de patiënt afgeleide CSC-gestuurde modellen, kunnen worden beschouwd als het in vitro equivalent van PDX, waarmee bepaalde PDX-beperkingen voor het omgaan met grote bibliotheken van organoïden of verbindingen worden overschreden. Deze studie beschrijft een methode om PDX-afgeleide organoïden (PDXO) te maken, wat resulteert in gekoppelde modellen voor in vitro en in vivo farmacologisch onderzoek. Subcutaan getransplanteerde PDX-CR2110 tumoren werden verzameld van tumordragende muizen toen de tumoren 200-800 mm3bereikten, volgens een goedgekeurde autopsieprocedure, gevolgd door verwijdering van de aangrenzende niet-tumorweefsels en dissociatie in kleine tumorfragmenten. De kleine tumorfragmenten werden gewassen en door een 100 μm celzeef gepasseerd om het puin te verwijderen. Celclusters werden verzameld en opgehangen in keldermembraanextract (BME) oplossing en geplateerd in een 6-put plaat als een vaste druppel met omringende vloeibare media voor groei in een CO2 incubator. Organoïde groei werd tweemaal per week gecontroleerd onder lichte microscopie en opgenomen door fotografie, gevolgd door vloeibare mediumverandering 2 of 3 keer per week. De gekweekte organoïden werden verder gepasseerd (7 dagen later) in een verhouding van 1:2 door de BME ingebedde organoïden te verstoren met behulp van mechanisch scheren, geholpen door toevoeging van trypsine en de toevoeging van 10 μM Y-27632. Organoïden werden cryopreserved in cryo-buizen voor langdurige opslag, na versie van BME door centrifugation, en ook bemonsterd (b.v., DNA, RNA en FFPE blok) voor verdere karakterisering.

Morfologie van PDXA's, typisch voor organoïden onder lichte microscopie, en consistent met ouderlijke PDX per H&E-kleuring Onder lichte microscopie vertoont PDXO-CR2110 typische cystische morfologie (figuur 1A), zoals eerder beschreven voor patiënt-afgeleide organoïden (BOB), bewijs dat de gelijkenis tussen PDXO en BOB onder dezelfde kweekomstandigheden ondersteunt.
Histopathologisch onderzoek door H&E-kleuring toont aan dat de weefselstructure...

Er wordt beschreven dat een methode wordt beschreven om organoïden te maken met behulp van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) voor in vitro screening, wat resulteert in overeenkomende paren in vivo/in vitro modellen. PDX-tumoren werden mechanisch of enzymatisch in kleine stukjes geoogst/verwerkt, gevolgd door de Clevers'-methode om tumororganoïden te kweken die werden gepasseerd, cryopreserved en gekarakteriseerd tegen de oorspronkelijke PDX.

Het creëren van gematchte in vivo/in vitro patiënt-afgeleide modelparen van PDX en PDX-afgeleide organoïden voor kankerfarmacologisch onderzoek

Patient-derived tumor xenografts (PDXs) are considered the most predictive preclinical models, largely believed to be driven by cancer stem cells (CSC) ...

Dit protocol kan worden gebruikt om een overeenkomende bibliotheek van gekoppelde patiënt-afgeleide xenografts, of PDX, en overeenkomstige patiënt-afgeleide organoïde lijnen vast te stellen. Het voordeel van deze methode is dat het kan worden gebruikt om organoïden te maken met PDX voor in vitro screening, wat resulteert in overeenkomende paren in vivo / in vitro modellen. Begin met het oogsten van de tumoren en het verwerken van het weefsel zoals beschreven in het teksthandschrift.Pipet het weefsel na de weefselvertering op en neer met een steriele plastic pipet van vijf milliliter. Voeg vervolgens 20 milliliter AD+ toe aan het homogenaat en filtreer het met een celzeef van 100 micrometer. Was het filtraat tweemaal met AD+, breng het vervolgens over in een plastic buis en centrifugeer het gedurende vijf minuten op 450 maal G.Resuspend de cellen in BME en houd ze op ijs. Om de organoïde cultuur voor te bereiden, brengt u 200 microliters van de celsuspensie over naar elke put van een zesputplaat en incubeert u de plaat gedurende 30 minuten op 37 graden Celsius. Voeg twee milliliter organoïde media toe aan elke put en beeld de vertegenwoordiger onder een microscoop.Houd de organoïde culturen op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide met gemiddelde veranderingen om de drie tot vier dagen en passage in een een-op-twee verhouding om de zeven dagen. Nadat u de organoïden hebt losgekoppeld, voert u ze door een filter van 70 micrometer in een plastic buis van 50 milliliter. Tel de organoïden onder een microscoop en resuspend ze in BME op ijs voor een uiteindelijke concentratie van 5%Voeg 50 microliters van de organoïde suspensie toe aan elke 384-putplaat met een vloeibare dispenser voor een zaaidichtheid van 200 CR2110 PDXA's per put.Gebruik de digitale dispenser om SN38 toe te voegen aan elke put in seriële verdunning. Maak een plaatkaart met behulp van de softwaretool voor digitale dispensers. De behandelingen moeten een negatief controlevoertuig met 100% levensvatbaarheid en positieve controle van vijf micromolar Staurosporine met 0% levensvatbaarheid omvatten.Wanneer u klaar bent, plaatst u de met medicijnen behandelde 384-putplaten terug in een incubator van 37 graden Celsius. Onder lichte microscopie vertoont PDXO CR2110 typische cystische morfologie die de gelijkenis aantoont tussen PDX-afgeleide organoïden en van de patiënt afgeleide organoïden onder dezelfde kweekomstandigheden. Histopathologisch onderzoek door H&E-kleuring toont aan dat de weefselstructuren en celtypen PDXO CR2110 vergelijkbaar zijn met de oorspronkelijke PDX CR2110.Genomische profielvergelijkingen van PDX en PDXO tonen een correlatie van 94,92% van transcriptoomexpressie en een concordantie van 97,67% van DNA-mutaties aan, wat wijst op een algehele genomische gelijkenis tussen dit paar modellen. Geneesmiddelgevoeligheidstesten werden uitgevoerd op PDXO CR2110 in 384-putplaten. PDXO CR2110 was gevoelig voor irinotecan en resistent tegen cisplatine, in overeenstemming met de pdx-behandelingsresultaten.Het overeenkomende paar in vitro en in vivo modellen kan elkaar complimenteren voor in vitro screening en validatie in vivo, waardoor het slagingspercentage van de ontdekking van geneesmiddelen wordt verbeterd en de attritiepercentages in de klinische ontwikkeling mogelijk worden verminderd.

creating-matched-vivoin-vitro-patient-derived-model-pairs-pdx-pdx

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Patiënt-afgeleide organoïde culturen van pancreas ductaal adenocarcinoom zijn een snel gevestigde 3-dimensionale model dat epitheliale tumor cel compartimenten met hoge getrouwheid vertegenwoordigen, waardoor translationeel onderzoek naar deze dodelijke maligniteit. Hier bieden we gedetailleerde methoden om organoïden te vestigen en door te geven en om relevante biologische testen uit te voeren met behulp van deze modellen.

Isolatie en karakterisering van patiënt-afgeleide pancreatic Ductal adenocarcinoom Organoid modellen

Hier presenteren we een protocol om de werkzaamheid van gerichte therapieën geselecteerd op basis van de genomische samenstelling van een tumor te testen. Het protocol beschrijft identificatie en validatie van structurele DNA-herschikkingen, engraftmentatie van tumoren van patiënten in muizen en het testen van reacties op overeenkomstige geneesmiddelen.

Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts

In het volgende werk beschrijven we de opeenvolgende stappen die nodig zijn voor de oprichting van een grote biobank van colorectale en alvleesklierkanker.

Creatie en onderhoud van een levende biobank - Hoe we het doen

Een zeer nauwkeurig in vitro high-throughput testsysteem werd ontwikkeld om geneesmiddelen tegen kanker te evalueren met behulp van patiënt-afgeleide tumororganoïden (BOB's), vergelijkbaar met kankerweefsels, maar zijn ongeschikt voor in vitro high-throughput testsystemen met 96-well en 384-well platen.

High-Throughput In Vitro Assay met behulp van patiënt-afgeleide tumor organoïden

Dit protocol beschrijft een semi-geautomatiseerde methode voor medium- tot high-throughput organoïde medicijnscreenings en microscoop-agnostische, geautomatiseerde beeldanalysesoftware om multiparametrische, single-organoïde geneesmiddelresponsen te kwantificeren en te visualiseren om intratumor heterogeniteit vast te leggen.

Multiparametrische tumor organoïde drug screening met behulp van Widefield Live-Cell Imaging voor bulk en single-organoïde analyse

Het huidige protocol stelt een patiënt-afgeleid xenograft (PDX) model van anaplastisch schildkliercarcinoom (ATC) en hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) vast en karakteriseert het, aangezien PDX-modellen snel de standaard worden op het gebied van translationele oncologie.

Vaststelling en karakterisering van patiënt-afgeleide xenograftmodellen van anaplastisch schildkliercarcinoom en hoofd-hals plaveiselcelcarcinoom

We presenteren een protocol dat kan worden gebruikt om therapeutische geneesmiddelentests uit te voeren met van patiënten afkomstige eierstokkankerorganoïden.

Eierstokkanker Patiënt-afgeleide organoïdemodellen voor preklinische geneesmiddelentests

Tumororganoïden hebben een revolutie teweeggebracht in kankeronderzoek en de benadering van gepersonaliseerde geneeskunde. Ze vertegenwoordigen een klinisch relevant tumormodel waarmee onderzoekers de tumor in de kliniek een stap voor kunnen blijven. Dit protocol stelt tumororganoïden vast uit verse weefselmonsters van pancreastumoren en van patiënten afgeleide xenotransplantaten van pancreasadenocarcinoomoorsprong.

Oprichting van van alvleesklierkanker afgeleide tumororganoïden en fibroblasten uit vers weefsel

Tumororganoïden van patiënten zijn een geavanceerd modelsysteem voor fundamenteel en translationeel onderzoek. Dit methodeartikel beschrijft het gebruik van gemultiplexte fluorescerende beeldvorming van levende cellen voor gelijktijdige kinetische beoordeling van verschillende organoïde fenotypes.

Meervoudige beeldvorming met levende cellen voor geneesmiddelresponsen in van patiënten afgeleide organoïdemodellen van kanker

Hier presenteren we een protocol om van melanoompatiënten afgeleide organoïden te genereren door het kweken van gedissocieerde celsuspensies uit vers melanoomweefsel. Deze organoïden recapituleren getrouw patiëntspecifieke tumoren in vitro en bieden een innovatieve benadering voor het onderzoeken van immunosuppressieve mechanismen van tumoren, screening van geneesmiddelen, mechanismen voor resistentie tegen geneesmiddelen en benaderingen voor kankerbewaking.

Onthulling van therapeutische mogelijkheden met van melanoom patiënt afgeleide organoïde modellen

Leer hoe je PDX-afgeleide organoïden creëert voor kankerfarmacologisch onderzoek. Deze methode genereert gematchte in vivo/in vitro modelparen voor nauwkeurige in vitro screening en validatie van therapeutische middelen.

Het creëren van gematchte in vivo/in vitro patiënt-afgeleide modelparen van PDX en PDX-afgeleide organoïden voor kankerfarmacologisch onderzoek (Video) | JoVE Journal

Het creëren van gematchte in vivo/in vitro patiënt-afgeleide modelparen van PDX en PDX-afgeleide organoïden voor kankerfarmacologisch onderzoek

Meer video's verkennen