Een preklinisch gecontroleerd corticaal impactmodel voor traumatische bloedingen, kneuzingen en neuro-inflammatie

Dit model kan worden gebruikt om de pathologieën te bestuderen die geassocieerd zijn met de cerebrale contusie, inclusief intracranele bloeding, ijzertoxiciteit, neurondood, axonaal letsel, neurologisch deficit en neurale ontsteking. Het grote voordeel van deze techniek is dat de ernst van de hersenbeschadiging gemakkelijk kan worden gecontroleerd door het manipuleren van de biochemische parameters zoals snelheid en de dood van de impact op het CCI-apparaat. De CCI-geïnduceerde focale corticale verbrijzeling is zeer reproduceerbaar.

Een goede stereotactische techniek en de craniotomieprocedure zijn belangrijke determinanten bij het produceren van stabiele en reproduceerbare CCI-geïnduceerde hersenbeschadiging. Over het algemeen zal de onderzoeker die nieuw is in de procedure worstelen met het stabiliseren van de muis op het stereotactische frame en het maken van de juiste craniotomie. Het demonstreren van de procedure zal Ms. Jhih Shuan Lin zijn, een laboratoriumtechnicus uit mijn lab.

Begin door een gebrek aan teenprikreflex bij het dier te bevestigen om er zeker van te zijn dat het goed is geanesthetiseerd. Scheer het hoofd van de muis met elektrische scheerapparaten in een caudale naar rostrale richting. Maar trim de snorharen niet.

Plaats de muis op het stereotactische frame en steek voorzichtig de oorbeugels in de gehoorgangen, zorg ervoor dat het hoofd van de muis gelijkmatig door beide oorbeugels wordt gestabiliseerd. Houd de anesthesie gedurende de duur van de operatie op één tot 2% isofluraangehalte. Breng vaseline aan op beide ogen om uitdroging tijdens de operatie te voorkomen.

Gebruik vervolgens steriele wattenstaafjes om het geschoren hoofd te desinfecteren met betadine gevolgd door 70% ethanol. Dien 100 microliter 0,25% Bupivacaine subcutaan toe met een 31 gauge insulinenap, en masseer voorzichtig de injectieplaats voor een betere absorptie. Maak een longitudinale incisie langs de middenlijn op de hoofdhuid met een scalpel of schaar.

Gebruik vervolgens een hemostaat om de huid naar de rechterkant te trekken. Laat de blootgestelde schedel een minuut drogen. Reinig vervolgens alle resterende bloed en weefsels op de schedel met een steriele wattenstaafje.

Controleer of het hoofd van het dier horizontaal staat en identificeer de anatomische oriëntatiepunten, Bregma en Lambda, en markeer beide locaties met een potlood. Zorg ervoor dat het hoofd van het dier horizontaal staat in de rostrale-caudale richting door de Z-coördinaten van zowel Bregma als Lambda te meten. Gebruik dezelfde procedure om het hoofd horizontaal te positioneren.

Gebruik een 31 gauge insulinenap om de plaats van de cranectomie te identificeren. Stel de XY-oorsprong in op Bregma en beweeg de naald lateraal drie millimeter naar rechts. Markeer deze positie als de plaats van de cranectomie en teken een cirkel van vier millimeter in diameter op de schedel met een potlood.

Snijd langs de met potlood omlijnde cirkel met een hogesnelheids microboor met de trefinale om een open gat van vier millimeter diameter te maken. Verwijder de botflap met een pincet en bewaar deze in ijskoud, normaal zoutwater. Spoel het gat voorzichtig met zoutoplossing af voordat u druk op het hersenoppervlak uitoefent om het bloeden te stoppen.

Stel op het CCI-apparaat de 2,5 millimeter diameter afgeronde impactortip in op een hoek van 22,5 graden. Stel de impacttip op nul naar het durale oppervlak en stel de impactparameters op de bedieningsbox in op een snelheid van vier meter per seconde en een vervormingsdiepte van twee millimeter. Trek de metalen tip terug.

Laat de zuiger klaarkomen om impact op de hersenen te genereren. Plaats vervolgens een steriele wattenstaafje op het gewonde gebied om het bloeden te stoppen. Plaats de botflap terug en bevestig deze met tandcement.

Sluit de hoofdhuid met weefsellijm. Plaats de muis onder de verwarmingslamp in een schone herstelkooi met beddengoed tot volledig herstel. Een goede stereotactische techniek en cranectomieprocedure zijn belangrijke determinanten bij het produceren van stabiele en reproduceerbare CCI-geïnduceerde hersenbeschadiging.

Een ideale cranectomieprocedure zou minimale histologische schade veroorzaken in de sham-geopereerde hersenen. Veranderingen in hersenbeschadiging en corpus callosumverlies werden waargenomen op dag 1, 3, 7 en 28 na CCI. Bovendien werd eenzijdige hersenatrofie aan de contusiezijde gezien op dag 28 na CCI.

Neuro-ontsteking werd onthuld door Iba1-positieve geactiveerde microglia en macrofaagaccumulatie rond de rand van het contusiegebied. De intraparenchymale bloeding was ook detecteerbaar door de Ly76-positieve kleuring van dag een tot zeven na CCI. Een mengsel van rode bloedcellen met gescheurde en intacte celmorfologie werd waargenomen op dag zeven na CCI, wat suggereert dat de rode bloedcellen in dit stadium zijn gelyseerd.

Dit fenomeen was consistent met de waarneming dat ijzerafzetting detecteerbaar was in het contusiegebied van dag zeven tot 28 na CCI. Geactiveerde microglia en macrofagen werden waargenomen in de striatum ver weg van de contusieplaats van dag drie tot 28 na CCI, wat duidt op corpus callosum en striatale verwondingen. Deze techniek baant de weg voor onderzoekers om verder te onderzoeken naar neuro-ontsteking geïnduceerd door hersenbloeding door het begrijpen van de respons van de immuuncellen, zoals microglia, na hersenbloeding contusie.