Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

Omdat ATP een belangrijke cellulaire boodschapper is, hebben we een methode ontwikkeld waarmee we ATP-binding aan zijn receptoren met hoge precisie kunnen meten. Met behulp van FRET tussen nucleotidederivaten en fluorescerend gelabelde eiwitten, kunnen we de nucleotidebinding aan intacte functionele receptoren in realtime en met een uitstekende ruimtelijke resolutie volgen. We gebruiken deze methode om de effecten van cellulair metabolisme op het ATP-gevoelige kaliumkanaal te begrijpen, dat betrokken is bij bepaalde vormen van diabetes.

Om een niet-gedekt membraanexperiment op te zetten, gebruikt u eerst een tang om een klein fragment van een afdekslip met getransfecteerde cellen te breken en het fragment af te spoelen met PBS. Als de afdeklaag is voorgecoat met polylysine, plaatst u het fragment op de bodem van een schaal van 35 millimeter met twee milliliter PBS en houdt u een sondesonator van drie millimeter drie tot vijf millimeter boven het monster, pulserend met 50 watt en 20 tot 40% amplitude gedurende 200 tot 500 milliseconden om de cellen los te maken. Als de afdekslip niet is voorgecoat, dompelt u het fragment na het spoelen met PBS gedurende ongeveer 30 seconden in een buis met 0,1% poly-L-lysine voordat u de cellen losmaakt met korte ultrasoonapparaat, zoals gedemonstreerd.

Breng het gesonificeerde fragment over in een overdekte glazen bodem van 35 millimeter schaal met twee milliliter badoplossing en monteer de schaal op een omgekeerde microscoop uitgerust met een hoog numeriek diafragma 60x wateronderdompelingsobjectief. Controleer of de camerapoort van de microscoop is aangesloten op een spectrograaf in serie met een zeer gevoelige CCD-camera en gebruik een peristaltische pomp om de badkamer met buffer te doordrenken met een stroomsnelheid van 0,5 tot één milliliter buffer per minuut. Om niet-gedekte membraanfragmenten te identificeren die het ANAP-gelabelde kanaal tot expressie brengen, bekijkt u het monster om membranen met fluorescerende kanalen te lokaliseren.

Schakel het spectrometermasker gedeeltelijk in tussen de camerapoort op de microscoop en de spectrograaf. De schaduw van het masker verschijnt op het camerabeeld. Verkrijg een helder veld- en fluorescentiebeeld van het niet-overdekte membraan om selectie van het gebied van belang voor analyse mogelijk te maken.

Breng de punt van het microvolumeperfusiesysteem dicht bij het niet-overdekte membraan. Om een beeld van ANAP-fluorescentie te verkrijgen, prikkelt u het membraan met een 385 nanometer LED door een 390/18 nanometer band pass excitatiefilter en een 416 nanometer rand dichroic, waarbij het uitgezonden licht wordt verzameld door een 400 nanometer longpass emissiefilter. Schakel het spectrometermasker in en zorg ervoor dat het uitgestraalde licht wordt doorgelaten.

Lijn het gebied van belang uit met de spleet van het spectrometermasker. Schakel de spectrometerroosters in. Met de roosters op hun plaats wordt het licht dat door de spectrometer wordt verspreid, op de chip van de CCD-camera geprojecteerd om spectrale beelden te produceren.

De beelden behouden ruimtelijke informatie in de Y-dimensie. De X-dimensie wordt vervangen door golflengte. Verkrijg tijdens het perfuseren met een nucleotidevrije bufferoplossing een of meer blootstellingen van 0,1 tot tien seconden voor downstream-correctie en normalisatie van de gegevens die gedurende de rest van het experiment zijn verzameld.

Breng vervolgens een reeks TNP ATP-concentraties in de badoplossing aan om een concentratieresponscurve vast te stellen, waarbij elke oplossing gedurende ten minste één minuut wordt doordrenkt om ervoor te zorgen dat een stabiele toestand wordt bereikt en een blootstelling voor elke concentratie wordt verkregen. Was na elke concentratie de TNP ATP gedurende ten minste één minuut uit met nucleotidevrije badoplossing voordat u een blootstellingsbeeld na de behandeling krijgt. Om een patch-clamp fluorometrie-experiment uit te voeren, trekt u eerst patchpipetten uit dikwandige borosilicaatglascapillairen tot een weerstand van 1,5 tot 2,5 megaohm wanneer ze worden gevuld met pipetoplossing.

Breng vervolgens een afdekslip met getransfecteerde cellen over in een glazen bodemschaal van 35 millimeter met twee milliliter badoplossing en monteer de schaal op de omgekeerde microscoop. Perfuseer de badkamer met badoplossing en identificeer een cel die ANAP-gelabelde kanalen tot expressie brengt. Oefen zachte positieve druk uit op een patchpipet en plaats de pipet in een badkamer.

Druk de pipet tegen het membraan van de cel en zuig zachtjes aan om een gigaohm-afdichting te bereiken. Om de pleister te verwijderen, verplaatst u de pipethouder snel uit de buurt van de gepatchte cel. Breng de punt van de patchpipet dicht bij de punt van het perfusiesysteem en controleer of de pleister zich in de spleet van het spectrometermasker bevindt.

Pas vervolgens TNP ATP toe en verzamel beeldspectra. In deze afbeeldingen kan een typisch niet-geroofd membraanfragment van een HEK293T cel worden waargenomen dat ATP-gevoelige kaliumkanalen tot expressie brengt die zijn gelabeld met oranje fluorescerend eiwit. In deze spectrale afbeelding van ANAP-gelabelde ATP-gevoelige kaliumkanalen in een niet-geroofd membraan van een HEK293T cel blootgesteld aan vijf micromolaire TNP ATP, kunnen twee gebieden van hoge intensiteit worden waargenomen die overeenkomen met de piekemissie van ANAP en TNP ATP.

Een laatste spectrum kan worden verkregen door het gemiddelde achtergrondspectrum af te trekken van het gemiddelde interessegebiedspectrum. Hier kan de vermindering van piek ANAP-fluorescentie na meerdere blootstellingen worden waargenomen. De piekfluorescentie van verschillende blootstellingen in afwezigheid van TNP ATP werd aangepast aan een enkel exponentieel verval.

Deze gegevens werden vervolgens gebruikt om fotobleaching-artefacten te corrigeren. Hier worden representatieve spectrale beelden getoond van een niet-geroofd membraan verkregen uit een cel die ANAP-gelabelde ATP-gevoelige kaliumkanalen tot expressie brengt in afwezigheid en de aanwezigheid van TNP ATP. Het observeren van de gecorrigeerde emissiespectra onthult een duidelijke scheiding tussen de fluorescerende emissie van donor en acceptor.

In deze figuur worden representatieve stromen en spectra getoond van ANAP-gelabelde ATP-gevoelige kaliumkanalen van een typisch patch-clamp fluorometrie-experiment. De emissiespectra worden gecorrigeerd voor achtergrond en bleken, zoals aangetoond voor niet-overdekte membranen. Wees voorzichtig met bedieningselementen om te controleren of het fluorescerende signaal specifiek is voor uw receptor.

Zorg ervoor dat je overvloed snel, efficiënt en compleet is en houd je belichtingen zo kort mogelijk. Deze methode beantwoordt vragen over receptorbezetting en hoe deze zich verhoudt tot functie. Andere FRET-technieken die met een vergelijkbare opstelling worden gebruikt, kunnen ligand-geïnduceerde bevestigingsveranderingen in de receptor onderzoeken.