In vitro en in vivo levering van magnetische nanodeeltjeshyperthermie met behulp van een op maat gemaakt leveringssysteem
2 juli 2020
Dit protocol presenteert technieken en methodologie die nodig zijn voor de nauwkeurige afgifte van magnetische nanodeeltjeshyperthermie met behulp van een geavanceerd leverings- en monitoringsysteem.
Deze methode is belangrijk omdat het de meest robuuste en reproduceerbare manier biedt om magnetische nanodeeltjes hyperthermie behandeling te leveren in preklinische modellen. Deze techniek zorgt voor de nauwkeurige en consistente levering van nanodeeltjes hyperthermie door nauwkeurig te monitoren en te controleren van de lokale omgeving, de fysiologie van het dier en de thermische dosis. Bij het uitvoeren van dit protocol, houd er dan rekening mee dat de verhitting van de nanodeeltjes beperkt moet blijven tot het doelweefsel.
Het is essentieel om overvloedige en geschikte thermometrie te gebruiken om reproduceerbaarheid en veiligheid te waarborgen. 24 uur na het plateren van B16 F10 muis melanomacellen, voeg magnetische nanodeeltjes toe tot een eindconcentratie van drie milligram ion per milliliter. Zorg ervoor dat de nanodeeltjes gelijkmatig verdeeld zijn door vooraf een voorraadoplossing van media en magnetische nanodeeltjes te maken.
48 uur na toevoeging van de nanodeeltjes, voeg 0,5 milliliter trypsine toe aan elke welbewust te behandelen put en zwiep de plaat zachtjes rond. Gebruik een microscoop om te controleren of de cellen loskomen. Voeg vervolgens één milliliter media toe aan elke put en verzamel alle cellen in 1,5 milliliter buisjes met een duidelijk gelabelde aparte buis voor elke put.
Centrifugeer de buisjes gedurende twee tot drie minuten bij 60G om de cellen te pelleren. Plaats vervolgens de buisjes in de ruimte tussen de watervulling in de spoel. Stel de temperatuur van het waterbad in om de media en de celpallet op 37 graden Celsius te houden.
Stel aparte glasvezel temperatuursondes in om de temperatuur in de buis en het waterbad te monitoren. Schakel de koeler in en controleer of het koelmiddel door de spoel stroomt. Schakel vervolgens de stroombron in en pas het percentage van de maximale intensiteit aan op het gewenste veld.
Bedien de 14-windings elektromagneet aangedreven door een 10 kilowatt generator op 165 kilohertz en 23,87 kiloamperes per meter. Behandel de cellen totdat een vooraf bepaalde thermische dosis volgens het protocol bereikt is. Na de behandeling, resuspendeer de gepelleted cellen in het media in de buisjes en herplaats ze in nieuwe, duidelijk gelabelde zes-putjes platen.
Na het anesthesieren van de muis, maak de tumor schoon met een alcoholdoek. Injecteer de magnetische nanodeeltjes in de tumor drie uur voor de AMF-behandeling. Na drie uur, anesthesier de muis opnieuw en controleer op afwezigheid van respons op de rechtingsreflexen.
Verwijder de oortegel of andere metalen voorwerpen van de muis en plaats voorzichtig een gesmeerde glasvezel temperatuur sonde in zijn rectum. Plaats de katheter in de tumor. Verwijder de naald.
Snijd vervolgens de katheter zodanig dat deze niet te veel uit de tumor steekt. Plaats een drie-sensor glasvezel temperatuur sonde in de katheter, die de sensoren zal beschermen. Plak de rectale en intratumorale sonde op de staart van het dier.
Plaats de muis in een 50 milliliter buisje dat een gat moet hebben bij de kop waar de anesthesie kan worden aangesloten en toegediend. Plaats het buisje in de spoel opstelling en sluit de anesthesie opnieuw aan. Plaats een glasvezel temperatuur sonde losjes in het buisje om de omgevingstemperatuur te meten.
Schakel vervolgens de koeler in en zorg ervoor dat het koelmiddel gecirculeerd wordt. Controleer of de computer software de verschillende temperaturen weergeeft en begin met opnemen om een CEM43 berekening in realtime te laten weergeven waarbij de vereiste CEM43 dosis eerder bepaald zou moeten zijn. Schakel de magneet aan met een laag vermogen en zorg ervoor dat de glasvezel temperatuur sondes temperatuur veranderingen registreren.
Kortom, dat de kerntemperatuur van het dier op 38 graden Celsius blijft, door deze te reguleren met de geconditioneerde luchtjas. Pas de sterkte van het magnetische veld aan door de stroom te veranderen die het temperatuurniveau in de tumor controleert. Schakel de AMF uit zodra de gewenste dosis is bereikt.
Verwijder het buisje van de spoel en haal de muis uit het buisje. Schakel vervolgens de koeler uit. Haal de sondes en katheters eruit en, indien nodig, markeer het dier met een nieuwe metalen oortegel.
Bewaak de muis tijdens herstel van de anesthesie, ervoor zorgen dat het normale gedrag hervat en dat er geen complicaties zijn. Voor in vivo hypothermi, is het essentieel om zoveel mogelijk glasvezel temperatuur sondes op strategische plaatsen te plaatsen voor real-time efficiëntie en veiligheidsbeoordeling. Deze sondes maken het mogelijk om de temperatuur gedurende het experiment te registreren, waardoor nauwkeurige dosimetrie en thermische geschiedenis mogelijk is.
De curven die gegenereerd worden tijdens een in vivo experiment worden hier getoond, waarbij de mogelijkheid wordt benadrukt om de temperatuur nauwgezet te monitoren en het systeem aan te passen om de tumortemperaturen binnen het gewenste bereik te houden. De vulkaanplots tonen differentieel tot expressie gebrachte genen na in vitro en in vivo magnetische nanodeeltjes hyperthermie behandeling, waardoor aangetoond wordt hoe moleculaire technieken kunnen worden gebruikt om de hyperthermie effecten te monitoren. Nauwkeurige monitoring van tumortemperaturen, kerntemperatuur van dieren en thermische dosis zijn noodzakelijk voor consistente levering van de behandeling.
Na hyperthermie kunnen verschillende analyses worden uitgevoerd om het effect en mechanisme van de behandeling te begrijpen. En andere therapieën kunnen worden geïmplementeerd voor een groter therapeutisch effect.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de technieken en methodologie die nodig zijn voor de nauwkeurige toediening van hyperthermie met magnetische nanodeeltjes met behulp van een geavanceerd toedienings- en monitoringsysteem. Deze methode is belangrijk omdat deze de meest robuuste en reproduceerbare manier biedt om behandeling met hyperthermie via magnetische nanodeeltjes toe te dienen in preklinische modellen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biotecnologie
- Thermische therapie
Achtergrond
- Precieze en consistente toediening van nanodeeltjeshyperthermie.
- Nauwkeurige monitoring en controle van de lokale omgeving en de fysiologie van het dier.
- Het belang van thermometrie voor reproduceerbaarheid en veiligheid.
- Toepassing in preklinische modellen.
Doel van de Studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het toedienen van magnetische nanodeeltjeshyperthermie.
- Om de veiligheid en reproduceerbaarheid van de behandeling te waarborgen.
- Om de verhitting te beperken tot het doelweefsel.
Gebruikte methoden
- Bereiding van magnetische nanodeeltjes met een concentratie van drie milligram ion per milliliter.
- Gelijkmatige distributie van nanodeeltjes in celkweekwells.
- Gebruik van een stamoplossing van medium en nanodeeltjes.
- Monitoring van de thermische dosis tijdens de behandeling.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle toediening van magnetische nanopartikel-hyperthermie.
- Consistente verhitting beperkt tot het doelweefsel.
- Reproduceerbaarheid van resultaten over verschillende proeven.
- Effectieve monitoring van de lokale omgeving en de fysiologie van het dier.
Conclusies
- Het protocol biedt een robuuste methode voor nanodeeltjeshyperthermie.
- Garandeert veiligheid en effectiviteit in preklinische toepassingen.
- Benadrukt het belang van thermometrie bij de behandeling.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Magnetische nanodeeltjeshyperthermie (mNPH) maakt nauwkeurige thermische dosering mogelijk in preklinische oncologiemodellen, wat doelvalidatie ondersteunt via gecontroleerde tumorablatie en subletale immunomodulerende effecten. De real-time temperatuurmonitoring op meerdere locaties en de CEM43-gebaseerde dosimetrie van het systeem leveren kwantitatieve, reproduceerbare resultaten die cruciaal zijn voor mechanische risicoreductie en voorspellend vertrouwen in therapeutische vensters. Deze mogelijkheid slaat een brug tussen in vitro bevindingen en in vivo effectiviteit, wat go/no-go-beslissingen in vroege ontdekkingspijplijnen informeert.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door gedefinieerde thermische doses toe te dienen om de tumoromgeving en immuunresponsen te moduleren.
- Operationele waarde: Beperkt de verhitting tot het doelweefsel via glasvezeltermostrie, waardoor off-target effecten worden verminderd en de specificiteit van de assay wordt verbeterd.
- Voorspellende waarde: Kwantificeert biologische effecten over temperatuur-tijdgradiënten, wat dosis-responismodellering voor de prioritering van doelen ondersteunt.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor (bijv. B16 F10-melanomcellen) met een gestandaardiseerde opname van nanodeeltjes voor een consistente hyperthermierespons.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van stockoplossingen en protocollen voor een gelijkmatige distributie om reproduceerbaarheid tussen wells en platen te waarborgen.
- Assay-gereedheid: Genereert volumetrische thermische dosisgegevens (CEM43) die compatibel zijn met high-content screening en downstream analytics.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Ondersteunt een naadloze overgang van in vitro celkweek naar in vivo tumormodellen door gebruik te maken van identieke nanodeeltjesformuleringen en monitoring.
- Ziekterelevantie: Toepasbaar op muismodellen voor melanoom, waardoor evaluatie van genexpressieveranderingen door hyperthermie (bijv. volcano plots) als potentiële biomarkers mogelijk is.
- Risicogestuurde vooruitgang: Realtime tracking van de thermische dosis maakt een veiligheidsgecontroleerde escalatie en mechanistische risicoreductie mogelijk voorafgaand aan combinatietherapiestudies.
Integratie van pipeline en workflow
Positioneert mNPH als een ondersteunende technologie tussen target-validatie en lead-optimalisatie, waarbij de precisie van de thermische dosis informatie verschaft voor fenotypische screening en studies naar het werkingsmechanisme.
- Discovery Biology: Ondersteunt de verduidelijking van signaalpaden door thermische stress te koppelen aan differentiële genexpressie en immuunmodulatie.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare thermische resultaten (bijv. CEM43) voor het vergelijken van nanodeeltjesformuleringen en veldparameters.
- Analytics: Biedt real-time temperatuurcurves en moleculaire profielen na behandeling (bijv. volcano plots) voor vergelijkende analyse van condities.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft consistentie in de dosering en bewaking van nanodeeltjes van cellen naar dieren, wat de preklinische continuïteit ondersteunt.
- Bedrijfsbrede hergebruikbaarheid: Het systeemontwerp maakt een snelle overgang mogelijk tussen ex vivo, in vitro en in vivo opstellingen, waardoor de benutting van het platform over verschillende projecten wordt gemaximaliseerd.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door nauwkeurige thermische doses te correleren met moleculaire uitkomsten.
- Operationele waarde: Standaardiseert de toediening van hyperthermie via gekalibreerde solenoïdespoelen, chillers en glasvezelsondes op verschillende locaties.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door effectieve thermische vensters te definiëren die een balans bieden tussen effectiviteit en weefselveiligheid.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van nanotherapeutische kandidaten mogelijk op basis van reproduceerbare thermische ablatieprofielen.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in de preparatie van nanodeeltjes, thermische dosimetrie en dierbehandeling voor in vivo procedures.
- Vereist gespecialiseerde instrumentatie, waaronder 10 kW generatoren, solenoidspoelen met 14 windingen, chillers en temperatuurmonitoring via glasvezel op meerdere meetpunten.
- Vereist cross-team standaardisatie van de nanodeeltjesconcentratie (3 mg ion/mL), distributieprotocollen en CEM43-berekeningsmethoden.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij variërende tumormodellen, nanodeeltjesconstructen en veldparameters (165 kHz, 23,87 kA/m).
- Omvat praktische beperkingen, zoals de noodzaak van uitgebreide thermometrie om off-target verhitting te voorkomen en de regulatie van de kerntemperatuur van het dier te waarborgen.
