Name: Skelet fenotype analyse van een voorwaardelijke Stat3 verwijdering muismodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Leer skelet fenotype analyse met TRAP kleuring, micro-CT en dubbele fluorescentie labeling in Stat3 Ctsk muismodellen. Deze methoden helpen onderzoekers osteoclast differentiatie en botmassa regulatie bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken prof. Weiguo Zou en S. Kato voor reagentia en muizen en de leden van het Zou laboratorium voor nuttige discussies. We danken ook het Laboratorium voor Gedigitaliseerde Stomatologie en Onderzoekscentrum voor Craniofaciale Anomalieën van het Shanghai Ninth People's Hospital voor hulp. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (NSFC) [81570950,81870740,81800949], Shanghai Summit & Plateau Disciplines, het SHIPM-mu fonds van het Shanghai Institute of Precision Medicine, Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine [JC201809], het Incentive Project of High-Level Innovation Team for Shanghai Jiao Tong , het cross-disciplinaire onderzoeksfonds van het Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai JiaoTong university School of Medicine [JYJC201902]. En L.J. is een geleerde van de Outstanding Youth Medical Talents, Shanghai "Rising Stars of Medical Talent" Youth Development Program en het "Chen Xing" project van shanghai Jiaotong University.

Alle methoden met betrekking tot de hier beschreven dieren zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Shanghai Jiaotong University School of Medicine.
1. Fokken van osteoclasten specifieke Stat3 deletie muizen
OPMERKING: Stat3fl/fl muizen werden commercieel verkregen. Ctsk-Cre muizen werden geleverd door S. Kato (Universiteit van Tokio, Tokio, Japan12). De muizen werden gefokt en onderhouden onder specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) omstandigheden in de institutionele dierenfaciliteit onder gestandaardiseerde omstandigheden.
<ol><li>Koppel een geslachtsrijpe mannelijke muis met twee vrouwelijke muizen van dezelfde leeftijd. Controleer na 18 dagen de dagelijkse controles op pasgeborenen. Scheid de zwangere vrouwelijke muizen en houd deze indien nodig alleen. Verander mannelijke muizen tussen verschillende fokkooien als de vrouwelijke muizen niet zwanger waren binnen 1 maand na de koppeling.</li>
	<li>Kruis Stat3fl/fl muizen naar Ctsk-Cre muizen (F0). Knip de staarten voor genotypering en houd de mannelijke Stat3fl/+; Ctsk-Cre muizen tot ze geslachtsrijp zijn, wat ongeveer 6 weken oud is (F1). Gebruik de volgende primers: Stat3 F-TTGACCTGTGCTCCTACAAAAA; Stat3 R-CCCTAGATTAGGCCAGCACA; Ctsk-cre F-GAACGCACTGATTTCGACCA; Ctsk-cre R-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC.</li>
	<li>Cross 6 weken oude man Stat3fl/+; Ctsk-Cre muizen met vrouwelijke Stat3fl/fl muizen. Knip de staarten voor genotypering en houd de mannelijke Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre muizen tot ze geslachtsrijp zijn, wat ongeveer 6 weken oud is (F2).</li>
	<li>Cross 6 weken oude man Stat3 fl/fl; Ctsk-Cre muizen met vrouwelijke Stat3fl/fl muizen (F3). Knip de staarten voor genotypering en vervang de oude fokmuizen op tijd door jongere muizen (F3+N).</li>
</ol>2. Specimen collectie
<ol><li>Euthanaseer zes paren van 8 weken oude mannelijke Stat3fl/fl en Stat3Ctsk littermate muizen afzonderlijk met koolstofdioxide verstikking. OPMERKING: Het CO2-debiet verplaatst 30% van het kooivolume per minuut (bijv. voor een kooi van 45 cm x 30 cm x 30 cm is het CO2-debiet 40 L/min).</li>
	<li>Plaats de muizen in een liggende positie. Ontwricht de bilaterale heupgewrichten voorzichtig met de hand. Gebruik een oogheelkundige schaar om de huid verticaal af te snijden van het distale scheenbeen en ontleed vervolgens de hele huid van de achterste ledemaat.</li>
	<li>Snijd het gewrichtsbandje van het rechter heupgewricht en het kniegewricht af met een schaar om de achterpoot te scheiden. Snijd de trochanter en de verbinding van het kuitbeen door en dompel de achterste ledemaat onder in 4% paraformaldehyde. Houd de rechter achterpoten voor stap 3. Snijd het bot aan beide uiteinden op de juiste manier om het beenmerg volledig onder te dompelen en te fixeren met 4% paraformaldehyde.</li>
	<li>Knip het gewrichtsbandje van het linker heupgewricht en kniegewricht met een schaar, verwijder voorzichtig het zachte weefsel en scheid voorzichtig het scheenbeen en dijbeen. Dompel het scheenbeen en dijbeen apart onder in 75% ethanol. Houd de femora voor stap 4 en tibiae voor stap 6. Zorg ervoor dat de trochanter intact blijft.</li>
</ol>3. Paraffine sectie voorbereiding
<ol><li>Bevestig de rechter achterpoot in 4% paraformaldehyde bij 4 °C gedurende 48 uur.</li>
	<li>Ontkalken: Was de monsters voorzichtig 3 keer met 1x PBS gedurende 10 min. Ontkalk de monsters in 15% EDTA (150 g EDTA in 800 ml ddH2O en 100 ml 10x PBS) met een ultrasone ontkalker gedurende 3 tot 4 weken totdat de botten kunnen worden gebogen. Om de dag vervangen door verse ontkalkingsvloeistof.</li>
	<li>Was de monsters voorzichtig 3x met 1x PBS en dompel ze vervolgens 's nachts onder in 75% ethanol bij 4 °C.</li>
	<li>Dehydrateren: Dompel op de tweede dag monsters achtereenvolgens onder in 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen, elk gedurende 1 uur tweemaal.</li>
	<li>Dompel de specimens gedurende 30 minuten onder in 1/2 xyleen 1/2 paraffine. Dompel de specimens 's nachts onder in paraffine bij 65 °C.</li>
	<li>Insluiten: Selecteer een geschikte insluittank voor insluiten. Plaats het scheenbeen gelijkmatig eronder. Plaats het dijbeen en scheenbeen onder een hoek van 90°. Nadat de paraffine volledig is afgekoeld en gestold, verwijdert u deze uit de insluittank. Nummer de specimens en bewaar ze 's nachts bij -20 °C.</li>
	<li>Snijd continu 5 μm dikke secties met behulp van de microtome. Snijd 20-40 secties. Verdeel de secties over 37 °C water, plak ze aan microscoopglaasjes en bak 's nachts op 42 °C.</li>
</ol>4. Micro-CT scannen en analyseren
<ol><li>Scan de linker femora met een micro-CT scanner. Resolutie: 10 μm; Spanning: 70 kV; Stroom: 114 μA; Fliter: 0,5 mm Al; Rotatiestap: 0,5°.</li>
	<li>Reconstrueer 3D-beelden van het corticale bot en trabeculair bot met behulp van de ondersteunende software van de scanner volgens de instructies van de fabrikant. ROI's bevinden zich in een totale breedte van 1 mm trabeculair bot dicht bij de distale groeiplaat en in een totaal 1 mm breed deel van corticale bot in het midden van de femora.</li>
	<li>Bereken de kwantitatieve microarchitectuurparameters: botmineraaldichtheid (BMD), botvolumefractie (BV/TV), trabeculaire dikte (Tb.Th.), trabeculair getal (Tb.N.), trabeculaire scheiding (Tb.Sp.) en corticale botdikte (Ct.Th.).</li>
</ol>5. TRAP kleuring
<ol><li>Bak de paraffinedelen 30 minuten op 65 °C.</li>
	<li>Dewax: Dompel de secties 10 minuten onder in xyleen. Voer deze stap 3x uit met verse xyleen.</li>
	<li>Rehydrateren: Dompel de secties opeenvolgend onder in 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en ddH2O, elk gedurende 5 minuten tweemaal.</li>
	<li>Bereid de kleuroplossing met behulp van de TRAP-kleurset volgens de instructies van de fabrikant en verwarm tot 37 °C. OPMERKING: TRAP-kleuroplossing moet onmiddellijk voor elke test vers worden bereid.</li>
	<li>Voeg 50-100 μL kleuroplossing toe aan elk monster en incubeer gedurende 20-30 minuten in een vochtige kamer van 37 °C. Controleer elke 5 minuten de kleuringsstatus van de osteoclasten onder een lichtmicroscoop totdat rode multinucleated osteoclasten te zien zijn. Beëindig de reactie met ddH2O.</li>
	<li>Counterstain in hematoxyline oplossing gedurende 30 s. Creëer een stabiele blauwe kleur door onderdompeling in 1% ammoniakoplossing gedurende 1 min. Spoel langzaam stromend leidingwater af.</li>
	<li>Monteer de secties met afdeklips met neutrale balsem en droog 's nachts.</li>
	<li>Leg 3-5 interessegebieden vast met een microscoop. Analyseer de trabeculaire omtrek met afbeelding J: meet de lengte van de schaalbalk (Ls) met behulp van het gereedschap 'rechte lijn' als L1 en meet vervolgens de lengte van de trabeculaire omtrek met behulp van het gereedschap 'gesegmenteerde lijn' als L2, de fysieke lengte (Lp)= Ls *L2 /L1). Tel het aantal TRAP-positieve cellen met meer dan drie kernen.</li>
</ol>6. Calcein en alizarin rode dubbele etikettering
<ol><li>Monsterpreparaat: Intraperitoneaal injecteren 20 mg/kg calceïne (1 mg/ml in 2% NaHCO3-oplossing) op dag 0 en 25 mg/kg alizarinerood S (AL, 2 mg/ml in H2O) op dag 4. Offer muizen op dag 7. Ontkoppel het scheenbeen voorzichtig en fixeer 4% paraformaldehyde bij 4 °C gedurende 48 uur.</li>
	<li>Uitdrogen: Was na fixatie het scheenbeen voorzichtig 3x met 1x PBS. Dompel de monsters achtereenvolgens onder in 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen gedurende 5 minuten tweemaal afzonderlijk.</li>
	<li>Dompel de specimens gedurende 12 uur onder in aceton, in 1/2 aceton 1/2 hars gedurende 2 uur en 's nachts in zuivere hars in een droogoven. OPMERKING: De hars is bereid met in de handel verkrijgde hars (bijv. Embed 812 Resin) volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Insluiten: Voeg zuivere hars toe aan een geschikte silicagel insluittank en plaats de monsters voorzichtig om bellen te voorkomen. Polymeriseer de hars in een droogoven bij 60 °C gedurende 48 uur.</li>
	<li>Snijd de monsters continu in 5 μm dikke secties met een roterende microtome. Bewaar de rest van de monsters met droogmiddel bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Plak de secties met een pincet in een druppel van 75% alcohol. Monteer de secties met afdeklips met neutrale balsem. Leg rode en groene fluorescentielabels vast met een fluorescentiemicroscoop.</li>
	<li>Meet de breedte tussen twee labellijnen (Ir.L.Wi), enkel gelabelde trabeculaire omtrek (sL.Pm), dubbel gelabelde trabeculaire omtrek (dL.Pm) en totale trabeculaire omtrek (Tb.Pm). Bereken de minerale appositiesnelheid (MAR) en botvormingssnelheid (BFR/BS). MAR = Ir.L.Wi/intervaldagen. BFR/BS= (dL.Pm±sL.Pm/2)*MAR/Tb.Pm*100 %.</li>
</ol>

<ol><li>Zaidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+remodeling+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Skeletal remodeling in health and disease.</a> Nature Medicine. 13 (7), 791-801 (2007).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Cummings, S. R., Melton, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+and+outcomes+of+osteoporotic+fractures%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Epidemiology and outcomes of osteoporotic fractures.</a> Lancet. 359 (9319), 1761-1767 (2002).</li>
<li>Black, D. M., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Practice.+Postmenopausal+Osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clinical Practice. Postmenopausal Osteoporosis.</a> New England Journal of Medicine. 374 (3), 254-262 (2016).</li>
<li>Kos, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre%2FloxP+system+for+generating+tissue-specific+knockout+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+reviews%22%5BJournal%5D)">Cre/loxP system for generating tissue-specific knockout mouse models.</a> Nutrition reviews. 62 (6), Pt 1 243-246 (2004).</li>
<li>Elefteriou, F., Yang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mouse+models+for+bone+studies-Strengths+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Genetic mouse models for bone studies-Strengths and limitations.</a> Bone. 49 (6), 1242-1254 (2011).</li>
<li>Hirano, T., Ishihara, K., Hibi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+STAT3+in+mediating+the+cell+growth%2C+differentiation+and+survival+signals+relayed+through+the+IL-6+family+of+cytokine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Roles of STAT3 in mediating the cell growth, differentiation and survival signals relayed through the IL-6 family of cytokine receptors.</a> Oncogene. 19 (21), 2548-2556 (2000).</li>
<li>Yu, H., Lee, H., Herrmann, A., Buettner, R., Jove, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+STAT3+signalling+in+cancer%3A+new+and+unexpected+biological+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Revisiting STAT3 signalling in cancer: new and unexpected biological functions.</a> Nature Reviews Cancer. 14 (11), 736-746 (2014).</li>
<li>Itoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+interleukin-6+family-mediated+Stat3+activation+in+osteoblast+differentiation+and+bone+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">A critical role for interleukin-6 family-mediated Stat3 activation in osteoblast differentiation and bone formation.</a> Bone. 39 (3), 505-512 (2006).</li>
<li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblast%2Fosteocyte-specific+inactivation+of+Stat3+decreases+load-driven+bone+formation+and+accumulates+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Osteoblast/osteocyte-specific inactivation of Stat3 decreases load-driven bone formation and accumulates reactive oxygen species.</a> Bone. 49 (3), 404-411 (2011).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+controls+osteoclast+differentiation+and+bone+homeostasis+by+regulating+NFATc1+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">STAT3 controls osteoclast differentiation and bone homeostasis by regulating NFATc1 transcription.</a> Journal of Biological Chemistry. 294 (42), 15395-15407 (2019).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+prevents+bone+loss+via+estrogen+receptor+alpha+and+induction+of+Fas+ligand+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts.</a> Cell. 130 (5), 811-823 (2007).</li>
<li>Kim, H., Kim, M., Im, S. K., Fang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Cre-LoxP+system%3A+general+principles+to+determine+tissue-specific+roles+of+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animal+research%22%5BJournal%5D)">Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes.</a> Laboratory animal research. 34 (4), 147-159 (2018).</li>
<li>Minkin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+acid+phosphatase%3A+tartrate-resistant+acid+phosphatase+as+a+marker+of+osteoclast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Bone acid phosphatase: tartrate-resistant acid phosphatase as a marker of osteoclast function.</a> Calcified Tissue International. 34 (3), 285-290 (1982).</li>
<li>Vaaraniemi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+machinery+for+matrix+degradation+in+bone-resorbing+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 19 (9), 1432-1440 (2004).</li>
<li>Ljusberg, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+excision+of+a+repressive+loop+domain+in+tartrate-resistant+acid+phosphatase+by+cathepsin+K+in+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Proteolytic excision of a repressive loop domain in tartrate-resistant acid phosphatase by cathepsin K in osteoclasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28370-28381 (2005).</li>
<li>Janckila, A. J., Takahashi, K., Sun, S. Z., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naphthol-ASBI+phosphate+as+a+preferred+substrate+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Naphthol-ASBI phosphate as a preferred substrate for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 16 (4), 788-793 (2001).</li>
<li>Janckila, A. J., Li, C. Y., Lam, K. W., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochemistry+of+tartrate-resistant+acid+phosphatase.+Technical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The cytochemistry of tartrate-resistant acid phosphatase. Technical considerations.</a> American Journal of Clinical Pathology. 70 (1), 45-55 (1978).</li>
<li>Janckila, A. J., Simons, R. M., Yam, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+immunoassay+for+tartrate-resistant+acid+phosphatase+isoform+5b+using+the+fluorogenic+substrate+naphthol+ASBI-phosphate+and+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%3A+International+Journal+of+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Alternative immunoassay for tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b using the fluorogenic substrate naphthol ASBI-phosphate and heparin.</a> Clinica Chimica Acta: International Journal of Clinical Chemistry. 347 (1-2), 157-167 (2004).</li>
<li>Janckila, A. J., Yam, L. T., Li, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoalkaline+phosphatase+cytochemistry.+Technical+considerations+of+endogenous+phosphatase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunoalkaline phosphatase cytochemistry. Technical considerations of endogenous phosphatase activity.</a> American Journal of Clinical Pathology. 84 (4), 476-480 (1985).</li>
<li>Solberg, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tartrate-resistant+Acid+phosphatase+expression+in+osteoblasts+and+osteocytes+in+experimental+osteoporosis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Increased tartrate-resistant Acid phosphatase expression in osteoblasts and osteocytes in experimental osteoporosis in rats.</a> Calcified Tissue International. 94 (5), 510-521 (2014).</li>
<li>Tambutté, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcein+labelling+and+electrophysiology%3A+insights+on+coral+tissue+permeability+and+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Calcein labelling and electrophysiology: insights on coral tissue permeability and calcification.</a> Proceedings. Biological Sciences. 279 (1726), 19-27 (2012).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lkb1+deletion+in+periosteal+mesenchymal+progenitors+induces+osteogenic+tumors+through+mTORC1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Lkb1 deletion in periosteal mesenchymal progenitors induces osteogenic tumors through mTORC1 activation.</a> Journal of Clinical Investigation. 130 (5), 1895-1909 (2019).</li>
<li>Dai, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR%2FRaptor+signaling+is+critical+for+skeletogenesis+in+mice+through+the+regulation+of+Runx2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">mTOR/Raptor signaling is critical for skeletogenesis in mice through the regulation of Runx2 expression.</a> Cell Death and Differentiation. 24 (11), 1886-1899 (2017).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+demethylase+LSD1+regulates+bone+mass+by+controlling+WNT7B+and+BMP2+signaling+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Research%22%5BJournal%5D)">Histone demethylase LSD1 regulates bone mass by controlling WNT7B and BMP2 signaling in osteoblasts.</a> Bone Research. 6, 14(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Genetisch gemanipuleerde muismodellen worden vaak gebruikt voor het bestuderen van het mechanisme en de farmaceutische behandeling van menselijke ziekten13. Ctsk-Cre muizen zijn veel gebruikt voor functionele studies van osteoclasten6. De huidige studie beschreef de protocollen van de methoden om skeletfenotype te analyseren en de kritische genen te bestuderen die de osteoclastische activiteit in vivo controleren.
Histologische analyse i...

Skeletbot is het belangrijkste dragende orgaan van het menselijk lichaam en staat onder druk van zowel de interne als externe omgeving tijdens het lopen en sporten1. Gedurende iemands hele leven ondergaan botten voortdurend zelfvernieuwing, die wordt gecompenseerd door osteoblasten en osteoclasten. Het proces van osteoclasten die oude botten en osteoblasten die nieuw bot vormen, zuivert de homeostase en mechanische functie van het skeletsysteem2. Verstoring van het evenwicht kan botmetabole ziekten veroorzaken, zoals osteoporose. Osteoporose, die wordt veroorzaakt door overmatige osteoclastische activiteit, komt wereldwijd voor en veroorzaakt aanzienlijke economische verliezen voor de samenleving2,3,4. Volgens het beperkte aantal geneesmiddelen dat beschikbaar is voor osteoporosebehandeling en hun risico op bijwerkingen4, is het belangrijk om de details van osteoclastenvorming en -activiteit te onthullen.
Osteoclasten afgeleid van de monocyt/macrofaag hematopoietische afstamming hebben meerdere kernen (kunnen 2 tot 50 kernen hebben) en zijn groot (meestal groter dan 100 μm in diameter)2. Hoewel de exploratie van mechanismen en de screening van geneesmiddelen op osteoclastische aandoeningen sterk zijn verbeterd via in vitro osteoclastencultuur, maken de gecompliceerde organische reacties in vivo bewijs onmisbaar voor de gerichte therapie. Vanwege genetische en pathofysiologische overeenkomsten tussen muizen en mensen worden genetisch gemanipuleerde muismodellen vaak gebruikt voor het bestuderen van de mechanismen en de farmaceutische behandelingen van menselijke ziekten in vivo6. Het Cre-loxP-systeem is een veelgebruikte technologie voor het bewerken van muisgen en heeft onderzoekers in staat gesteld om genfuncties op een weefsel-/celspecifieke manier te onderzoeken5. Cathepsine K (CSTK) is een cysteïne protease uitgescheiden door osteoclasten die botcollageen kunnen afbreken8. Het is algemeen aanvaard dat CTSK selectief wordt uitgedrukt in volwassen osteoclasten; daarom worden Ctsk-Cre muizen beschouwd als een nuttig hulpmiddel voor functionele studies van osteoclasten en is gebruikt6.
De signaaltransducer en activator van transcriptie (STAT) familie is klassiek en zeer significant in immuniteit en kankerprogressie en ontwikkeling7,8. Van de zeven STATs is STAT3 naar verluidt het meest relevant voor bothomeostase9,10. Verschillende in vivo studies hebben gemeld dat specifieke inactivatie van STAT3 in osteoblasten de botvorming vermindert9,10. Niettemin is solide bewijs met betrekking tot de deelname van STAT3 aan osteoclastenvorming en botmetabolisme in vivo nog steeds beperkt. Onlangs hebben we in vivo bewijs geleverd met een osteoclastenspecifiek Stat3-deletiemuismodel (Stat3fl/fl; Ctsk-Cre, hierna Stat3Ctskgenoemd) dat STAT3 deelneemt aan osteoclastendifferentiatie en botmetabolisme11. In deze studie beschrijven we de methoden en protocollen die we gebruikten om de veranderingen in botmassa, bot histomorfologie en bot anabolisme en katabolisme van de Stat3Ctsk muizen te analyseren om de invloed van osteoclasten-specifieke STAT3 deletie op bothomeostase te bestuderen.

```html
<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyde oplossing</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td>E672002</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td>80000360</td><td></td></tr><tr><td>Alizarine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniak oplossing</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Ctsk-Cre muizen</td><td></td><td></td><td>een geschenk van S. Kato, Universiteit van Tokyo, Tokyo, Japan</td></tr><tr><td>DDSA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13710</td><td></td></tr><tr><td>DeCa RapidlyDecalcifier</td><td>Pro-Cure</td><td>DX1100</td><td></td></tr><tr><td>DMP-30</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 RESIN</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>fluorescentiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxyline oplossing</td><td>Beyotime Biotechanology</td><td>C0107</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>Scanco Medical AG</td><td>&mu;CT 80</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td>10018918</td><td></td></tr><tr><td>Neutrale balsem</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td>E675007</td><td></td></tr><tr><td>NMA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19000</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Sangon biotech Co., Ltd.</td><td>A601889</td><td></td></tr><tr><td>roterende microtoom</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Stat3fl/fl muizen</td><td>GemPharmatech Co., Ltd</td><td>D000527</td><td></td></tr><tr><td>TRAP kleuringskit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A</td><td></td></tr><tr><td>XYleen</td><td>Shanghai Experimental Reagent Co., Ltd.</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>
```

skelet fenotype analyse van een voorwaardelijke stat3 verwijdering muismodel

Skeletal Phenotype Analysis of a Conditional Stat3 Deletion Mouse Model

Transgene muismodellen zijn krachtig voor het begrijpen van de kritische genen die osteoclastendifferentiatie en -activiteit beheersen, en voor het bestuderen van mechanismen en farmaceutische behandelingen van osteoporose. Cathepsine K (Ctsk)-Cre muizen zijn veel gebruikt voor functionele studies van osteoclasten. De signaaltransducer en activator van transcriptie 3 (STAT3) is relevant bij bothomeostase, maar de rol ervan bij osteoclasten in vivo blijft slecht gedefinieerd. Om het in vivo bewijs te leveren dat STAT3 deelneemt aan osteoclastendifferentiatie en botmetabolisme, hebben we een osteoclastenspecifiek Stat3-deletiemuismodel gegenereerd (Stat3 fl/fl ; Ctsk-Cre) en analyseerde zijn skeletfenotype. Micro-CT-scanning en 3D-reconstructie impliceerden een verhoogde botmassa bij de voorwaardelijke knock-outmuizen. H&E-kleuring, calceïne en alizarine rode dubbele kleuring en tartraatresistente zuurfosfatase (TRAP) kleuring werden uitgevoerd om het botmetabolisme te detecteren. Kortom, dit protocol beschrijft enkele canonieke methoden en technieken om skeletfenotype te analyseren en de kritische genen te bestuderen die de osteoclastenactiviteit in vivo controleren.

Met behulp van dit protocol werden osteoclastenspecifieke Stat3-deletiemuizen gegenereerd om de invloed van STAT3-deletie op osteoclastendifferentiatie te bestuderen. Stat3Ctsk muizen en hun wildtype (WT) nestgenoten werden gefokt en gehouden na genotypering. Beenmergmafagen werden geïsoleerd en gekweekt tot osteoclasten, en STAT3-deletie bij Stat3Ctsk-muizen werd aangetoond (figuur 1).
Femora-rec...

Dit protocol beschrijft een canonieke methode om de kritische genen te begrijpen die de osteoclastenactiviteit in vivo controleren. Deze methode maakt gebruik van een transgeen muismodel en enkele canonieke technieken om skeletfenotype te analyseren.

Skelet fenotype analyse van een voorwaardelijke Stat3 verwijdering muismodel

Transgenic mouse models are powerful for understanding the critical genes controlling osteoclast differentiation and activity, and for studying mechanisms ...

Genomisch gemanipuleerde muismodellen zijn krachtige instrumenten voor het bestuderen van de mechanismen van menselijke ziekten in vivo. Het analyseren van het skelettenfenotype van muizen is de basis van skelettenonderzoek. Dit artikel beschrijft enkele typische technieken voor het analyseren van het skelettenfenotype die interessant kunnen zijn voor degenen die nieuw zijn in skelettenweefselonderzoek.Bij het uitvoeren van dit artikel moet u er rekening mee houden dat dierproeven tijd kosten, dus verzamel zoveel mogelijk hoogwaardige monsters tijdens elk experiment, zelfs als u ze op korte termijn niet nodig heeft. Begin door een geëuthanasieerde muis in rugligging te plaatsen en voorzichtig de bilaterale heupgewrichten met de hand te disloceren. Gebruik een oftalmische schaar om de huid vanaf de distale tibia verticaal af te snijden en verwijder vervolgens alle huid van de achterpoot.Snijd het gewrichtsband van de rechterheup- en kniegewrichten af met een schaar om de achterpoot te scheiden. Snijd vervolgens het bot aan beide uiteinden af om het bot volledig in 4% PFA te onderdompelen. Snijd de trochanter en de verbinding van het scheenbeen.Onderdompel de achterpoot in 4% PFA en bewaar de rechterachterpoot voor paraffine-sectiebereiding. Snijd de gewrichtsbanden van de linkerheup en kniegewrichten met een schaar door en verwijder voorzichtig het zachte weefsel. Scheid het scheenbeen en het dijbeen en dompel ze afzonderlijk onder in 75% ethanol.Bewaar de dijbeenderen voor micro CT-scans en de scheenbeenderen voor calcein en alizarin rood dubbellabeling. Om de paraffine-secties voor te bereiden, was de gefixeerde rechterachterpoot voorzichtig drie keer met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Decalcifiseer het vervolgens in 15% EDTA met een ultrasone decalcifier gedurende drie tot vier weken totdat de botten gebogen kunnen worden, en vervang de decalcificatievloeistof om de andere dag.Na decalcificatie, was de monsters drie keer met PBS en onderdompel ze in 75% ethanol bij vier graden Celsius overnacht. Op de tweede dag, dompel de monsters achtereenvolgens gedurende een uur in 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen. Onderdompel de monsters in half xyleen en half paraffine gedurende 30 minuten, vervolgens in paraffine bij 65 graden Celsius overnacht.Om het specimen in te bedden, dompel het onder in paraffine en plaats het dijbeen en scheenbeen in een hoek van 90 graden. Wanneer de paraffine volledig is afgekoeld, verwijdert u de monsters uit de inbeddingstank. Nummer ze en bewaar ze een nacht lang bij min 20 graden Celsius.Bakken de paraffine-secties gedurende 30 minuten bij 65 graden Celsius, vervolgens ontwassen ze door ze 10 minuten in xyleen te onderdompelen. Onderdompel de secties drie keer in vers xyleen. Hydrateer de secties door ze achtereenvolgens gedurende vijf minuten in 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en gedistilleerd water te onderdompelen.Bereid de kleuroplossing voor met behulp van de TRAP-kleuringskit en warm deze op tot 37 graden Celsius. Voeg 50 tot 100 microliter kleuroplossing toe aan elke sectie en incubeer ze in een vochtige kamer bij 37 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten. Controleer de kleurstatus van de osteoclasten elke vijf minuten onder een lichtmicroscoop totdat rode multinucleaire osteoclasten zichtbaar zijn.Beëindig vervolgens de reactie met water. Tegenkleuren de secties gedurende 30 seconden in hematoxine-oplossing en creëer een stabiele blauwe kleur door ze een minuut in 1% ammoniakoplossing te onderdompelen. Spoel ze vervolgens af onder langzaam stromend kraanwater.Monteer de secties met deksels met neutraal balsem en laat ze een nacht lang drogen. Leg drie tot vijf gezichtsvelden vast met een microscoop en analyseer de trabeculair omtrek met Image J. Gebruik de rechte lijntool om de lengte van de schaalstaaf als L1 te meten. Gebruik vervolgens de gesegmenteerde lijntool om de lengte van de trabeculair omtrek als L2 te meten. Bereken de fysieke lengte en tel het aantal TRAP-positieve cellen met meer dan drie kernen. Na fixatie, was de scheenbeenderen voorzichtig drie keer met PBS en dompel de monsters achtereenvolgens vijf minuten lang in 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen.Onderdompel de monsters gedurende 12 uur in aceton en twee uur in half aceton en half hars, en in pure hars in een droogkast overnacht. Voeg pure hars toe aan een geschikte silicagel-inbeddingstank en plaats de monsters in de tank, luchtbellen vermijdend. Polymeriseer de hars in een droogkast bij 60 graden Celsius gedurende 48 uur.Snijd de monsters continu in vijf micrometer dikke secties met een rotatiemicrotoom en bewaar de rest van de monsters met droogmiddel bij kamertemperatuur. Hecht de secties met pincetten in een druppel 75% ethanol en monteer ze met deksels met behulp van neutraal balsem. Leg de rode en groene fluorescentielabeling vast met een fluorescentiemicroscoop.Osteoclasten-specifieke Stat3-deletiemuizen werden gegenereerd om de invloed van Stat3-deletie op osteoclastdifferentiatie te bestuderen. Femorale reconstructie en kwantitatieve analyse door micro CT gaven aan dat de botmassa van de Stat3 Ctsk-muizen verhoogd was in vergelijking met wild-type muizen. Histo morfologie van de dijbeenderen van wild-type en Stat3 Ctsk-muizen werd onderzocht via H en E-kleuring.Osteoclastogene activiteit werd gedetecteerd met behulp van TRAP-kleuring. Osteoclasts zijn grote TRAP-positieve cellen met meerdere kernen. Het aantal TRAP-positieve osteoclasten was lager in Stat3 Ctsk-muizen vergeleken met wild-type muizen, wat aangeeft dat Stat3-deficiëntie de osteoclastformatie belemmerde.Osteogenese werd gemeten met calcein en alizarin rood dubbellabeling. Het gebied tussen de calcein en de alizarin rood fluorescentie vertegenwoordigt nieuw gevormd bot. De verwijderde Stat3 in osteoclasten had geen invloed op bot anabolisme.Sagittale paraffine-secties waarin het kraakbeen later symmetrisch was en die een duidelijke M-vormige lijn

skeletal-phenotype-analysis-conditional-stat3-deletion-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

Open veld activiteit niveaus worden gebruikt om de locomotief en gedragsmatige activiteit beoordelen. Dit protocol voorziet in een goed ontworpen, gestandaardiseerd protocol te gebruiken in preklinische studies voor neuromusculaire aandoeningen.

Gedrags-en bewegingsapparaat metingen met behulp van een open veld Activity Monitoring Systeem voor Skeletal Muscle Ziekten

Experimentele validatie van enhancer-activiteit wordt het beste benaderd door middel van functieverliesanalyse. Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd dat CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie gebruikt om allelspecifieke regulatie van genregulatie in F1 ES-cellen te bestuderen die een hybride genoom bevatten (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie

Eiwitten vaak meerdere domeinen die verschillende cellulaire functies kunnen uitoefenen. Gene knock-outs (KO) beschouw dit niet als functionele diversiteit. Hier melden wij een recombinatie-gemedieerde cassette uitwisseling (RMCE) gebaseerde structuur-functie benadering KO embryonale stamcellen waarmee de moleculaire dissectie van verschillende functionele domeinen of varianten van een eiwit.

Structuur-functie studies in muis embryonale stamcellen gebruiken recombinase-gemedieerde cassette uitwisseling

Het doel van dit protocol is te wijzigen van de doordringendheid van dodelijke skelet mutant fenotypen in zebrafish door selectief fokken. Dodelijke mutanten naar volwassenheid kunnen niet worden gekweekt en zelf gefokt, dus dit protocol beschrijft een methode voor het bijhouden en selecteren doordringendheid door meerdere generaties nakomelingen testen.

Zebravis dodelijke skelet Mutant doordringendheid verschuiven door nakomelingen testen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om eiwit niveaus te detecteren en te kwantificeren tijdens craniofaciale morfogenese/pathogenese door immunokleuring met behulp van muis craniofaciale weefsels als voorbeeld. Daarnaast beschrijven we een methode voor het bereiden en cryosnijden van onverdecalcificeerde harde weefsels van jonge muizen voor immunokleuring.

Weefsel voorbereiding en immunokleuring van muis craniofaciale weefsels en Ondecalcificeerd bot

Footprint Analysis is een voordelig alternatief voor gedigitaliseerde gang analyseprogramma's voor onderzoekers die bewegings afwijkingen bij muizen kwantificeren. Door zijn snelheid, eenvoud en longitudinale potentiaal is het ideaal voor het gedragsfenotypen van Muismodellen.

Voordelige Gait-analyse voor Gedragsfenotypen van Muismodellen van neuromusculaire ziekte

Hier stellen we een methode voor om efficiënt te verkrijgen enkele spiervezels in de vroege postnatale ontwikkelingsstadia van homozygoot mutant Lamin Δ8-11 muis model, een zeer ernstig model voor Emery-Dreifuss spierdystrofie (EDMD).

Single Myofiber isolatie en cultuur van een Murine Model van Emery-Dreifuss Spierdystrofie in de vroege post-natale ontwikkeling

Hier beschrijven we computationele hulpmiddelen en methoden die visualisatie en analyse van drie- en vierdimensionale beeldgegevens van muizenembryo's mogelijk maken in de context van axiale elongatie en segmentatie, verkregen door into optische projectietomografie en door live beeldvorming en whole-mount immunofluorescentiekleuring met behulp van multifotonenmicroscopie.

Drie- en vierdimensionale visualisatie- en analysebenaderingen om gewervelde axiale rek en segmentatie te bestuderen

Deze studie biedt een protocol voor het gebruik van induceerbare osteoblast-lijnspecifieke  Stat3-knock-outmuizen om botremodellering onder orthodontische kracht te bestuderen en beschrijft methoden voor het analyseren van alveolaire botremodellering tijdens orthodontische tandbeweging, waardoor licht wordt geworpen op de mechanische biologie van het skelet.

Gebruik van induceerbare osteoblastische afstammingsspecifieke Stat3 knock-outmuizen om alveolaire botremodellering te bestuderen tijdens orthodontische tandbeweging

Hier beschrijven we in detail een methode, die is gebaseerd op microcomputertomografie, om 3D-modellen van craniomaxillofaciale botten bij muizen te segmenteren en te meten, voor een betere beoordeling van de craniomaxillofaciale botontwikkeling bij muizen dan wat mogelijk is met de huidige methoden.

Analyse van craniomaxillofaciale misvormingen bij muizen met behulp van driedimensionale microcomputertomografie

Leer skelet fenotype analyse met TRAP kleuring, micro-CT en dubbele fluorescentie labeling in Stat3 Ctsk muismodellen. Deze methoden helpen onderzoekers osteoclast differentiatie en botmassa regulatie bestuderen.

Skelet fenotype analyse van een voorwaardelijke Stat3 verwijdering muismodel

Meer video's verkennen