Methylatiespecifieke Multiplex Droplet PCR met polymeerdruppelgenerator voor hematologische diagnostiek

Dit protocol presenteert een flexibele multiplex druppel PCR workflow die nauwkeurige differentiële leukocyten tellen op basis van epigenetische methylatie markers mogelijk maakt. Deze flexibiliteit kan de vertaling van mdPCR naar klinisch gebruik vergemakkelijken. Deze methode biedt resultaten die nauw opvragen bij degenen die zijn verkregen met behulp van immunofluorescente kleuringsmethoden.

In tegenstelling tot immunofluorescente kleuring, echter, deze methode vereist geen verse bloedmonsters of dure antilichamen. In hematologische diagnostiek kan differentieel leukocyte dienen als indicatoren voor een spectrum van ziekten, waaronder infectie, ontsteking, bloedarmoede en leukemie, en wordt beschouwd als een vroege prognostische kanker biomarker. Het demonstreren van de procedure met Abdelrahman Elmanzalawy zal Christina Nassif zijn, een technisch medewerker van ons team van nrc's Medical Device Research Centre.

Begin met het grondig mengen van 20 microliter eiwitkinase K en 400 microliter lysisbindbuffer met magnetische kralen met vers ontdooide menselijke perifere bloedmonopoliecellen in 100 microliter van PBS. Na een vijf minuten durende incubatie bij kamertemperatuur, plaats de buis op een magnetisch rek gedurende een tot twee minuten voor het verwijderen van de supernatant. Met de buis verwijderd uit de magneet, opnieuw opschorten het DNA-kraal complex in 600 microliters van wasbuffer een om niet-specifiek gebonden kralen te verwijderen.

Plaats de buis terug op de magneet om verwijdering van de supernatant mogelijk te maken, voordat u de cellen in 600 microliter wasbuffer twee wast, zoals net is aangetoond. Laat de buis na het verwijderen van de supernatant gedurende een minuut een minuut drogen voordat u 100 microliter elutiebuffer aan de buis toevoegt met grondig mengen. Plaats vervolgens de buis gedurende één tot twee minuten op het magnetische rek om de magnetische kralen van het gezinspeelde DNA te scheiden en breng de gezuiverde DNA-oplossing over naar een nieuwe buis.

Voor bisulfie conversie van het gezuiverde DNA, breng 20 microliter van het gezinspeelde DNA-monster naar een PCR-buis, en voeg 130 microliters van conversie reageagensage aan de buis. Na grondig mengen, kort spin vaststelling van de buis inhoud en versterken van het DNA op een thermische cycler. Voeg aan het einde van de cyclus 600 microliter bindingsbuffer toe aan een ionenchromatografiekolom die in een verzamelingsbuis is geplaatst en voeg het DNA toe aan de kolom.

Keer de buis meerdere malen om te mengen, en centrifuge gedurende 30 seconden op volle snelheid. Gooi de verzamelde stroom door en voeg 100 microliter wasbuffer toe aan de kolom. Centrifugeren de kolom en gooi de flow-through weer zoals aangetoond.

Voeg 200 microliter desulfonatiebuffer toe aan de kolom voor een incubatie van 15 tot 20 minuten bij kamertemperatuur, voordat u het monstercentrifugeert en de doorstroom weggooit zoals aangetoond. Was vervolgens de kolom twee keer met 200 microliters wasbuffer per wasbeurt. Breng na de tweede wasbeurt de kolom over naar een nieuwe opvangbuis van 1,5 milliliter en voeg 100 microliter pcr-water toe aan het membraan van de kolom.

Dan, ontwijk het DNA door centrifugatie van de kolom gedurende een minuut op volle snelheid. Voor druppelgeneratie, meng een microliter van bisulfite-omgezet DNA met vers voorbereide sonde master mix in een PCR buis, en het monster te verzamelen met een korte centrifugatie. Gebruik piekarmaturen om wegwerpvloeieige buizen aan te sluiten op twee 250 microliter volume precisie glassyspuiten.

En vul een precisieglasspuit voor met 250 microliter dragerolie die 5% flouro oppervlakteactieve stoffen bevat, en een precisieglasspuit met 50 microliter dragerolie. Wanneer beide spuiten zijn geladen, laad 100 microliters van de PCR in de spuit van draagolie en plaats een druppelmicrofluïdisch apparaat op het podium van een rechtopstaande lichtmicroscoop uitgerust met een hoge snelheidscamera. Voor de observatie en opname van druppelvorming in real time plaatst u de voorgevulde spuiten op een programmeerbare spuitpomp en gebruikt u piekunie met fittingen om de slang van de spuiten aan te sluiten op de slang van de respectieve inlaatkanalen van het druppelmicrofluïde apparaat.

Plaats de slang van de uitlaat van de druppelgenerator aan de binnenkant van een 0,5 milliliter PCR-buis en pas de stroomsnelheid van de spuitpomp aan op twee microliters per minuut, zodat de druppelgrootte kan stabiliseren voordat de resulterende emulsie wordt verzameld. Langzaam en zorgvuldig verzamelen van de emulsie van de bovenkant van de buis, en breng 75 microliter van de oplossing naar een 200 microliter PCR buis voor thermische fietsen. Bevestig vervolgens dat het oliegehalte in de PCR-buis nauw overeenkomt met het volume van de verspreide fase, om coalescence van de druppels tijdens het thermische fietsen te voorkomen en plaats de 200 microliterbuis in de thermische cycler.

Voor fluorescentie beeldvorming van het geëmulgeerde monster, breng de PCR-emulsie in een 50-micrometer diepe borosilicaat capillaire buis met een rechthoekig profiel, om de opstelling van de druppels in een dicht verpakte monolaag voor beeldvorming mogelijk te maken. Na het bevestigen en afdichten van de haarvaten op een microscoopdia, laadt u de glijbaan op het podium van de omgekeerde microscoop. En in de microscoop imaging software, selecteer verwerven en live snel, om real-time camera acquisitie te starten.

Bekijk vervolgens het monster onder helder veld en fluorescentiemicroscopie. Na druppelgeneratie en thermische fietsen kunnen de druppels worden geïntroduceerd in een glazen capillair met een breedte van één millimeter en een hoogte van 50 micrometer. Om een monolaagverdeling van de druppels te verkrijgen die ideaal is voor het verwerven van fluorescentiebeelden, kunnen beelden vervolgens voor elke golflengte worden opgenomen.

Na beeldanalyse kan de fluorescentieintensiteit van alle druppels in hun respectievelijke fluoroforen worden uitgezet om de drempel van de positieve en negatieve druppels vast te stellen. Na identificatie en telling kunnen de kopieën per druppelwaarden worden berekend en kan het percentage CD3+T-cellen en CD4+25+regulerende T-cellen worden bepaald op basis van respectievelijk de gemethyleerde CD3Z- en FOXP3-kopieën, met betrekking tot de kopieën per druppel van de totale cellen of C-less-gen. De procentuele waarden kunnen vervolgens worden vergeleken met die verkregen door middel van immunofluorescentie beeldvorming met behulp van de juiste antilichamen.

Ik denk dat de emulsie stabiliteit van de druppel generatie door middel van de thermische fietsen en de laatste druppel imaging stappen is cruciaal voor het verkrijgen van nauwkeurige, betrouwbare en reproduceerbare kwantificering resultaten. MD PCR-aanpassing door middel van op maat gemaakte PCR-mixformulering kan worden gebruikt voor een aantal toepassingen, waaronder kankeronderzoek, diagnose van infectieziekten en analyses op het niveau van één cel.