Skelet fenotype analyse van een voorwaardelijke Stat3 verwijdering muismodel
July 3rd, 2020
Dit protocol beschrijft een canonieke methode om de kritische genen te begrijpen die de osteoclastenactiviteit in vivo controleren. Deze methode maakt gebruik van een transgeen muismodel en enkele canonieke technieken om skeletfenotype te analyseren.
Genomisch gemanipuleerde muismodellen zijn krachtige instrumenten voor het bestuderen van de mechanismen van menselijke ziekten in vivo. Het analyseren van het skelettenfenotype van muizen is de basis van skelettenonderzoek. Dit artikel beschrijft enkele typische technieken voor het analyseren van het skelettenfenotype die interessant kunnen zijn voor degenen die nieuw zijn in skelettenweefselonderzoek.
Bij het uitvoeren van dit artikel moet u er rekening mee houden dat dierproeven tijd kosten, dus verzamel zoveel mogelijk hoogwaardige monsters tijdens elk experiment, zelfs als u ze op korte termijn niet nodig heeft. Begin door een geëuthanasieerde muis in rugligging te plaatsen en voorzichtig de bilaterale heupgewrichten met de hand te disloceren. Gebruik een oftalmische schaar om de huid vanaf de distale tibia verticaal af te snijden en verwijder vervolgens alle huid van de achterpoot.
Snijd het gewrichtsband van de rechterheup- en kniegewrichten af met een schaar om de achterpoot te scheiden. Snijd vervolgens het bot aan beide uiteinden af om het bot volledig in 4% PFA te onderdompelen. Snijd de trochanter en de verbinding van het scheenbeen.
Onderdompel de achterpoot in 4% PFA en bewaar de rechterachterpoot voor paraffine-sectiebereiding. Snijd de gewrichtsbanden van de linkerheup en kniegewrichten met een schaar door en verwijder voorzichtig het zachte weefsel. Scheid het scheenbeen en het dijbeen en dompel ze afzonderlijk onder in 75% ethanol.
Bewaar de dijbeenderen voor micro CT-scans en de scheenbeenderen voor calcein en alizarin rood dubbellabeling. Om de paraffine-secties voor te bereiden, was de gefixeerde rechterachterpoot voorzichtig drie keer met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Decalcifiseer het vervolgens in 15% EDTA met een ultrasone decalcifier gedurende drie tot vier weken totdat de botten gebogen kunnen worden, en vervang de decalcificatievloeistof om de andere dag.
Na decalcificatie, was de monsters drie keer met PBS en onderdompel ze in 75% ethanol bij vier graden Celsius overnacht. Op de tweede dag, dompel de monsters achtereenvolgens gedurende een uur in 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen. Onderdompel de monsters in half xyleen en half paraffine gedurende 30 minuten, vervolgens in paraffine bij 65 graden Celsius overnacht.
Om het specimen in te bedden, dompel het onder in paraffine en plaats het dijbeen en scheenbeen in een hoek van 90 graden. Wanneer de paraffine volledig is afgekoeld, verwijdert u de monsters uit de inbeddingstank. Nummer ze en bewaar ze een nacht lang bij min 20 graden Celsius.
Bakken de paraffine-secties gedurende 30 minuten bij 65 graden Celsius, vervolgens ontwassen ze door ze 10 minuten in xyleen te onderdompelen. Onderdompel de secties drie keer in vers xyleen. Hydrateer de secties door ze achtereenvolgens gedurende vijf minuten in 100% ethanol, 95% ethanol, 70% ethanol en gedistilleerd water te onderdompelen.
Bereid de kleuroplossing voor met behulp van de TRAP-kleuringskit en warm deze op tot 37 graden Celsius. Voeg 50 tot 100 microliter kleuroplossing toe aan elke sectie en incubeer ze in een vochtige kamer bij 37 graden Celsius gedurende 20 tot 30 minuten. Controleer de kleurstatus van de osteoclasten elke vijf minuten onder een lichtmicroscoop totdat rode multinucleaire osteoclasten zichtbaar zijn.
Beëindig vervolgens de reactie met water. Tegenkleuren de secties gedurende 30 seconden in hematoxine-oplossing en creëer een stabiele blauwe kleur door ze een minuut in 1% ammoniakoplossing te onderdompelen. Spoel ze vervolgens af onder langzaam stromend kraanwater.
Monteer de secties met deksels met neutraal balsem en laat ze een nacht lang drogen. Leg drie tot vijf gezichtsvelden vast met een microscoop en analyseer de trabeculair omtrek met Image J. Gebruik de rechte lijntool om de lengte van de schaalstaaf als L1 te meten. Gebruik vervolgens de gesegmenteerde lijntool om de lengte van de trabeculair omtrek als L2 te meten. Bereken de fysieke lengte en tel het aantal TRAP-positieve cellen met meer dan drie kernen. Na fixatie, was de scheenbeenderen voorzichtig drie keer met PBS en dompel de monsters achtereenvolgens vijf minuten lang in 95% ethanol, 100% ethanol en xyleen.
Onderdompel de monsters gedurende 12 uur in aceton en twee uur in half aceton en half hars, en in pure hars in een droogkast overnacht. Voeg pure hars toe aan een geschikte silicagel-inbeddingstank en plaats de monsters in de tank, luchtbellen vermijdend. Polymeriseer de hars in een droogkast bij 60 graden Celsius gedurende 48 uur.
Snijd de monsters continu in vijf micrometer dikke secties met een rotatiemicrotoom en bewaar de rest van de monsters met droogmiddel bij kamertemperatuur. Hecht de secties met pincetten in een druppel 75% ethanol en monteer ze met deksels met behulp van neutraal balsem. Leg de rode en groene fluorescentielabeling vast met een fluorescentiemicroscoop.
Osteoclasten-specifieke Stat3-deletiemuizen werden gegenereerd om de invloed van Stat3-deletie op osteoclastdifferentiatie te bestuderen. Femorale reconstructie en kwantitatieve analyse door micro CT gaven aan dat de botmassa van de Stat3 Ctsk-muizen verhoogd was in vergelijking met wild-type muizen. Histo morfologie van de dijbeenderen van wild-type en Stat3 Ctsk-muizen werd onderzocht via H en E-kleuring.
Osteoclastogene activiteit werd gedetecteerd met behulp van TRAP-kleuring. Osteoclasts zijn grote TRAP-positieve cellen met meerdere kernen. Het aantal TRAP-positieve osteoclasten was lager in Stat3 Ctsk-muizen vergeleken met wild-type muizen, wat aangeeft dat Stat3-deficiëntie de osteoclastformatie belemmerde.
Osteogenese werd gemeten met calcein en alizarin rood dubbellabeling. Het gebied tussen de calcein en de alizarin rood fluorescentie vertegenwoordigt nieuw gevormd bot. De verwijderde Stat3 in osteoclasten had geen invloed op bot anabolisme.
Sagittale paraffine-secties waarin het kraakbeen later symmetrisch was en die een duidelijke M-vormige lijn
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt de rollen van cruciale genen in osteoclastactiviteit met behulp van genetisch gemodificeerde muismodellen. Het protocol beschrijft technieken voor het analyseren van skelettenfenotypen en benadrukt het belang van hoogwaardige biologische monsters.
Belangrijke onderdelen van de studie
Onderzoeksgebied
- Botbiologie
- Osteoclast differentiatie
- Genetische regulatie van botremodellering
Achtergrond
- Belang van osteoclasten voor de gezondheid van het skelet
- Gebruik van transgene muizen om menselijke ziekten te modelleren
- Noodzaak van rigoureuze experimentele protocollen
Gebruikte methoden
- Skeletanalyse met behulp van verschillende histologische technieken
- Transgene muismodellen (Stat3 Ctsk muizen)
- TRAP-kleuring, micro CT-scannen en dubbele markering voor meting van botvorming
Belangrijkste resultaten
- Stat3-deficiëntie verminderde osteoclastvorming
- Verhoogde botmassa bij Stat3 Ctsk-muizen in vergelijking met wild type
- De studie valideert de rol van het gen in osteoclast differentiatie en suggereert een mechanisme voor regulering van botmassa
Conclusies
- Deze studie toont aan hoe genregulatie het gedrag van osteoclasten en de algehele botgezondheid kan beïnvloeden.
- De bevindingen zijn belangrijk voor therapeutische benaderingen bij ziekten die verband houden met botverlies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding osteoclast-specific gene function enables mechanistic de-risking in bone-targeted therapeutic development. Conditional knockout models provide predictive confidence for target validation by isolating cellular contributions to bone remodeling. This approach supports preclinical assessment of anabolic versus catabolic pathway modulation in osteoporosis drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis regarding STAT3's role in osteoclast differentiation and bone resorption.
- Operational Value: Enables functional target validation through cell-specific genetic ablation in vivo.
- Scientific Value: Supports biological de-risking by linking STAT3 loss to reduced osteoclast formation and increased bone mass.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems (bone tissue) for downstream assay standardization and reproducibility.
- Operational Value: Generates quantitative outputs (TRAP+ cell count, bone area, microCT metrics) for reliable compound evaluation.
- Scientific Value: Facilitates screening readiness through standardized histology and imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates disease-relevant system continuity from genetic target modulation to skeletal phenotype.
- Operational Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by measuring both resorption (TRAP) and formation (calcein/alizarin) endpoints.
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into bone mass regulation via osteoclast-specific pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The method supports discovery biology through hypothesis testing of osteoclast-intrinsic gene function and pathway clarification in bone homeostasis.
- Discovery Biology: Explains how conditional deletion supports hypothesis testing of STAT3 in osteoclasts and biological de-risking of resorption targets.
- Screening: Describes assay readiness via standardized tissue preparation and quantitative histomorphometry for compound screening.
- Analytics: Highlights microCT, TRAP staining, and dual-labeling as quantitative readouts that enable cross-condition comparison of bone phenotype.
- Translational Research: Connects genetic manipulation to preclinical continuity through integrated resorption and formation analysis.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for validating osteoclast-specific targets in bone disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in osteoclast regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of skeletal phenotyping workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in bone therapeutics.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on on-target mechanism validation.
Implementation Considerations
- Required expertise in mouse genetics, bone histology, and microCT analysis.
- Instrumentation needs include microtome, fluorescence and light microscopes, microCT scanner, and decalcification equipment.
- Cross-team standardization requires harmonized staining protocols and imaging analysis between histology and in vivo teams.
- Adaptation considerations across model systems include verifying Cre specificity and compensatory pathways in other osteoclast models.
- Practical limitations include time-intensive decalcification and sectioning, and potential developmental compensation in constitutive models.
