In vitro Neuromusculaire Verbinding veroorzaakt uit menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen

Deze menselijke neuromusculaire verbinding inductie systeem kan worden gebruikt om de vorming van pre en post-synaptische componenten, met inbegrip van motorische neuronen, skeletspieren, en Schwann cellen induceren. Niet alleen kan een volwassen, complexe NMJ structuur worden verkregen in een enkele cultuur schotel van een enkele startcel populatie, maar de resulterende NMJ bezit ook de mogelijkheid om contract. Deze methode heeft potentieel voor het bestuderen van neuromusculaire ziekten, zoals spinale musculaire atrofie, en voor therapeutische samengestelde screening.

De gedifferentieerde NMJ is een zeer dik, complex weefsel, en het is moeilijk te visualiseren. Door de procedure aan te tonen, kunnen we lezers instrueren hoe ze specifieke structuren kunnen identificeren. Was de cellen met drie milliliter PBS voordat u een milliliter celloslatingsoplossing toevoegt aan een petrischaaltje.

Voeg na 10 minuten bij 37 graden Celsius drie milliliter primatenembryonal stamcelmedium toe aan elke put en voorzichtig drie keer pipette om de cellen van de coverslips te scheiden. Vervolgens pool de vrijstaande stamcelhoudende supernatants in een conische buis van 50 milliliter voor centrifugatie en zet u de stamcelpellet opnieuw op in drie milliliter verse primaten embryonale stamcelmedium aangevuld met 10 micromolar Y-27632 ROCK-remmer voor het tellen. Verdun vervolgens de cellen tot een twee keer 10 tot de vijf cellen per milliliter medium aangevuld met ROCK-remmerconcentratie en breng twee milliliter cellen terug naar elke coverslip in elke put van de extracellulaire met matrix bedekte zes-putplaat.

Na 24 uur, vervang de supernatant in elke put met twee milliliter van verse primaten embryonale stamcel medium aangevuld met een microgram per milliliter doxycycline en de plaat terug te keren naar de celkweek incubator voor 24 uur. Vervang aan het einde van de incubatie de supernatants door twee milliliter differentiatiemedium aangevuld met doxycycline per put en breng de plaat gedurende 10 dagen terug naar de couveuse van de celkweek. Vervang aan het einde van de incubatie de supernatants door twee milliliter myogene differentiatiemedium aangevuld met doxycycline per put en breng de plaat voor nog eens 10 dagen terug naar de couveuse van de celkweek.

Vervang aan het einde van de incubatie de supernatants door twee milliliter neuromusculair verbindingsmedium per put en breng de plaat 30 dagen terug naar de couveuse van de celkweek. Visualiseer aan het einde van de incubatie de gedifferentieerde neuromusculaire knooppunten door omgekeerde microscopie. Om de myotube contracties te activeren, voeg 25 millimolar calciumchloride toe aan elke put van gedifferentieerde neuromusculaire verbindingscellen.

En binnen een tot twee minuten van de behandeling, plaats de plaat op het podium van een omgekeerde microscoop. Met behulp van live cel microscopie, opnemen van een film van de myotube contractie voor 20 seconden. Voeg aan het einde van de opname 300 nanogram per milliliter curare toe aan het kweekmedium en neem de film nog 20 seconden op voordat u het filmbestand opent in een geschikt softwareprogramma voor bewegingsvectoranalyse voor analyse.

Immunofluorescente kleuring van de neurofilament synaptische bloedvaten en acetylcholine receptoren kunnen worden uitgevoerd om de neuronen te identificeren. Motorneuronen kunnen worden geïdentificeerd door TUJ 1 en Islet 1 kleuring, terwijl post-synaptische myotubes kunnen worden geïdentificeerd door vlekken op myosine zware ketting. Schwann cellen kunnen worden gelabeld met S-100 antilichaam.

In deze scanning elektronenmicroscopie beelden, de morfologie van volwassen neuromusculaire knooppunten kan worden waargenomen met duidelijke visualisatie van de uitgebreide axon terminals, axonen, en spiervezels. Transmissie elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om de volwassen ultrastructuur van de neuromusculaire componenten te visualiseren, met inbegrip van de presynaptische axon terminal met synaptische vikjes en de post-synaptische regio, die wordt gescheiden door de synaptische gespleten. Junctional plooien markeren de kruising tussen het neuron en spiervezels.

Hier worden volwassen axonterminals getoond die synaptische vikjes bevatten. Samen wijzen deze morfologische kenmerken erop dat de neuromusculaire componenten goed geïnduceerd en gerijpt waren. Functionele beoordeling van de cellen blijkt dat prominente neuromusculaire verbinding bewegingssignalen kunnen worden veroorzaakt door calciumchloride en dat deze samentrekkingen kunnen worden onderbroken door curare te bevestigen dat de motorneuron signalen worden overgedragen via de neuromusculaire verbinding om spiercontractie te activeren.

De celzaaidichtheid beïnvloedt de efficiëntie van de NMJ-formatie. Het kan worden aangepast aan het protocol, volgens de experimentele doeleinden. Deze neuromusculaire verbindingscultuur bevat meerdere celtypen, en deze componenten kunnen worden gebruikt om de interacties tussen deze cellen te bestuderen tijdens de ontwikkeling van de neuromusculaire verbinding of in reactie op specifieke ziektepathologieën.