Skelet fenotype analyse van een voorwaardelijke Stat3 verwijdering muismodel

Genomisch gemanipuleerde muismodellen zijn krachtige instrumenten voor het bestuderen van de mechanismen van menselijke ziekten in vivo. Het analyseren van het skelettenfenotype van muizen is de basis van skelettenonderzoek. Dit artikel beschrijft enkele typische technieken voor het analyseren van het skelettenfenotype die interessant kunnen zijn voor degenen die nieuw zijn in skelettenweefselonderzoek.

Bij het uitvoeren van dit artikel moet u er rekening mee houden dat dierproeven tijd kosten, dus verzamel zoveel mogelijk hoogwaardige monsters tijdens elk experiment, zelfs als u ze op korte termijn niet nodig heeft. Begin door een geëuthanasieerde muis in rugligging te plaatsen en voorzichtig de bilaterale heupgewrichten met de hand te disloceren. Gebruik een oftalmische schaar om de huid vanaf de distale tibia verticaal af te snijden en verwijder vervolgens alle huid van de achterpoot.

Snijd het gewrichtsband van de rechterheup- en kniegewrichten af met een schaar om de achterpoot te scheiden. Snijd vervolgens het bot aan beide uiteinden af om het bot volledig in 4% PFA te onderdompelen. Snijd de trochanter en de verbinding van het scheenbeen.

Onderdompel de achterpoot in 4% PFA en bewaar de rechterachterpoot voor paraffine-sectiebereiding. Snijd de gewrichtsbanden van de linkerheup en kniegewrichten met een schaar door en verwijder voorzichtig het zachte weefsel. Scheid het scheenbeen en het dijbeen en dompel ze afzonderlijk onder in 75% ethanol.

Bewaar de dijbeenderen voor micro CT-scans en de scheenbeenderen voor calcein en alizarin rood dubbellabeling. Om de paraffine-secties voor te bereiden, was de gefixeerde rechterachterpoot voorzichtig drie keer met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Decalcifiseer het vervolgens in 15% EDTA met een ultrasone decalcifier gedurende drie tot vier weken totdat de botten gebogen kunnen worden, en vervang de decalcificatievloeistof om de andere dag.

Na decalcificatie, was de monsters drie keer met PBS en onderdompel ze in 75% ethanol bij vier graden Celsius overnacht. Op de tweede dag, dompel de monsters achtereenvolgens gedurende een uur in 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen. Onderdompel de monsters in half xyleen en half paraffine gedurende 30 minuten, vervolgens in paraffine bij 65 graden Celsius overnacht.

Om het specimen in te bedden, dompel het onder in paraffine en plaats het dijbeen en scheenbeen in een hoek van 90 graden. Wanneer de paraffine volledig is afgekoeld, verwijdert u de monsters uit de inbeddingstank. Nummer ze en bewaar ze een nacht lang bij min 20 graden Celsius.

Bakken de paraffine-secties gedurende 30 minuten bij 65 graden Celsius, vervolgens ontwassen ze door ze 10 minuten in xyleen te onderdompelen. Onderdompel de secties drie keer in vers xyleen. Hydrateer de secties door ze achtereenvolgens gedurende vijf minuten in 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en gedistilleerd water te onderdompelen.

Bereid de kleuroplossing voor met behulp van de TRAP-kleuringskit en warm deze op tot 37 graden Celsius. Voeg 50 tot 100 microliter kleuroplossing toe aan elke sectie en incubeer ze in een vochtige kamer bij 37 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten. Controleer de kleurstatus van de osteoclasten elke vijf minuten onder een lichtmicroscoop totdat rode multinucleaire osteoclasten zichtbaar zijn.

Beëindig vervolgens de reactie met water. Tegenkleuren de secties gedurende 30 seconden in hematoxine-oplossing en creëer een stabiele blauwe kleur door ze een minuut in 1% ammoniakoplossing te onderdompelen. Spoel ze vervolgens af onder langzaam stromend kraanwater.

Monteer de secties met deksels met neutraal balsem en laat ze een nacht lang drogen. Leg drie tot vijf gezichtsvelden vast met een microscoop en analyseer de trabeculair omtrek met Image J. Gebruik de rechte lijntool om de lengte van de schaalstaaf als L1 te meten. Gebruik vervolgens de gesegmenteerde lijntool om de lengte van de trabeculair omtrek als L2 te meten. Bereken de fysieke lengte en tel het aantal TRAP-positieve cellen met meer dan drie kernen. Na fixatie, was de scheenbeenderen voorzichtig drie keer met PBS en dompel de monsters achtereenvolgens vijf minuten lang in 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen.

Onderdompel de monsters gedurende 12 uur in aceton en twee uur in half aceton en half hars, en in pure hars in een droogkast overnacht. Voeg pure hars toe aan een geschikte silicagel-inbeddingstank en plaats de monsters in de tank, luchtbellen vermijdend. Polymeriseer de hars in een droogkast bij 60 graden Celsius gedurende 48 uur.

Snijd de monsters continu in vijf micrometer dikke secties met een rotatiemicrotoom en bewaar de rest van de monsters met droogmiddel bij kamertemperatuur. Hecht de secties met pincetten in een druppel 75% ethanol en monteer ze met deksels met behulp van neutraal balsem. Leg de rode en groene fluorescentielabeling vast met een fluorescentiemicroscoop.

Osteoclasten-specifieke Stat3-deletiemuizen werden gegenereerd om de invloed van Stat3-deletie op osteoclastdifferentiatie te bestuderen. Femorale reconstructie en kwantitatieve analyse door micro CT gaven aan dat de botmassa van de Stat3 Ctsk-muizen verhoogd was in vergelijking met wild-type muizen. Histo morfologie van de dijbeenderen van wild-type en Stat3 Ctsk-muizen werd onderzocht via H en E-kleuring.

Osteoclastogene activiteit werd gedetecteerd met behulp van TRAP-kleuring. Osteoclasts zijn grote TRAP-positieve cellen met meerdere kernen. Het aantal TRAP-positieve osteoclasten was lager in Stat3 Ctsk-muizen vergeleken met wild-type muizen, wat aangeeft dat Stat3-deficiëntie de osteoclastformatie belemmerde.

Osteogenese werd gemeten met calcein en alizarin rood dubbellabeling. Het gebied tussen de calcein en de alizarin rood fluorescentie vertegenwoordigt nieuw gevormd bot. De verwijderde Stat3 in osteoclasten had geen invloed op bot anabolisme.

Sagittale paraffine-secties waarin het kraakbeen later symmetrisch was en die een duidelijke M-vormige lijn