Name: Het verkrijgen van Human Microglia uit volwassen menselijke hersenweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Leer een robuuste methode om primaire microglia te isoleren uit volwassen menselijk hersenweefsel verkregen tijdens chirurgie. Deze kosteneffectieve techniek minimaliseert celverlies en levert ongeveer 80% zuivere microglia op voor verder neurobiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het laboratorium van SJ is opgericht met institutionele subsidies van IITJ en wordt gefinancierd door subsidies van het Department of Biotechnology (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) en de regering van het Ministerie van Elektronica en Informatietechnologie van India (nr.4(16)/2019-ITEA). De menselijke hersenen weefsel secties werden verkregen van het All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur na institutionele ethiek commissie goedkeuring. Wij danken Mayank Rathor, B.Tech Student lid van Design and Arts Society IIT Jodhpur, voor videografie ondersteuning.

Alle weefsels werden verworven na ethische goedkeuring van het instituut ethische commissies van het Indian Institute of Technology Jodhpur en All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur.
1.Weefselverwerving en -verwerking (dag 0)
<ol><li>Verzamel het weefsel in een buis van 50 mL met 10 mL ijskoude kunstmatige hersenvocht (aCSF) (2 mM CaCl2∙2H2O, 10 mM glucose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 2,5 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2∙6H2O, 202 mM sucrose)20. Zorg ervoor dat de buis op ijs wordt gehouden als het weefsel naar een andere locatie moet worden overgebracht. LET OP: Bereid aCSF voor in automatisch gedestilleerd water. Filter het met 0,22 μm spuitfilter in de laminaire kap. Deze kan 1 maand worden bewaard bij 4 °C.</li>
	<li>Veeg de opvangbuis zorgvuldig af met 70% alcohol en breng over naar een aseptische laminaire luchtstroomkamer.</li>
	<li>Gooi aCSF voorzichtig weg en weeg weefsel in een aseptische conditie. Weefselgewicht is essentieel om het volume van trypsin-EDTA te berekenen dat nodig is voor volgende stappen.</li>
	<li>Houd het weefsel in vers warme aCSF gedurende 5 minuten op 37 °C. Deze stap is van cruciaal belang om celdood te voorkomen.</li>
	<li>Gooi aCSF weg en was weefsel eenmaal met 1x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) bij 37 °C. Zorg ervoor dat al het bloed wordt weggespoeld met herhaalde PBS wasbeurten (indien nodig).</li>
	<li>Incubeer het weefsel in warme PBS, bij 37 °C, gedurende 5 min.</li>
	<li>Gooi PBS voorzichtig weg en breng weefsel over naar een gesteriliseerde petrischaal. PBS kan worden verwijderd met een pipet. Dit voorkomt verlies van weefsel.</li>
	<li>Snijd het weefsel in kleine (ten minste 1 mm3)stukken met behulp van een steriele scalpel. Fijn in blokjes gesneden weefsel zorgt voor een hoger weefseloppervlak voor weefseldissociatie door trypsine-EDTA zorgen voor een hogere opbrengst.</li>
	<li>Breng het in blokjes gesneden weefsel over in een buis van 50 mL met 10 mL/g weefsel van 0,25% trypsin-EDTA en meng door een 10 mL serologische pipet te pipetten. Voeg 2 mL trypsin/EDTA toe aan een petrischaaltje en was de plaat grondig met behulp van pipet. Voeg deze trypsine terug aan de valkbuis. Dit minimaliseert het verlies van weefsel en cellen tijdens het dicing.</li>
	<li>Broed de buis 30 minuten op een shaker bij 37 °C bij 250 tpm. Deze stap verhoogt de dissociatie van cellen uit weefsel.</li>
	<li>Voeg aan het einde van de incubatie 10 mL neutraliserend medium (50% DMEM/50% F12 met glutamine, 1% penicilline-streptomycine, 10% FBS) toe om trypsine te neutraliseren. Meng met een serologische pipet van 10 mL. De hoeveelheid toegevoegde neutraliserende media moet gelijk zijn aan de hoeveelheid trypsine die wordt gebruikt.</li>
	<li>Centrifugeren de buis op 2.000 x g bij 4 °C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Gooi de supernatant weg en hang de pellet opnieuw op in 1 mL kweekmedium (50% DMEM/50% F12 met glutamine, 1% penicilline-streptomycine, 20% L929 supernatant, 10% FBS). OPMERKING: L929 cellen zijn cultuur in DMEM (DMEM met glutamine, 1% penicilline-streptomycine, 10% FBS). ATCC aanbevolen cultuur methode moet worden gevolgd voor celcultuur. Supernatant moet worden verzameld uit de cultuurkolf die ten minste 75% confluent is. Het kan in bulk worden verzameld en opgeslagen bij -80 °C om afbraak van groeifactoren te voorkomen. Het wordt aanbevolen om L929 supernatant afzonderlijk toe te voegen in kolven in plaats van toe te voegen aan het stamcultuurmedium.</li>
	<li>Plaats de cellen in een T-25 kolf, geschikt voor aanhangende cellen, en voeg 4 mL extra kweekmedium toe. Incubeer de kolf bij 37 °C met 5% CO2. Schud de kolf voorzichtig om het weefsel homogeen te verspreiden. Vermijd het brengen van de media naar de nek van de kolf, tijdens het schudden, omdat dit de kans op besmetting kan verhogen.</li>
</ol>2.Celcultuur (dag 2)
<ol><li>Verzamel de media uit de T-25 cultuurfles bereid op dag 0 in drie 1,5 mL centrifugebuizen door het verzamelen van gelijke hoeveelheid media in elke buis. Was de kolf één keer met 1 x PBS. Schud de kolf voorzichtig om restjes te verwijderen weefselfragmenten links. Vermijd harde schudden van de kolf als eventuele restfragmenten zal geen negatieve invloed op de cultuur. Voeg 5 mL verse cultuurmedia toe aan de kolf.</li>
	<li>Centrifugeren de verzamelde media op 1.466 x g (4000 rpm) bij 4 °C gedurende 4 minuten.</li>
	<li>Gooi de supernatant van elke buis en voeg 1 mL cultuurmedium toe aan een van de buizen. Meng grondig met pipet. Voeg in serie de gemengde media met cellen toe aan andere buizen. Meng grondig met pipet en pool de cellen in een buis.</li>
	<li>Plaats de cellen in een aparte T-25 kolf, geschikt voor aanhangende cellen. Voeg 4 mL kweekmedium toe en broed de kolf bij 37 °C met 5% CO2.</li>
</ol>3.Celcultuur (dag 4)
<ol><li>Gooi de media uit beide kolven en voeg verse 5 mL cultuur media aan de kolf.</li>
	<li>Incubeer de kolf bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 2 dagen.</li>
</ol>4. Celcultuur (dag 6)
<ol><li>Cellen zullen klaar zijn voor verdere experimenten.</li>
</ol>

<ol><li>Allen, N. J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+-+more+than+just+brain+glue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glia - more than just brain glue.</a> Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).</li>
<li>Lenz, K. M., Nelson, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+Beyond%3A+Innate+Immune+Cells+As+Regulators+of+Brain+Development+and+Behavioral+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function.</a> Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).</li>
<li>Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+heterogeneity+in+tissues%3A+phenotypic+diversity+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions.</a> Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).</li>
<li>Li, Q., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+macrophages+in+brain+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).</li>
<li>Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Alzheimer%27s+disease%3A+A+microglial+conundrum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microglia in Alzheimer's disease: A microglial conundrum.</a> Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).</li>
<li>Tremblay, M. -E., Cookson, M. R., Civiero, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+phagocytic+clearance+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Glial phagocytic clearance in Parkinson's disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16(2019).</li>
<li>Qin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functions+of+Microglia+in+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).</li>
<li>Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+Central+Nervous+System+Inflammation+and+Multiple+Sclerosis+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology.</a> Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).</li>
<li>Loane, D. J., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+the+TBI+brain%3A+The+good%2C+the+bad%2C+and+the+dysregulated%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated.</a> Experimental Neurology. 275 (03), Pt 3 316-327 (2016).</li>
<li>Inoue, K., Tsuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+neuropathic+pain%3A+cellular+and+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).</li>
<li>Bellver-Landete, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+are+an+essential+component+of+the+neuroprotective+scar+that+forms+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury.</a> Nature Communications. 10 (1), 518(2019).</li>
<li>Gutmann, D. H., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%2FBrain+Macrophages+as+Central+Drivers+of+Brain+Tumor+Pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology.</a> Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).</li>
<li>Smith, A. M., Dragunow, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+side+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The human side of microglia.</a> Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Friedman, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+Brain+Myeloid+Expression+Profiles+Reveal+Distinct+Microglial+Activation+States+and+Aspects+of+Alzheimer%27s+Disease+Not+Evident+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models.</a> Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).</li>
<li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PU.1+regulates+Alzheimer%27s+disease-associated+genes+in+primary+human+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44(2018).</li>
<li>Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+derived+from+aging+mice+exhibit+an+altered+inflammatory+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile.</a> Glia. 55 (4), 412-424 (2007).</li>
<li>Mizee, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+microglia+from+the+human+post-mortem+brain%3A+effects+of+ante-+and+post-mortem+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16(2017).</li>
<li>Rustenhoven, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+highly+enriched+primary+human+microglia+for+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies.</a> Scientific Reports. 6 (1), 19371(2016).</li>
<li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li>
<li>Olah, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+the+acute+isolation+of+human+microglia+from+autopsy+brain+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples.</a> Glia. 60 (1), 96-111 (2012).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Inflammasome+Sensor%2C+NLRP3%2C+Regulates+CNS+Inflammation+and+Demyelination+via+Caspase-1+and+Interleukin-18%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811(2010).</li>
<li>Freeman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NLR+members+NLRC4+and+NLRP3+mediate+sterile+inflammasome+activation+in+microglia+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).</li>
<li>Plant, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+beta+receptor+%28Lt+betaR%29%3A+dual+roles+in+demyelination+and+remyelination+and+successful+therapeutic+intervention+using+Lt+betaR-Ig+protein%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Protective+Role+of+Nitric+Oxide+in+a+Neurotoxicant-+Induced+Demyelinating+Model%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model.</a> The Journal of Immunology. 168 (1), 427(2002).</li>
<li>Arnett, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+promotes+proliferation+of+oligodendrocyte+progenitors+and+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination.</a> Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).</li>
<li>Trouplin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+macrophage+production%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived macrophage production.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50966(2013).</li>
<li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Rat+Bone+Marrow+Cells+Into+Macrophages+Under+the+Influence+of+Mouse+L929+Cell+Supernatant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant.</a> Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).</li>
<li>Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte%2Fmacrophage+colony-stimulating+factor+is+expressed+and+secreted+in+cultures+of+murine+L929+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells.</a> Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).</li>
</ol>

Auteurs hebben niets te onthullen.

Microglia zorgen voor homeostase in de normale hersenen en spelen een centrale rol in de pathofysiologie van verschillende neurologische ziekten4. Microglia staan centraal in de neuroontwikkeling en vorming van synapsen2. Microgliale studies hebben bewezen cruciaal te zijn in het begrijpen van de ontwikkeling en progressie van diverse neurologische ziekten4. Knaagdier microglia zijn de heersende model van keuze voor primaire microglia studies, hoewel...

Het centrale zenuwstelsel (CNS) is opgebouwd uit een complex netwerk van neuronen en gliacellen1. Onder de gliacellen functioneert microglia als de aangeboren immuuncellen van het CNS2,3. Microglia is verantwoordelijk voor het behoud van homeostase in het gezonde CNS4. Microglia spelen ook een belangrijke rol in de neuroontwikkeling, door het snoeien van synapsen2. Microglia staan centraal in de pathofysiologie van verschillende neurologische aandoeningen, waaronder maar niet beperkt tot; De ziekte van Alzheimer5, De ziekte van Parkinson6, beroerte7,multiple sclerose8, traumatisch hersenletsel9, neuropathische pijn10, dwarslaesie11 en hersentumoren zoals gliomen12.
Studies met betrekking tot CNS homeostase en ziekten maken gebruik van knaagdier microglia als gevolg van een gebrek aan kostenefficiënte en tijdefficiënte menselijke primaire microglia isolatie protocollen13. Knaagdier microglia lijken op primaire menselijke microglia in expressie van genen zoals Iba-1, PU.1, DAP12 en M-CSF receptor en zijn effectief geweest in het begrijpen van normale en zieke hersenen13. Interessant is dat de expressie van verschillende immuungerelateerde genen zoals TLR4, MHC II, Siglec-11 en Siglec-3 varieert tussen menselijke en knaagdiermicroglia13. De expressie van verschillende genen varieert ook in temporele expressie en in neurodegeneratieve ziekten bij beide soorten14,15. Deze significante verschillen maken menselijke microglia een essentieel model om microgliafunctie in homeostase en ziekte te bestuderen. Primaire menselijke microglia kan ook een effectief instrument voor preklinische screening van potentiële kandidaat-geneesmiddelen16. De bovengenoemde redenen onderstrepen de groeiende behoefte aan kosteneffectieve protocollen voor isolatie van primaire menselijke microglia.
We hebben een protocol ontwikkeld voor isolatie van primaire menselijke microglia van volwassen menselijk hersenweefsel verzameld als gevolg van chirurgisch venster gemaakt voor tumorresecties of andere chirurgische resecties. De methode hier is aanzienlijk anders dan bestaande methoden. We waren in staat om te isoleren en cultuur microglia na een transittijd van ongeveer 75 minuten van de weefsel collectie site te starten van de isolatie protocol in het laboratorium. We hebben de supernatant van L929 fibroblastcellen gebruikt om de groei van geïsoleerde microglia te bevorderen. Deze methode richt zich specifiek op de cultuur en ontwikkeling van alleen primaire microglia. De resulterende cultuur voorbereid is ongeveer 80% microglia. Terwijl andere protocollen zorgen voor een verrijkte cultuur van microglia door dichtheidgradiëntcentrifugatie, stroomcytometrie en magnetische kralen, is het protocol een snelle, eenvoudige, robuuste en kosteneffectieve manier om primaire menselijke microglia17,18,,19,20te verkreeden ., De mogelijkheid om chirurgisch verwijderd levend volwassen hersenweefsel te gebruiken in plaats van vaste hersenweefsels van kadavers bewijst een extra voordeel van deze methode in tegenstelling tot de bestaande procedures18,21.

<table><tbody><tr><td>Antibiotic-Antimycotic oplossing</td><td>Himedia</td><td>A002</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge (4 &deg;C)</td><td>Sigma</td><td>146532</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugebuizen</td><td>Abdos</td><td>P10203</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>New Brunswik</td><td>Galaxy 170 S</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Himedia</td><td>GRM077</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-medium met glutamine</td><td>Himedia</td><td>AL007S</td><td></td></tr><tr><td>Foetaal bovien serum</td><td>Himedia</td><td>RM9955</td><td></td></tr><tr><td>Flaconbuis (50 ml)</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>50CD1058</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceïne Ricinus communis agglutinine-1</td><td>Vector</td><td>FL-1081</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescente microscoop</td><td>Leica</td><td>DM2000LED</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroshield met DAPI</td><td>Sigma</td><td>F6057</td><td></td></tr><tr><td>GFAP-antilichaam</td><td>GA5</td><td>3670S</td><td></td></tr><tr><td>Incubator shaker</td><td>New Brunswik Scientific</td><td>Innova 42</td><td></td></tr><tr><td>L929-cellijn</td><td>ATCC</td><td>NCTC clone 929 [L-cel, L-929, derivaat van Strain L] (ATCC&nbsp;CCL-1)</td><td></td></tr><tr><td>Laminaire luchtstroom</td><td>Thermo Fsiher Scientific&nbsp;</td><td>1386</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>Mononatriumfosfaat</td><td>Merck</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>Nutrient Mixture F-12 Ham Medium</td><td>Himedia</td><td>Al106S</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Duran Group</td><td>237554805</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Himedia</td><td>ML023</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Himedia</td><td>MB043</td><td></td></tr><tr><td>Serologische pipet</td><td>Labware</td><td>LW-SP1010</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Himedia</td><td>MB045</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Himedia</td><td>MB025</td><td></td></tr><tr><td>Spuitfilter (0.2&mu;, 25 mm diameter)</td><td>Axiva</td><td>SFPV25R</td><td></td></tr><tr><td>T-25 weefselkweekkolven geschikt voor adherente celkweek.</td><td>Himedia</td><td>TCG4-20X10NO</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

het verkrijgen van human microglia uit volwassen menselijke hersenweefsel

Obtaining Human Microglia from Adult Human Brain Tissue

Microglia zijn ingezeten ingeboren immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CNS). Microglia spelen een cruciale rol tijdens de ontwikkeling, bij het handhaven van homeostase, en tijdens infectie of letsel. Verschillende onafhankelijke onderzoeksgroepen hebben gewezen op de centrale rol die microglia spelen in auto-immuunziekten, auto-inflammatoire syndromen en kanker. De activering van microglia bij sommige neurologische ziekten kan direct deelnemen aan pathogene processen. Primaire microglia zijn een krachtig hulpmiddel om de immuunreacties in de hersenen, celcelinteracties en geantreguleerde microglia fenotypes bij ziekte te begrijpen. Primaire microglia bootsen in vivo microgliale eigenschappen beter na dan vereeuwigde microgliale cellijnen. Menselijke volwassen microglia vertonen verschillende eigenschappen in vergelijking met menselijke foetale en knaagdier microglia. Dit protocol biedt een efficiënte methode voor isolatie van primaire microglia van volwassen menselijke hersenen. Het bestuderen van deze microglia kan kritische inzichten bieden in celcelinteracties tussen microglia en andere ingezeten cellulaire populaties in het CNS, waaronder oligodendrocyten, neuronen en astrocyten. Bovendien, microglia uit verschillende menselijke hersenen kan worden gekweekt voor karakterisering van unieke immuunreacties voor gepersonaliseerde geneeskunde en een groot aantal therapeutische toepassingen.

Door het bovengenoemde protocol te gebruiken (Figuur 1), konden we primaire menselijke microglia isoleren van levende chirurgisch gereseceerde hersenweefsels. Gekweekte cellen werden gekleurd met Ricinus communis agglutinine-1 (RCA-1) lectine voor microglia (groen) en met glia-fibrillair zuur eiwit (GFAP) voor astrocyten (rood) (figuur 2) zoals eerder beschreven22,23</...

Dit protocol is een efficiënte, kosteneffectieve en robuuste methode voor het isoleren van primaire microglia van levend, volwassen, menselijk hersenweefsel. Geïsoleerde primaire menselijke microglia kan dienen als een instrument voor het bestuderen van cellulaire processen in homeostase en ziekte.

Het verkrijgen van Human Microglia uit volwassen menselijke hersenweefsel

Microglia are resident innate immune cells of the central nervous system (CNS). Microglia play a critical role during development, in maintaining ...

Het algemene doel van het protocol is om primaire microgliacellen te isoleren van levende volwassen menselijke hersenweefsels. In ons geval werd dit verzameld als chirurgisch venster tijdens de operatie. Dit wordt bereikt door in eerste instantie het verzamelen van de hersenweefsels in ijskoude PBS, het weefsel wordt vervolgens in blokjes gesneden in 1 mm kubus kleine stukjes, en ik deed het gewoon met behulp van trypsine EDTA.Hierna worden de cellen geoogst door centrifugatie en verguld in een kolf die geschikt is voor androgeencelkweek gedurende 48 uur. Cellen worden opnieuw geoogst uit de kolf en gekweekt tot verder gebruik. Primaire menselijke microglia cellen kunnen nu worden gekenmerkt door het gebruik van immunocytochemie en gebruikt voor verder experiment.Het belangrijkste voordeel van ons protocol voor het isoleren van microgliacellen uit volwassen menselijke hersenweefsels is dat het effectief primaire volwassen menselijke microgliacellen op een zeer kosteneffectieve manier levert. Het protocol is robuust en vermindert het verlies van cellen door het aantal stappen dat in bestaande protocollen wordt gebruikt te verminderen. Verzamel het weefsel in een 50 mL Falcon buis met 10 mL ijskoude aCSF.Veeg de opvangbuis zorgvuldig af met 70% alcohol en breng over naar een aseptische laminaire luchtstroomkamer. Gooi de aCSF voorzichtig weg en weeg weefsel in de Falcon buis. Bereken het gewicht van het weefsel door het gewicht van de lege Falcon buis af te leiden.Warm verse aCSF tot 37 graden Celsius. Houd het weefsel in warme aCSF gedurende vijf minuten. Deze stap is van cruciaal belang om celdood te voorkomen.Gooi aCSF voorzichtig weg. En was weefsel een keer met 1X PBS opgewarmd tot 37 graden Celsius. Zorg ervoor dat al het bloed wordt weggespoeld met herhaalde PBS wasbeurten als dat nodig is.Incubeer het weefsel in warme PBS gedurende 5 minuten. Gooi de helft van de PBS voorzichtig weg. Breng weefsel samen met de resterende PBS naar een gesteriliseerde petrischaal.Verwijder de resterende PBS voorzichtig met 1-mL pipet. Dit voorkomt verlies van weefsel. Dobbelstenen die in ten minste 1 mm kubus kleine stukjes met behulp van een steriele scalpel.Voeg 2 mL van 0,25% trypsin EDTA toe aan petrischaal en was de plaat grondig met behulp van pipet. Breng het in blokjes gesneden weefsel over naar een 50 mL Falcon buis met 10 mL per gram weefsel van 0,25% trypsin EDTA. Meng door pipetting door een 10-mL serologische pipet.Broed de buis 30 minuten op een shaker bij 37 graden Celsius en de snelheid van 250 tpm. Voeg 10 mL neutraliserend medium toe om trypsine te neutraliseren. Meng grondig met een serologische pipet van 10 mL.Centrifuge de buis op 2000G bij 4 graden Celsius gedurende 10 minuten. Gooi de supernatant weg en verhoog de pellet in 1 mL cultuurmedium. Leg de cellen in een T25 kolf geschikt voor androgeencellen en voeg 4 mL extra kweekmedium toe.Cultuurmedium zal 20%L929 supernatant en 1% streptomycine bevatten. Het wordt aanbevolen om L929 supernatant afzonderlijk toe te voegen in kolven in plaats van toe te voegen aan het stamcultuurmedium. We zijn klaar met de kolf om het weefsel homogeen te verwijderen.Vermijd het brengen van de media naar de nek van de kolf tijdens het schudden als dit kan de kans op besmetting te verhogen. Incubeer de kolf op 37 graden Celsius met 5%CO2 gedurende 48 uur. Verzamel de media van T25 cultuurfles bereid op dag 0 in centrifugebuizen.Centrifuge de verzamelde media op 1, 466G bij 4 graden Celsius gedurende 4 minuten. Terwijl de verzamelde media wordt gecentrifugeerd, was de dag 0 kolf een keer met 1X PBS. Schud de kolf voorzichtig om restjes te verwijderen weefselfragmenten links.Vermijd harde schudden van de kolf als eventuele restfragmenten zal geen negatieve invloed op de cultuur. Voeg 5 ml verse cultuurmedia toe aan de kolf. Gooi de supernatant uit gecentrifugeerde buizen.Voeg 1 mL cultuurmedium toe aan een van de buizen en meng grondig met pipet. Voeg de gemengde media met cellen serieel toe aan andere buizen en meng grondig. Leg de cellen in een aparte T25 kolf geschikt voor androgeencellen.Voeg 4 ml verse cultuurmedia toe aan de kolf. Incubeer zowel de kolven op 37 graden Celsius met 5% CO2 gedurende 48 uur. Gooi de media uit beide kolven en voeg verse 5 mL cultuur media.Incubeer de kolven bij 37 graden Celsius bij 5%CO2 gedurende 48 uur. Op de zesde dag zijn de cellen klaar voor verdere experimenten. In de beelden hier vertegenwoordigd.Eerste paneel van de sectie A astrocyten gekleurd met GFAP, groen van kleur. In het tweede paneel, van sectie A microglia vlek met RCA, groen van kleur. In de sectie B microglia gekleurd met RCA, die groen van kleur is, en astrocyten zijn gekleurd met GFAP, rood van kleur.Overlay van de beelden toont microglia en astrocyten samen. Uit de beelden blijkt dat de meerderheid van de cellen in de voorbereide cultuur microglia zijn. De beelden werden gekwantificeerd door verblinde controle en het resultaat wordt vertegenwoordigd in sectie C.De resultaten toonden aan dat ongeveer 80% van de cellen in de voorbereide cultuur microgliacellen zijn.Deze techniek kan in ongeveer anderhalf uur worden uitgevoerd. Na deze procedure moet een goed begrip van hoe selecteer ik priming microglia uit volwassen menselijke hersenweefsels, die verder kan worden gebruikt voor downstream experimenten.

obtaining-human-microglia-from-adult-human-brain-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Het isoleren van primaire microglia van de cellulaire heterogeniteit van de hersenen is essentieel om hun rol te onderzoeken in zowel fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft een mechanische isolatie en gemengde celkweek techniek die hoge opbrengst en een hoge zuiverheid, levensvatbare primaire microgliale cellen...

Primaire Microglia Isolatie van Mixed gliale celculturen van neonatale rat hersenweefsel

The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

The video demonstrated the method of isolating and culturing cells from a neonatal mouse brain. It involved enzymatic and mechanical dissociation of the brain, followed by culturing in growth media lacking neuronal growth factor to obtain a mixed glial population.

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain

Schetsen we methoden voor de efficiënte en snelle isolatie / cultuur van levensvatbare microglia uit de neonatale cerebrale cortex en volwassen ruggenmerg. De dissectie en beplating van corticale microglia kan worden bereikt binnen 90 minuten, met de daaropvolgende microglia oogst plaatsvindt ~ 10 dagen na de eerste dissectie.

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

Een sleutel tot succesvolle onderzoek van microglia biologie is het behoud van microglia immunofunction ex vivo tijdens isolatie van CZS-weefsel. Isoleren microglia via roterende schudden resulteert in zeer zuivere en immunofunctional celculturen zoals beoordeeld door fluorescerende beeldvorming, immunocytochemie, en ELISA na microglia-activatie met de pro-inflammatoire stimuli lipopolysaccharide (LPS) en Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolatie van corticale Microglia met Conserven immunofenotype en functionaliteit van Muriene Pasgeborenen

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

Het hier gepresenteerde protocol maakt de transplantatie van geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide menselijke microglia (iPSMG) in de hersenen mogelijk via een transnasale route bij immunocompetente muizen. De methode voor de bereiding en transnasale transplantatie van cellen en de toediening van cytokinemengsel voor het onderhoud van iPSMG wordt getoond.

Transplantatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide microglia in immunocompetente muizenhersenen via niet-invasieve transnasale route

Dit protocol beschrijft het differentiatieproces van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in microglia-achtige cellen voor in vitro experimenten. We nemen ook een gedetailleerde procedure op voor het genereren van menselijke synaptosomen uit iPSC-afgeleide lagere motorneuronen die kunnen worden gebruikt als substraat voor in vitro fagocytosetests met behulp van live-cell imaging-systemen.

Humane microglia-achtige cellen: differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen en in vitro live-cel fagocytosetest met behulp van humane synaptosomen

We beschrijven een protocol voor het isoleren van microgliacellen uit de hypothalamus van de muis (of gelijkwaardige kleine hersenstructuren) met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS), in een relatief korte tijd. De MACS-gesorteerde hypothalamische microglia kunnen worden gebruikt voor ex vivo-analyse en kunnen worden geplateerd om in vitro-assays uit te voeren.

Isolatie van hypothalamische microglia uit vers doorbloede volwassen muizenhersenen door magnetisch geactiveerde celsortering  

Deze studie schetst een nieuwe benadering voor de oprichting van menselijke monocyt-afgeleide microglia-achtige (iMG) cellen die de indirecte beoordeling van hersenontsteking mogelijk maken. Dit presenteert een cellulair model dat nuttig kan zijn voor onderzoek dat zich richt op mogelijke ontsteking van de hersenen en bijbehorende neuropsychiatrische stoornissen.

Engineering van door menselijk bloed geïnduceerde microglia-achtige cellen voor omgekeerd translationeel hersenonderzoek

Leer een robuuste methode om primaire microglia te isoleren uit volwassen menselijk hersenweefsel verkregen tijdens chirurgie. Deze kosteneffectieve techniek minimaliseert celverlies en levert ongeveer 80% zuivere microglia op voor verder neurobiologisch onderzoek.

Het verkrijgen van Human Microglia uit volwassen menselijke hersenweefsel

Meer video's verkennen