Beoordeling van de expressie van major histocompatibiliteit complex klasse I op primaire murine hippocampale neuronen door flow cytometrie

Dit protocol gebruikt flowcytometrie om kwantitatief extracellulair MHC klasse 1 expressie op primaire neuronen gekweekt uit muizen te beoordelen. NC2 immunokleuring voor MHC1 expressie kan ook worden uitgevoerd om verlies van signaal door eiwit, tertiaire, structurele veranderingen, permeabilisatie of denaturerende omstandigheden te voorkomen. Naast het richten van immuunresponsen op infecties, moduleert MHC klasse 1 neuronale synaptische verbindingen.

De factoren die MHC klasse 1 expressie reguleren, zijn echter nog onbekend. De stappen voor het dissekeren van de embryonale hersenen vergen oefening om te beheersen. Wanneer je de techniek leert, zorg er dan voor om de dissectie te oefenen zonder je zorgen te maken over de tijd of het daaropvolgende kweekproces.

Plaats voor het isoleren van de embryonale hippocampus de eerste geoogste muis embryonale hersenen onder een stereo-dissectiemicroscoop. En gebruik twee paar steriele Dumont nummer 5 forceps om de reukbollen af te knijpen en om de hersenvliezen grondig weg te trekken. Zodra de hersenvliezen volledig zijn verwijderd, zal de superieure zijde van de cortex lateraal opengaan om de hippocampus bloot te leggen.

Gebruik de forceps om de hippocampus los te knijpen van de aangehechte cortex en breng de geïsoleerde hippocampus voorzichtig over in een steriele 15 milliliter conische buis met vijf milliliter Hibernate-E Medium op ijs. Wanneer alle hippocampussen in één enkele 15-milliliter buis zijn verzameld, sedimenteer het hersenweefsel door centrifugatie. Vervang het supernatant met 0,5 milliliter vers bereide papaïne dissociatie per embryo en meng de buis meerdere keren door middel van inversie.

Plaats het weefsel bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten, meng de monsters door middel van inversie om de 10 minuten voordat u het weefsel opnieuw verzamelt door centrifugatie. Vervang het supernatant met een gelijk volume vers Hibernate-E Medium en gebruik een volledig open glas, vuur gepolijst Pasteur pipet om het weefsel 10 keer te tritureren. Laat het weefsel twee minuten bezinken en breng het supernatant over in een nieuwe 50-milliliter conische buis.

Voeg een gelijk volume Hibernate-E Medium toe aan het weefsel en gebruik een half open glas vuur gepolijst Pasteur pipet om het weefsel 10 keer te tritureren. Laat het weefsel nog eens twee minuten bezinken, pool het supernatant in de 50-milliliter buis. Voeg een gelijk volume Hibernate-E Medium toe aan de weefsels en tritureer het weefsel 10 keer met een kwart open glas vuur gepolijst Pasteur pipet.

Laat het weefsel twee minuten bezinken, pool het supernatant in de 50-milliliter buis. Verzamel de gedissocieerde cellen in het supernatant door centrifugatie. En resuspendeer het pellet in vijf milliliter neuron groeimedium voor tellen. Verdun de cellen tot een uiteindelijke aanplantdichtheid van vijf maal 10 tot de vijfde levensvatbare cellen per milliliter neuron groeimedium en voeg één milliliter cellen toe aan elke put van een 12-puts poly-D-lysine gecoate plaat.

Plaats vervolgens de plaat in de celkweekincubator, vervang de helft van het medium twee keer per week met een gelijk volume vers medium gedurende de levensduur van de cultuur. Om de capaciteit van de gekweekte neuronen om MHC1 te kunnen uitdrukken te beoordelen, vervang op de juiste cultuurdag 0,5 milliliter supernatant in elke put met 0,5 milliliter vers neuron groeimedium aangevuld met 200 eenheden per milliliter interferon beta voor een incubatie van zes tot 72 uur in de celkweekincubator. Aan het einde van de incubatie, was elke put eenmaal met koud Neurobasal Medium zonder supplementen voordat u 0,5 milliliter niet-gesupplementeerd koud Neurobasal Media aanvult met een microgram per milliliter FC-blok en een microgram per milliliter fluorescentie geconjugeerd anti-MHC1 antilichaam aan elke put toevoegt.

Na een incubatie van 45 minuten bij vier graden Celsius, bescherm het tegen licht. Was elke put eenmaal met koud Dulbeccos PBS. Voeg vervolgens 0,5 milliliter enzymvrij celdissociatiebuffer op kamertemperatuur toe aan elke put en schud om de cellen los te maken.

Bevestig dissociatie onder een omgekeerde weefselkweekmicroscoop en voeg 0,5 milliliter FACS-buffer toe aan elke put. Tritureer de cellen om klonters te verspreiden en breng het volledige volume uit elke put over in individuele 1,7 milliliter microcentrifugebuizen. Verzamel de cellen door centrifugatie en resuspendeer het pellet in 100 microliters verse FACS-buffer per buis.

Breng elke suspensie over in individuele putten van een 96-puts U-bodemplaat en voeg 100 microliters fixeermiddel toe aan elke put. Tritureer meerdere keren om celklonters te voorkomen en incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer om de cellen op de bodem van de putten te verzamelen en resuspendeer de pellets in 200 microliters verse FACS-buffer per put.

Na centrifugatie, resuspendeer de pellets in 100 microliters permeabilisatie reagens aangevuld met fluorescentie geconjugeerd anti-neuronale kernen antilichaam per put. Na het mengen, incubeer de plaat gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met wiegen beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, verzamel de cellen door centrifugatie driemaal, waarbij de pellets tussen centrifugaties worden gesuspendeerd in 100 microliters verse FACS-buffer.

Na de laatste was, resuspendeer de cellen in 100 microliters van 2% paar formaldehyde in FACS-buffer met grondig mengen. Neuronen kunnen worden geïdentificeerd door middel van sequentiële gating van totale gebeurtenissen om cellulaire puinhopen en dubbelen uit te sluiten en door hun neuronale kernen positiviteit. Neuronale kernen positieve cellen kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd op hun MHC1 positiviteit.

Uit deze gegevens kan het percentage neuronen positief voor MHC1 kleuring en de mediaan fluorescentie-intensiteit worden berekend, wat aantoont dat bijvoorbeeld interferon beta behandeling significant de percentage en intensiteit van MHC1 neuron expressie opreguleerd. Met lichte modificaties kunnen deze methoden worden gebruikt om andere neuronale populaties zoals corticale neuronen te kweken of om verschillende cellulaire markers, stimulerende moleculen of genetische modificaties te testen.