Name: In Vivo intracellulaire opname van type-geïdentificeerde Rat Spinal Motoneurons tijdens trans-spinale directe stroomstimulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Leer intracellulaire opname van rattenmotoneuronen tijdens trans-spinale directe stroomstimulatie. Deze methode onderzoekt membraaneigenschappen en ritmische vuurpatronen in volwassen zenuwstelsels voor neurorevalidatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Science Center subsidie Nr. 2017/25/B/NZ7/00373. De auteurs willen het werk erkennen van Hanna Drzymała-Celichowska en Włodzimierz Mrówczyński, die beide hebben bijgedragen aan het verzamelen van gegevens en de analyse van de resultaten die in dit document worden gepresenteerd.

Alle procedures die verband houden met dit protocol zijn aanvaard door de bevoegde autoriteiten (bijvoorbeeld de lokale ethische commissie) en volgen de nationale en internationale regels inzake dierenwelzijn en beheer.
LET OP: Elke deelnemer die betrokken is bij de procedure moet goed worden opgeleid in elementaire chirurgische ingrepen en moet beschikken over een geldige vergunning voor het uitvoeren van dierproeven.
1. Anesthesie en premedicatie
<ol><li>Verdoven een rat met intraperitoneale injecties van natriumpentobarbital (een eerste dosis van 60 mg·kg-1 voor 6 maanden oude mannelijke Wistar ratten met een gewicht van 400\u2012550g). LET OP: Dit protocol is niet beperkt tot de aangegeven stam, geslacht of leeftijd van ratten. Ook alternatieve anesthesie zoals ketamine-xylazine mix, alfa-chloralose of fentanyl + midazolam + medetomidine kan worden gebruikt als meer geschikt voor verschillende onderzoeksdoelen of wanneer vereist door de ethische commissie.</li>
	<li>Controleer na ongeveer 5 minuten de diepte van anesthesie door de achterste ledematen van de rat met stompe tangen te knijpen. Ga alleen verder met de volgende stappen van het protocol wanneer er geen reflexactie wordt waargenomen.</li>
	<li>Injecteer 0,05 mL atropine onderhuids om de slijmproductie na intubatie te verminderen.</li>
	<li>Injecteer onderhuids 5 mL fosfaatbuffer met 4% glucoseoplossing, NaHCO3 (1 %) en gelatine (14%). Deze buffer zal worden geabsorbeerd door de cutane vaten tijdens een experiment en zal helpen bij het handhaven van vochtbalans.</li>
	<li>Controleer het dier tijdens de operatie periodiek op reflexacties en vul anesthesie indien nodig aan (10 mg·kg-1·h-1natriumpentobarbital).</li>
</ol>2. Chirurgie
<ol><li>Bereid het dier voor op chirurgische behandeling door het scheren van bont over het dorsale deel van de linker achterpoot, van de enkel tot de heup, de achterkant, van staart tot de hoge thoracale segmenten, de linkerkant van de borst, en de ventrale kant van het nekgebied boven het borstbeen</li>
	<li>Plaatsing van de intraveneuze lijn<ol>
<li>Plaats de rat op zijn rug op een gesloten-loop verwarmingskussen (en zet hem vast met ledemaatfixaties).</li>
		<li>Met behulp van een 21 mes, maak een longitudinale snede door de huid van een borstbeen tot een kin.</li>
		<li>Houd de huid met tangen en scheid deze van het onderliggende weefsel.</li>
		<li>Met behulp van stompe dissectie technieken bloot de rechter halsader. Ontleden zorgvuldig de ader uit omliggende weefsels.</li>
		<li>Zoek het deel van de ader zonder vertakking punten, slip twee 4-0 ligaturen eronder.</li>
		<li>Maak een losse knoop op het proximale uiteinde van het eerder geïdentificeerde niet-vertakkende segment van de ader en een losse knoop aan het distale uiteinde van dit segment van de ader. Klem de ader proximale naar het hart, en vervolgens ligate het distale deel van de ader.</li>
		<li>Maak met behulp van een irisschaar een incisie tussen de klem en verre ligatuur. Houd een flap van de ader, en introduceer een voorgevulde katheter op het punt waar het wordt geblokkeerd door de klem.</li>
		<li>Terwijl u de ader en de katheter met tangen vasthoudt, verwijdert u de klem en duwt u de katheter enkele millimeters in de ader. Zet beide uiteinden van de katheter vast aan de ader en voeg een extra fixatiepunt toe aan de huid.</li>
	</ol></li>
	<li>Introductie van de tracheale buis<ol>
<li>Met behulp van stompe tangen scheiden de twee mandibulaire klieren die de sternohyoid spieren. Aparte sternohyoïde spieren op de middellijn om de luchtpijp bloot te leggen.</li>
		<li>Slip drie 4-0 ligaturen onder de luchtpijp, maak dan twee knopen onder de tracheale buis invoegpunt en een knoop boven.</li>
		<li>Zoek het cricoïde kraakbeen van het strottenhoofd en maak een incisie onder het derde tracheale kraakbeen.</li>
		<li>Steek een tracheale buis in de luchtpijp en zet de buis op zijn plaats met vooraf voorbereide ligaturen, voeg dan een extra ligatuur aan de huid.</li>
		<li>Plaats een klein stukje watten boven de gescheiden spieren, en hecht de huid over het geopereerde gebied.</li>
	</ol></li>
	<li>Dissectie van de zenuwen van de achterledemak<ol>
<li>Met behulp van 21 mes, maak een longitudinale snede op de achterste kant van de linker achterste ledemaat, van de achillespees tot de heup.</li>
		<li>Pak de huid met tangen, en met behulp van stompe dissectie technieken scheiden de huid van de onderliggende spieren aan beide zijden van de incisie.</li>
		<li>Zoek de popliteal fossa aan de achterkant van het kniegewricht, die wordt bedekt door de biceps femoris spier, en met behulp van een schaar maken een snede tussen de voorste en achterste deel van deze spier.</li>
		<li>Bewegen naar boven gesneden twee hoofden van de biceps femoris helemaal naar de heup om de heup zenuw bloot. Cauterize als dat nodig is om bloedingen te voorkomen.</li>
		<li>Identificeer de surale, scheenbeen en gemeenschappelijke peroneale takken van de heupzenuw.</li>
		<li>Met behulp van een schaar, scheid de laterale van de mediale hoofd van de gastrocnemius spier om de scheenbeen zenuw en zijn takken bloot te stellen.</li>
		<li>Met behulp van 55 tangen pak het distale uiteinde van de surale zenuw, snijd het distaal en ontleden zo ver mogelijk.</li>
		<li>Herhaal de procedure met de gemeenschappelijke peroneale zenuw.</li>
		<li>Met behulp van een stompe glazen staaf scheiden de scheenzenuw van de omliggende weefsels, zorg ervoor dat de bloedvaten niet beschadigen, en snijd het distally.</li>
		<li>Identificeer de mediale gastrocnemius (MG) en de laterale gastrocnemius en soleus (LGS) zenuwen.</li>
		<li>Met behulp van 55 tangen, zorgvuldig ontleden de MG en LGS zenuwen, loskoppelen van omliggende weefsels, maar het behoud van hun verbinding met de respectieve spieren.</li>
		<li>Plaats een zoutgeweekd stuk watten onder de blootgestelde zenuwen.</li>
		<li>Sluit de huid over het geopereerde gebied.</li>
	</ol></li>
	<li>Laminectomie<ol>
<li>Met behulp van 21 mes maak een longitudinale incisie van het heiligbeen tot aan de thoracale wervels.</li>
		<li>Scheid de huid van de onderliggende spieren.</li>
		<li>Snijd de longissimus spier aan beide zijden van de thoracale en lumbale spineuze processen.</li>
		<li>Met behulp van stompe scalpel trekken de spieren uit de wervelkolom om de dwarse processen van elke wervel bloot te leggen.</li>
		<li>Met behulp van stompe punt schaar snijd de pezen van de spieren aangesloten op de dwarse processen langs de blootgestelde wervelkolom. Breng indien nodig hemostatische middelen aan.</li>
		<li>Identificeer de Th13 wervel als het laagste thoracale segment met ribinbrengen en verwijder fijne rongeurs spineuze processen en laminae van Th13 tot L2 wervels om lendensegmenten van het ruggenmerg bloot te leggen. Vergeet niet om het L3 spineuze proces dat zal worden gebruikt als een fixatiepunt voor wervelkolom stabilisatie beschadigen.</li>
		<li>Verwijder het Th12 spinous proces en maak het rugoppervlak zoveel mogelijk glad.</li>
		<li>Met behulp van stompe dissectie technieken scheiden de spieren van Th11 wervel om houder invoegpunten te creëren.</li>
		<li>Plaats dunne zout-doorweekte watten over de blootgestelde ruggenmergsegmenten.</li>
		<li>Verplaats de rat naar het op maat gemaakte metalen frame met twee parallelle staven en twee verstelbare armen met klemmen om de wervelkolom te ondersteunen en te stabiliseren.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Voorbereiding op de opname en stimulatie
<ol><li>Wervelkolomfixatie en zenuwopstelling<ol>
<li>Plaats de rat in het op maat gemaakte frame op een verwarmingskussen, aangesloten op het gesloten verwarmingssysteem om de lichaamstemperatuur van het dier op 37 ± 1°C te houden.</li>
		<li>Steek ECG-elektroden onder de huid en sluit aan op een versterker voor hartslagbewaking.</li>
		<li>Met behulp van de huid flappen, vormen een diep zwembad over het blootgestelde ruggenmerg.</li>
		<li>Bevestig met behulp van metalen klemmen de wervelkolom door klemmen onder Th12-dwarsprocessen en bij L3-spinachtig proces te plaatsen.</li>
		<li>Zorg ervoor dat de wervelkolom is bevestigd en horizontaal gerangschikt, en breng vervolgens dorso-ventrale druk aan beide zijden van de kolom om de spieren in te trekken.</li>
		<li>Vul het zwembad met warme (37 °C) minerale olie en houd het op deze temperatuur.</li>
		<li>Rijg een 4-0 ligatuur door de achillespees, til en strek de geopereerde linker achterpoot zodat de enkel is genivelleerd met de heup.</li>
		<li>Met behulp van de huid kleppen maken een diepe pool over de blootgestelde scheental, MG en LGS zenuwen.</li>
		<li>Vul het zwembad met warme (37 °C) minerale olie.</li>
		<li>Plaats MG en LGS zenuwen op bipolaire zilverdraad stimulerende elektroden en sluit ze aan op een vierkante puls stimulator. Gebruik aparte stimulatiekanalen voor elke zenuw.</li>
	</ol></li>
	<li>Plaatsing van oppervlakteelektrode<ol>
<li>Plaats een zilveren bal elektrode aan de linkerkant van het blootgestelde ruggenmerg, met een referentieelektrode ingevoegd in de rugspieren, en sluit beide elektroden aan op het differentiële DC-versterker. De oppervlaktebalelektrode zal worden gebruikt om afferentevolle volleys van zenuwen op te nemen.</li>
		<li>Met behulp van een constant-stroom stimulator, stimuleren van de MG en LGS zenuwen met vierkante pulsen van 0,1 ms duur, herhaald op een frequentie van 3 Hz, en observeren afferent volleys.</li>
		<li>Bepaal de drempel (T) voor zenuwactivering, stimuleer elke zenuw op ongeveer 3· T intensiteit, en record amplitude van afferent volley voor elke zenuw.</li>
		<li>Verplaats de oppervlakteelektrode rostral en herhaal de procedure om spinale segmenten te identificeren waarbij amplitudes van de volleys het hoogst zijn voor elke zenuw. Na het bepalen van de maximale volley locatie, verplaats de oppervlakteelektrode op een veilige afstand van het ruggenmerg.</li>
	</ol></li>
	<li>Spierverlamming en het vormen van pneumothorax om ademhalingsbewegingen te verminderen<ol>
<li>Verlam de rat intraveneus met een neuromusculaire blokker en sluit de tracheale buis aan op een externe ventilator in overeenstemming met een knaagdier-compatibele capnometer (Pancuronium bromide, bij een eerste dosis van 0,4 mg·kg-1, aangevuld om de 30 min in doses van 0,2 mg·kg-1)</li>
		<li>Monitor de co2-concentratie van eindgetijden en houd deze op ongeveer 3\u20124% door ventilatieparameters aan te passen (frequentie, luchtdruk en stroomvolumes).</li>
		<li>Maak een longitudinale incisie in de huid tussen de 5e en 6e rib aan een kant van de opname.</li>
		<li>Met behulp van botte tip schaar snijd de bovenliggende spieren te visualiseren intercostale ruimte tussen de ribben.</li>
		<li>Met behulp van kleine scherpe schaar, maak een kleine incisie in de intercostale spieren en in het borstvlies, dan steek een punt van een stompe rand tangen in de opening, waarbij zorg niet te drukken op de longen.</li>
		<li>Laat tangen uit te breiden of steek een kleine buis om de pneumothorax open te houden tijdens het experiment.</li>
		<li>Na het neuromusculaire blok, controleer anesthesie diepte door het controleren van ECG frequentie, en vul de verdovingsmiddel als de hartslag hoger is dan 400 bpm. Spierverlamming en het vormen van pneumothorax om ademhalingsbewegingen te verminderen, wat de opnamestabiliteit zal verbeteren</li>
	</ol></li>
	<li>Opening van de dura en pia mater<ol>
<li>Til met #55 tangen de dura mater voorzichtig op en snijd deze uit het L5-segment, rostrally tot aan het L4-segment.</li>
		<li>Met behulp van een paar ultradunne 5SF tangen maken een kleine patch in de pia die de dorsale kolom, tussen de bloedvaten, precies op het niveau van de maximale afferent volley van de MG of de LGS zenuw.</li>
		<li>Gebruik kleine stukjes zout geweekt en gedroogd gelschuim om bloedingen te blokkeren indien nodig.</li>
	</ol></li>
	<li>tsDCS-elektrodeplaatsing<ol>
<li>Maak een kleine incisie in de huid aan de ventrale kant van een rattenbuik op het rostro-caudal niveau dat overeenkomt met de locatie van L4-L5 spinale segmenten.</li>
		<li>Pak de blootgestelde huidflap met een metalen clip die zal dienen als referentie-elektrode.</li>
		<li>Plaats een zoutgeweekte spons op de rugzijde van de Th12 wervel. Zorg ervoor dat de sponsgrootte gelijk is aan die van een actieve tsDCS-elektrode (cirkelvormige roestvrijstalen plaat met een diameter van 5 mm).</li>
		<li>Druk met een fijne manipulator op de spons met een actieve tsDCS-elektrode tot op het bot en zorg ervoor dat het hele oppervlak van de elektrode gelijkmatig wordt ingedrukt.</li>
		<li>Sluit zowel referentie- als actieve tsDCS-elektroden aan op een constant-stroom stimulator-eenheid, die in staat is om een continue stroom van gelijkstroom te leveren.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van micropipetten<ol>
<li>Bereid met behulp van een micro-elektrodentrekker een micro-elektroden. OPMERKING: Zowel filament als niet-filamentelektroden kunnen worden gebruikt, maar vergeet niet dat de steel van de elektrode lang genoeg moet zijn om de ventrale hoorn te bereiken terwijl ze dun genoeg zijn om het ruggenmerg niet te comprimeren tijdens het afdalen.<ol>
<li>Stel de instelling van de trekker zo in dat de steel die het ruggenmerg binnenkomt ongeveer 3 mm lang is, terwijl de punt van de elektrode niet meer dan 1\u20122 μm in diameter is en de micro-elektrodenweerstand tussen 10 en 20 MΩ ligt.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vul de micro-elektroden met 2M kalium-citraat elektrolyt.</li>
		<li>Monteer de bereide micro-elektrodrode op de micromanipulator, waardoor 1\u20122 μm stepping beweging en stereotaxic kalibratie mogelijk is.</li>
		<li>Sluit de micro-elektrod aan op de intracellulaire versterker met de referentieelektrode in de rugspieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Na het neuromusculaire blok, controleer anesthesie diepte door het controleren van ECG frequentie, en vul de verdovingsmiddel, zodat de rat hartslag niet meer dan 400 bpm.</li>
</ol>4. Motoneuron tracking en penetratie
<ol><li>Plaats de afferente volley opname elektrode terug op het dorsale oppervlak van het ruggenmerg, caudally naar de locatie van de opnameplaats, op het niveau van het L6-segment.</li>
	<li>Stimuleer de MG- en LGS-zenuwen met elektrische 0,1 ms pulsen met een frequentie van 3 Hz en 3T-intensiteit om alle axonen van alfa-motoneurons binnen een geselecteerde zenuw te activeren.</li>
	<li>Drijf de micropipet in een geselecteerde patch in de pia met een medio-laterale hoek van 15\u201220° (met een tip die zijwaarts wordt gericht).</li>
	<li>Na het afdalen onder het oppervlak, kalibreren van de micro-elektrod en compenseren de capaciteit en spanning offset, en blijven penetratie van het ruggenmerg wanneer alle parameters stabiel zijn. Een antidromisch veldpotentieel van de motoneuronpool zal zichtbaar zijn bij het micro-elektrodenspanningspoor terwijl het naderen van een speciale motorkerus tijdens stimulatie van de respectieve zenuw.</li>
	<li>Ga penetratie met de micro-elektrodrode op 1\u20122 μm stappen, en periodiek gebruik maken van de buzz functie van de intracellulaire versterker om de elektrode tip duidelijk van eventuele residu.</li>
	<li>Observeer motoneuron penetratie die zal worden gekenmerkt door een plotselinge hyperpolarisatie van de geregistreerde spanning spoor en het verschijnen van een antidromische piek potentieel.</li>
</ol>5. Het opnemen van motoneuronmembraan en vuureigenschappen
<ol><li>In een brugmodus van de intracellulaire versterker, identificeer de motoneuron op basis van de "alles-of-niets" verschijning van het antidromische werkingspotentieel door het stimuleren van de respectieve zenuwtakken. Record 20 volgende sporen voor latere gemiddelding.</li>
	<li>Een strikt inclusiecriterium implementeren om gegevens van hoge kwaliteit te waarborgen: rustmembraanpotentieel van ten minste -50 mV in amplitude; actiepotentieel van meer dan 50 mV, met een positieve overschrijding; membraanpotentieel stabiel gedurende ten minste 5 minuten voorafgaand aan de opname.</li>
	<li>In een discontinu stroomklemmodus (huidige schakelmodus 4-8 kHz) van de intracellulaire versterker, roept een orthodromische werkingspotentieel op in een motoneuron met behulp van 0,5 ms intracellulaire depolariserende stroompulsen. Herhaal dit minstens 20 keer voor offline middeling.</li>
	<li>Stimuleer een motoneuron met 40 korte pulsen (100 ms) hyperpolariserende stroom (1 nA) om celinvoerweerstand te berekenen.</li>
	<li>Stimuleer een motoneuron met 50 ms square-wave pulsen bij toenemende amplitudes om de rheobase waarde te bepalen als de minimale amplitude van depolariserende stroom die nodig is om een enkele piek uit te lokken.</li>
	<li>Injecteer 500 ms square-wave pulsen van depolariserende stroom, bij toenemende amplitudes in stappen van 0,1–2 nA om ritmische ontladingen van motoneurons op te roepen.</li>
</ol>6. Trans-spinale directe stroomstimulatie (tsDCS)
<ol><li>Met behoud van een stabiele penetratie van de motoneuron, start de polarisatie procedure door trans-spinale toepassing van gelijkstroom. Pas de huidige intensiteit en toepassingstijd aan het experimentontwerp aan (bijvoorbeeld 0,1 mA voor 15 minuten).</li>
	<li>Onmiddellijk na het inschakelen van de DC, observeren de motoneuron membraan potentieel. Anodale polarisatie (de actieve elektrode als anode) moet leiden tot depolarisatie van het membraanpotentieel, terwijl kathodale polarisatie (de actieve elektrode als kathode) een tegenovergesteld effect moet oproepen. Let op of een verandering in het rustmembraanpotentieel in reactie op DC-stimulatie constant is, wat ervoor zorgt dat de intensiteit van het elektrische veld niet wordt beïnvloed.</li>
	<li>Herhaal tijdens de continue huidige toepassing stap 5.3\u20125.6 in intervallen van 5 minuten.</li>
	<li>Schakel het DC uit en herhaal stappen 5.3\u20125.6 in intervallen van 5 minuten totdat opnamen instabiel worden of inclusiecriteria worden aangetast.</li>
	<li>Beëindig het experiment en euthanaseer het dier met behulp van intraveneuze toediening van een dodelijke dosis pentobarbitaal natrium (180 mg·kg-1).</li>
</ol>

<ol><li>Angius, L., Hopker, J., Mauger, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ergogenic+Effects+of+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+on+Exercise+Performance%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">The Ergogenic Effects of Transcranial Direct Current Stimulation on Exercise Performance.</a> Frontiers in Physiology. 8, 90(2017).</li>
<li>Berry, H. R., Tate, R. J., Conway, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+induces+lasting+fatigue+resistance+and+enhances+explosive+vertical+jump+performance%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous spinal direct current stimulation induces lasting fatigue resistance and enhances explosive vertical jump performance.</a> PloS One. 12 (4), 0173846(2017).</li>
<li>Lenoir, C., Jankovski, A., Mouraux, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+%28tsDCS%29+selectively+inhibits+the+synaptic+efficacy+of+nociceptive+transmission+at+spinal+cord+level%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anodal transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS) selectively inhibits the synaptic efficacy of nociceptive transmission at spinal cord level.</a> Neuroscience. 393, 150-163 (2018).</li>
<li>Parazzini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+current+density+generated+by+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+%28tsDCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurophysiology%3A+Official+Journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Modeling the current density generated by transcutaneous spinal direct current stimulation (tsDCS).</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 125 (11), 2260-2270 (2014).</li>
<li>Choi, Y. A., Kim, Y., Shin, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pilot+study+of+feasibility+and+effect+of+anodal+transcutaneous+spinal+direct+current+stimulation+on+chronic+neuropathic+pain+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Pilot study of feasibility and effect of anodal transcutaneous spinal direct current stimulation on chronic neuropathic pain after spinal cord injury.</a> Spinal Cord. 57 (6), 461-470 (2019).</li>
<li>Gómez-Soriano, J., Megía-García, A., Serrano-Muñoz, D., Osuagwu, B., Taylor, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+spinal+direct+current+simulation+for+spasticity+therapy+following+spinal+cord+injury%3A+mechanistic+insights+contributing+to+long-term+treatment+effects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Non-invasive spinal direct current simulation for spasticity therapy following spinal cord injury: mechanistic insights contributing to long-term treatment effects.</a> The Journal of Physiology. 597 (8), 2121-2122 (2019).</li>
<li>de Araújo, A. V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+anodal+transcranial+direct+current+stimulation+to+improve+muscle+strength+and+motor+functionality+after+incomplete+spinal+cord+injury%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of anodal transcranial direct current stimulation to improve muscle strength and motor functionality after incomplete spinal cord injury: a systematic review and meta-analysis.</a> Spinal Cord. , (2020).</li>
<li>de Paz, R. H., Serrano-Muñoz, D., Pérez-Nombela, S., Bravo-Esteban, E., Avendaño-Coy, J., Gómez-Soriano, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+transcranial+direct-current+stimulation+with+gait+training+in+patients+with+neurological+disorders%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroengineering+and+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">Combining transcranial direct-current stimulation with gait training in patients with neurological disorders: a systematic review.</a> Journal of Neuroengineering and Rehabilitation. 16 (1), 114(2019).</li>
<li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gamma+and+alpha+spinal+motor+neurons+activity+by+trans-spinal+direct+current+stimulation%3A+effects+on+reflexive+actions+and+locomotor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Modulation of gamma and alpha spinal motor neurons activity by trans-spinal direct current stimulation: effects on reflexive actions and locomotor activity.</a> Physiological Reports. 4 (3), (2016).</li>
<li>Bolzoni, F., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+and+postsynaptic+effects+of+local+cathodal+DC+polarization+within+the+spinal+cord+in+anaesthetized+animal+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Presynaptic and postsynaptic effects of local cathodal DC polarization within the spinal cord in anaesthetized animal preparations.</a> The Journal of Physiology. 593 (4), 947-966 (2015).</li>
<li>Cogiamanian, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcutaneous+Spinal+Direct+Current+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Transcutaneous Spinal Direct Current Stimulation.</a> Frontiers in Psychiatry. 3, (2012).</li>
<li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-spinal+direct+current+stimulation+alters+muscle+tone+in+mice+with+and+without+spinal+cord+injury+with+spasticity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Trans-spinal direct current stimulation alters muscle tone in mice with and without spinal cord injury with spasticity.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (5), 1701-1709 (2014).</li>
<li>Bolzoni, F., Pettersson, L. G., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+long-lasting+subcortical+facilitation+by+transcranial+direct+current+stimulation+in+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Evidence for long-lasting subcortical facilitation by transcranial direct current stimulation in the cat.</a> The Journal of Physiology. 591 (13), 3381-3399 (2013).</li>
<li>Manuel, M., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha%2C+beta+and+gamma+motoneurons%3A+functional+diversity+in+the+motor+system%27s+final+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway.</a> Journal of Integrative Neuroscience. 10 (3), 243-276 (2011).</li>
<li>Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+unit+recruitment+order+during+voluntary+and+electrically+induced+contractions+in+the+tibialis+anterior%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Motor unit recruitment order during voluntary and electrically induced contractions in the tibialis anterior.</a> Experimental Brain Research. 114 (1), 117-123 (1997).</li>
<li>Van Cutsem, M., Feiereisen, P., Duchateau, J., Hainaut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+and+behaviour+of+motor+units+in+the+tibialis+anterior+during+voluntary+contractions%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Applied+Physiology+%3D+Revue+Canadienne+De+Physiologie+Appliquee%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties and behaviour of motor units in the tibialis anterior during voluntary contractions.</a> Canadian Journal of Applied Physiology = Revue Canadienne De Physiologie Appliquee. 22 (6), 585-597 (1997).</li>
<li>Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+properties+of+motoneurons+innervating+different+muscle+unit+types+in+rat+gastrocnemius%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Physiological properties of motoneurons innervating different muscle unit types in rat gastrocnemius.</a> Journal of Neurophysiology. 69 (4), 1160-1170 (1993).</li>
<li>Ahmed, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-spinal+direct+current+stimulation+modifies+spinal+cord+excitability+through+synaptic+and+axonal+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Trans-spinal direct current stimulation modifies spinal cord excitability through synaptic and axonal mechanisms.</a> Physiological Reports. 2 (9), (2014).</li>
<li>Manuel, M., Iglesias, C., Donnet, M., Leroy, F., Heckman, C. J., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics%2C+high-frequency+oscillations%2C+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li>
<li>Liebetanz, D., Koch, R., Mayenfels, S., König, F., Paulus, W., Nitsche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+limits+of+cathodal+transcranial+direct+current+stimulation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurophysiology%3A+Official+Journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Safety limits of cathodal transcranial direct current stimulation in rats.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1161-1167 (2009).</li>
<li>Bączyk, M., Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+effects+of+direct+current+are+reproduced+by+intermittent+depolarization+of+myelinated+nerve+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Long-term effects of direct current are reproduced by intermittent depolarization of myelinated nerve fibers.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (3), 1173-1185 (2018).</li>
<li>Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motoneuron+firing+properties+are+modified+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Motoneuron firing properties are modified by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> Journal of Applied Physiology. 126 (5), Bethesda, Md. 1232-1241 (2019).</li>
<li>Bączyk, M., Drzymała-Celichowska, H., Mrówczyński, W., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+modifications+of+motoneuron+firing+properties+by+trans-spinal+direct+current+stimulation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-lasting modifications of motoneuron firing properties by trans-spinal direct current stimulation in rats.</a> European Journal of Neuroscience. , (2019).</li>
<li>Miranda, P. C., Faria, P., Hallett, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+the+ratio+of+injected+current+to+electrode+area+tell+us+about+current+density+in+the+brain+during+tDCS%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Neurophysiology%3A+Official+Journal+of+the+International+Federation+of+Clinical+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">What does the ratio of injected current to electrode area tell us about current density in the brain during tDCS.</a> Clinical Neurophysiology: Official Journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 120 (6), 1183-1187 (2009).</li>
<li>Rahman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+effects+of+acute+direct+current+stimulation%3A+somatic+and+synaptic+terminal+effects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cellular effects of acute direct current stimulation: somatic and synaptic terminal effects.</a> The Journal of Physiology. 591 (10), 2563-2578 (2013).</li>
<li>Bikson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+uniform+extracellular+DC+electric+fields+on+excitability+in+rat+hippocampal+slices+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of uniform extracellular DC electric fields on excitability in rat hippocampal slices in vitro.</a> The Journal of Physiology. 557, Pt 1 175-190 (2004).</li>
<li>Jankowska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+control+of+motor+outputs+by+intrinsic+and+externally+induced+electric+field+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Spinal control of motor outputs by intrinsic and externally induced electric field potentials.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1221-1234 (2017).</li>
<li>Button, D. C., Gardiner, K., Marqueste, T., Gardiner, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency-current+relationships+of+rat+hindlimb+alpha-motoneurones%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Frequency-current relationships of rat hindlimb alpha-motoneurones.</a> The Journal of Physiology. 573, Pt 3 663-677 (2006).</li>
</ol>

Auteurs hebben geen belangenconflict te onthullen.

Indien correct uitgevoerd, moet het chirurgische deel van het beschreven protocol binnen ongeveer drie uur worden voltooid. Men moet bijzondere zorg in het handhaven van stabiele fysiologische omstandigheden van een dier tijdens de operatie, met name lichaamstemperatuur en diepte van anesthesie. Afgezien van duidelijke ethische overwegingen, een gebrek aan de juiste anesthesie kan leiden tot overmatige bewegingen van ledematen tijdens zenuwdissectie of laminectomie en leiden tot schade aan de voorbereiding of een voortij...

Trans-spinale directe stroomstimulatie (tsDCS) krijgt erkenning als een krachtige methode om spinale circuit excitability in gezondheid en ziekte1,2,3te wijzigen . In deze techniek wordt een constante stroom doorgegeven tussen een actieve elektrode boven geselecteerde spinale segmenten, met een referentieelektrode die ventrally of meer rostrally4bevindt. Verschillende studies hebben al bevestigd dat tsDCS kan worden gebruikt bij het beheer van bepaalde pathologische aandoeningen, zoals neuropathische pijn5,spasticiteit6,dwarslaesie7 of om revalidatie te vergemakkelijken8. Onderzoekers suggereren dat tsDCS veranderingen oproept in de ionenverdeling tussen de intracellulaire en de extracellulaire ruimte over het celmembraan, en dit kan de neuronale activiteit vergemakkelijken of remmen, afhankelijk van de huidige oriëntatie9,10,11. Tot voor kort ontbrak echter een directe bevestiging van deze invloed op motoneurons.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol om in vivo intracellulaire registratie van elektrische potentialen van lumbale spinale motoneurons in de verdoofde rat uit te voeren met gelijktijdige toepassing van tsDCS, om veranderingen in motoneuronmembraan en afvurende eigenschappen in reactie op anodale of kathodale polarisatie van het spinale neuronale netwerk waar te nemen. Intracellulaire opnamen openen verschillende onderzoeksgebieden van neuroneigenschappen, niet beschikbaar voor eerder gebruikte extracellulaire technieken9,12. Het is bijvoorbeeld mogelijk om de reactie van motoneuronmembraanspanning op gelijkstroomstroom veroorzaakt door tsDCS nauwkeurig te meten, om de spanningsdrempel voor piekgeneratie aan te geven of om actiepotentieelparameters te analyseren. Bovendien stelt deze techniek ons in staat om de passieve membraaneigenschappen van motoneuron te bepalen, zoals invoerweerstand, en om de relatie tussen intracellulaire stimulatiestroom en frequentie van ritmisch afvuren van motoneurons te observeren. Antidromische identificatie van geregistreerde motoneuron, gebaseerd op de stimulatie van functioneel geïdentificeerde zenuwen (d.w.z. zenuwen die efferents leveren aan flexoren of extensoren) stelt ons in staat om bovendien soorten innervated motoreenheden te identificeren (snel versus langzaam), wat een kans geeft om te testen of polarisatie op verschillende manieren individuele elementen van het volwassen spinale neuronale systeem beïnvloedt. Vanwege een uitgebreide operatie voorafgaand aan de opname en hoge eisen aan stabiliteit en betrouwbaarheid van opnames, is deze techniek zeer uitdagend, maar maakt een directe en langdurige beoordeling van elektrofysiologische kenmerken van één motoneuron mogelijk: voor, tijdens en na toepassing van tsDCS, wat cruciaal is om zowel de acute acties als de aanhoudende effecten te bepalen13. Als een motoneuron activeert direct extrafusale spiervezels14 en neemt deel aan feedback controle van een spiercontractie en ontwikkelde kracht15,16 elke waargenomen invloed van tsDCS op de motorische eenheid of spier contractiele eigenschappen kunnen worden gekoppeld aan modulaties van motoneuron excitability of vuren kenmerken.

<table><tbody><tr><td>Durgs and solutions</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Atropinum sulfuricum</td><td>Polfa Warszawa</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Merck</td><td>346351</td><td>-</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>106329</td><td>-</td></tr><tr><td>Pancuronium Jelfa</td><td>PharmaSwiss/Valeant</td><td>-</td><td>Neuromusculaire blocker</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodium</td><td>Biowet Pu?awy Sp. z o.o</td><td>-</td><td>Hoofdanesthesiemiddel</td></tr><tr><td>Pottasium citrate</td><td>Chempur</td><td>6100-05-06</td><td>-</td></tr><tr><td>Tetraspan</td><td>Braun</td><td>-</td><td>HES-oplossing</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische apparatuur</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>21 Blade</td><td>FST</td><td>10021-00</td><td>Scalpelblad</td></tr><tr><td>Cauterizer</td><td>FST</td><td>18010-00</td><td>-</td></tr><tr><td>Chest Tubes</td><td>Mila</td><td>CT1215</td><td>-</td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>FST</td><td>11241-30</td><td>Spiertang</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td>Duratang</td></tr><tr><td>Dumont #5F Forceps</td><td>FST</td><td>11255-20</td><td>Nerftange</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Forceps</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td>Piatang</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>11008-13</td><td>Botse tangen</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>11053-10</td><td>Huidtang</td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>FST</td><td>13013-14</td><td>-</td></tr><tr><td>Rongeur</td><td>FST</td><td>16021-14</td><td>Voor laminectomie</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>Venenschaar</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>15002-08</td><td>Duraschaar</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>14184-09</td><td>Voor tracheasnede</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>104075-11</td><td>Spiertweeschar</td></tr><tr><td>Scissors</td><td>FST</td><td>14002-13</td><td>Huidschaar</td></tr><tr><td>Tracheal tube</td><td>-</td><td>-</td><td>Op maat gemaakt</td></tr><tr><td>Vein catheter</td><td>Vygon</td><td>1261.201</td><td>-</td></tr><tr><td>Vessel cannulation forceps</td><td>FST</td><td>18403-11</td><td>-</td></tr><tr><td>Vessel clamp</td><td>FST</td><td>18320-11</td><td>Voor venenklem</td></tr><tr><td>Vessel Dilating Probe</td><td>FST</td><td>10160-13</td><td>Voor venendissectie</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische materialen</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Gel foam</td><td>Pfizer</td><td>GTIN 00300090315085</td><td>Hemostatisch middel</td></tr><tr><td>Silk suture 4.0</td><td>FST</td><td>18020-40</td><td>-</td></tr><tr><td>Silk suture 6.0</td><td>FST</td><td>18020-60</td><td>-</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Axoclamp 2B</td><td>Molecular devices</td><td>discontinued</td><td>Intracellulaire versterker/nieuw model Axoclamp 900A</td></tr><tr><td>CapStar-100 End-tidal CO2 Monitor</td><td>CWE</td><td>11-10000</td><td>Gasanalysator</td></tr><tr><td>Grass S-88</td><td>A-M Systems</td><td>discontinued</td><td>Constant stroomstimulator</td></tr><tr><td>Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe</td><td>Harvard Apparatus</td><td>507222F</td><td>Verwarmingssysteem</td></tr><tr><td>ISO-DAM8A</td><td>WPI</td><td>74020</td><td>Extracellulaire versterker</td></tr><tr><td>Microdrive</td><td>-</td><td>-</td><td>Op maat gemaakt/vervanging IVM/Scientifica</td></tr><tr><td>P-1000 Microelectrode puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td>Micro-elektrode puller</td></tr><tr><td>SAR-830/AP Small Animal Ventilator</td><td>CWE</td><td>12-02100</td><td>Respirator</td></tr><tr><td>Support frame</td><td>-</td><td>-</td><td>Op maat gemaakt/vervanging lab standaard basis 51601/Stoelting</td></tr><tr><td>Spinal clamps</td><td>-</td><td>-</td><td>Op maat gemaakt/vervanging Rat spinal adaptor 51695/Stoelting</td></tr><tr><td>TP-1 DC stimulator</td><td>WiNUE</td><td>-</td><td>tsDCS stimulator</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diverse</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>1B150-4 glass capillaries</td><td>WPI</td><td>1B150-4</td><td>Voor micro-elektroden productie</td></tr><tr><td>Cotton wool</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>flexible tubing</td><td>-</td><td>-</td><td>Voor verbinding met ademhalingsapparaat en CO2-analysator</td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>WPI</td><td>MF28G67-5</td><td>Voor het vullen van micropipetten</td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>-</td><td>-</td><td>Voor zenuwelektroden</td></tr></tbody></table>

in vivo intracellulaire opname van type-geïdentificeerde rat spinal motoneurons tijdens trans-spinale directe stroomstimulatie

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Intracellulaire opname van spinale motoneurons in vivo biedt een "gouden standaard" voor het bepalen van de elektrofysiologische kenmerken van de cellen in het intacte spinale netwerk en heeft aanzienlijke voordelen ten opzichte van klassieke in vitro of extracellulaire opnametechnieken. Een voordeel van in vivo intracellulaire opnames is dat deze methode kan worden uitgevoerd op volwassen dieren met een volledig volwassen zenuwstelsel, en daarom kunnen veel waargenomen fysiologische mechanismen worden vertaald naar praktische toepassingen. In dit methodologisch papier beschrijven we deze procedure in combinatie met extern toegepaste constante stroomstimulatie, die polarisatieprocessen in spinale neuronale netwerken nabootst. Trans-spinale directe stroomstimulatie (tsDCS) is een innovatieve methode die steeds vaker wordt gebruikt als een neuromodulatory interventie in revalidatie na verschillende neurologische verwondingen en in de sport. De invloed van tsDCS op het zenuwstelsel blijft slecht begrepen en de fysiologische mechanismen achter zijn acties zijn grotendeels onbekend. De toepassing van de tsDCS gelijktijdig met intracellulaire opnames stelt ons in staat om veranderingen van motoneuron membraaneigenschappen en kenmerken van ritmisch vuren direct waar te nemen in reactie op de polarisatie van het spinale neuronale netwerk, wat cruciaal is voor het begrijpen van tsDCS-acties. Bovendien, wanneer het gepresenteerde protocol de identificatie van de motoneuron met betrekking tot een innervated spier en zijn functie (flexor versus extensor) evenals het fysiologische type (snel versus langzaam) omvat, biedt het een kans om selectief de invloed van tsDCS op geïdentificeerde componenten van spinale circuits te onderzoeken, die anders lijken te worden beïnvloed door polarisatie. De gepresenteerde procedure richt zich op chirurgische voorbereiding voor intracellulaire opnames en stimulatie met de nadruk op de stappen die nodig zijn om voorbereidingsstabiliteit en reproduceerbaarheid van de resultaten te bereiken. De details van de methodologie van de anodale of kathodale tsDCS applicatie worden besproken met aandacht voor praktische en veiligheidskwesties.

Parameters van het werkingspotentieel en verschillende membraaneigenschappen kunnen worden berekend op basis van intracellulaire opnamen wanneer stabiele omstandigheden van celpenetratie zijn gewaarborgd. Figuur 1A presenteert een typisch orthodromisch werkingspotentieel dat wordt opgeroepen door intracellulaire stimulatie, die voldoet aan alle criteria voor gegevensopname (het rustmembraanpotentieel van ten minste -50 mV en spike amplitude hoger dan 50 mV, met een positieve overschrijding)....

Dit protocol beschrijft in vivo intracellulaire opname van rat lumbale motoneurons met gelijktijdige trans-spinale directe stroom stimulatie. De methode stelt ons in staat om membraaneigenschappen te meten en ritmisch afvuren van motoneurons op te nemen voor, tijdens en na anodale of kathodale polarisatie van het ruggenmerg.

In Vivo intracellulaire opname van type-geïdentificeerde Rat Spinal Motoneurons tijdens trans-spinale directe stroomstimulatie

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

Dit protocol maakt gebruik van intracellulaire opnames van spinale motoneurons, om direct de invloed van trans-spinale directe stroom stimulatie op de functie van spinale netwerken te onderzoeken. Het grote voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt intracellulaire opnames worden uitgevoerd op volledig volwassen zenuwstelsel. Het vergemakkelijken van de vertaling van de experimentele waarnemingen naar praktische toepassingen.Na bevestiging van een gebrek aan reactie op pedaalreflex, een verdoofde zes maanden oude mannelijke Wistar rat, gebruik maken van een ontleden microscoop en een nummer 21 mes, om een longitudinale huid incisie van het borstbeen naar de kin te maken. En gebruik stompe dissectie om de rechter halsader bloot te leggen. Plaats twee, 4-0 ligaturen onder het gedeelte van de ader zonder vertakkingspunten.En maak een losse knoop op het proximale uiteinde van het adersegment. En een losse knoop aan het distale einde van het segment. Klem de ader proximale naar het hart, en ligate het distale uiteinde van de ader.Gebruik een irisschaar om een incisie te maken tussen de klem en de distale ligatuur. En, met een flap van de ader, introduceren een voorgevulde katheter op het punt waar de ader wordt geblokkeerd door de klem. Verwijder vervolgens de klem en duw de katheter enkele millimeters in de ader.Voor een tracheale buis plaatsing, gebruik botte tangen om de twee mandibulaire klieren die de sternohyoid spieren te scheiden. En scheid de sternohyoid spieren op de middellijn, om de luchtpijp bloot te leggen. Plaats drie, 4-0 ligaturen onder de luchtpijp, en maak twee knopen onder de tracheale buis invoegpunt en een knoop boven.Steek vervolgens een tracheale buis in de luchtpijp onder het derde tracheale kraakbeen. En zet de buis op zijn plaats met de vooraf voorbereide ligaturen. Om de achterste ledematen zenuwen te ontleden, gebruik maken van een nummer 21 mes om een longitudinale snede te maken op de achterste kant van de linker achterste ledemaat, van de achillespees naar de heup.En gebruik een schaar om een snede te maken tussen de voorste en achterste gebieden van de popliteal fossa, aan de achterkant van het kniegewricht. Snijd twee hoofden van de biceps femoris, om de heupzenuw bloot te leggen. En scheid het zijhoofd van het mediale hoofd van de gastrocnemiusspier, om de scheenzenuw en zijn takken bloot te leggen.Gebruik dan nummer 55 tangen, om de mediale gastrocnemius en de laterale gastrocnemius en soleus zenuwen zorgvuldig te ontleden. Loskoppelen van de omliggende weefsels met behoud van hun verbinding met de respectieve van de spieren. Om de laminectomie uit te voeren, gebruikt u een nummer 21-mes om een longitudinale incisie te maken van het heiligbeen tot aan de borstwervels.En identificeer de Th13 wervel, als een laagste thoracale segment met een rib inbrengen. Gebruik vervolgens fijne rongeurs om de spineuze processen en laminae van de Th13 naar de L2-wervels te verwijderen, om de lendensegmenten van het ruggenmerg bloot te leggen. Om de wervelkolom vast te stellen, plaats de rat in een op maat gemaakt frame op een 37 graden Celsius verwarmingskussen, aangesloten op een gesloten lus verwarmingssysteem.En gebruik de huidflappen om een diep zwembad over het blootgestelde ruggenmerg te vormen. Plaats metalen klemmen onder de Th12 dwarsprocessen, en op de L3 spinous processen, en vul het zwembad met 37 graden Celsius minerale olie. Gebruik de huidflappen om een diepe poel van minerale olie te maken over de blootgestelde scheenbeen, mediale gastrocnemius en laterale gastrocnemius en soleus zenuwen.En plaats de zenuwen op bipolaire zilverdraad stimulerende elektroden. Sluit vervolgens de elektroden aan op een vierkante pulsstimulator met behulp van afzonderlijke stimulatiekanalen voor elke zenuw. Voor een oppervlakteelektrode plaatsing, onder de ontledende microscoop, plaats een zilveren bal elektrode aan de linkerkant caudal kant van het blootgestelde ruggenmerg.Met een referentieelektrode in de rugspieren. En sluit beide elektroden aan op de differentiële DC-versterker. Gebruik een constante stroomstimulator om de mediale gastrocnemius en laterale gastrocnemius en soleus zenuwen te stimuleren, met vierkante pulsen van een duur van 0,1 milliseconde herhaald op een frequentie van drie hertz en observeer de afferentevolley's.Aan het einde van de simulatie, beweeg het oppervlak elektrode rostrally, en herhaal de stimulatie om de spinale segmenten waarop de amplitudes van de volleys zijn de hoogste voor elke zenuw te identificeren. Na het bepalen van de locatie van de maximale volley, leveren een neuromusculaire blokker intraveneus om de rat te verlammen. Terwijl een assistent de tracheale buis verbindt met een externe ventilator in lijn met een knaagdier compatibele cap nominator.Om de dura en pia mater te openen, gebruik nummer 55 tangen om de dura mater voorzichtig op te tillen en het weefsel caudally uit het L5-segment te snijden, rostrally tot aan het L4-segment. Gebruik vervolgens een paar ultradunne 5SF tangen, om een kleine patch in de pia te maken, die de rugkolom tussen de bloedvaten bedekt. Precies op het niveau van de maximale afferente volley van de mediale gastrocnemius en laterale gastrocnemius en soleus zenuw.Om de trans spinale directe stroom stimulatie elektroden te plaatsen, plaats een zoutoplossing gedrenkt spons op de rugzijde van de Th12 wervels. En gebruik fijne manipulatie om de spons te drukken met een actieve trans-spinale directe stroom stimulatie elektrode. Monteer vervolgens een aangepaste gepoolde micro-elektroneder, op de micro manipulator, waardoor een één tot twee micron stepping beweging en stereotaxic kalibratie.En rijden een micropipette tip in een geselecteerde patch in de pia, op een 15 tot 20 graden mediale laterale hoek. Om de motoneuron membraan en afvuren eigenschappen vast te leggen, in de brug modus van de intracellulaire versterker, stimuleren de respectieve zenuwtakken om de motoneuron te identificeren op basis van de alles of niets verschijning, van de antidriemische actie potentieel. In de discontinu huidige klemmodus van de intracellulaire versterker met een huidige schakelmodus van vier tot acht kilohertz, gebruikt u een intracellulaire depolariserende huidige pulsen van 0,5 milliseconde om een orthodontisch actiepotentieel op te roepen in de motoneuron.Om de celinvoerweerstand te berekenen, stimuleert u een motoneuron, met 40 korte pulsen van 100 milliseconden die een nanogramstroom hyperpolariseren. Om de werkelijke basiswaarde te bepalen als de minimale amplitude van de depolariserende stroom die nodig is om een enkele piek uit te lokken, stimuleert u een motoneuron met 50 milliseconde vierkante golfpulsen bij toenemende amplitudes. Injecteer vervolgens 500 milliseconde vierkante golfpulsen van depolariserende stroom, bij toenemende amplitudes.In 0,1 tot twee nanoversterkerstappen, om ritmische ontladingen van motoneurons op te roepen. Voor een trans-spinale directe stroom stimulatie, start de polarisatie procedures door trans-spinale toepassing van gelijkstroom, met behoud van een stabiele penetratie van de motoneuron. Hier wordt een typisch orthotropisch actiepotentieel getoond, opgeroepen door intracellulaire stimulatie die voldoet aan alle criteria voor het opnemen van gegevens.In deze analyse, een celreactie op een 100 milliseconde hyperpolariserende stroompuls van een nanogram. Van waaruit zowel de piek- als plateauinvoerweerstand van een motoneuron kan worden bepaald aan de hand van de spanningsafbuiging. Deze uitgebreide spanning spoor van een echte basispiek, vertoont een duidelijk gemarkeerde spanningsdrempel van de piek.Het niveau van membraandepolarisatie aangeven waarbij spanningsgated natriumkanalen worden geactiveerd om het actiepotentieel te starten. Deze grafieken geven voorbeelden van intracellulaire spanningssporen. Van twee motoneurons, gestimuleerd intracellulair met 500 milliseconde vierkante pulsen van depolariserende stroom.Voor, tijdens en na een trans-spinale directe stroom stimulatie toepassing. Anodale trans-spinale directe stroom stimulatie bleek te werken in de richting van een verhoogde motoneuron excitability en hogere frequenties van ritmisch vuren. Terwijl kathode trans-spinale directe stroom stimulatie, gehandeld om in de richting van het afvuren remming.Bovendien, de effecten van beide soorten trans-spinale directe stroom stimulatie, overleefde de periode van polarisatie. Onnauwkeurige gegevens kunnen worden verkregen, als de criteria voor gegevensopname worden gecompromitteerd als gevolg van onvolmaakte celpenetratie. Het niet compenseren van de micro-elektrodenweerstand en capaciteit of een instabiliteit van het ruggenmerg.Het is absoluut noodzakelijk dat er geen schade wordt aangericht aan het ruggenmerg tijdens de dissectie, omdat letsel kan leiden tot een spinale shock, waardoor verdere opnames onmogelijk zijn. Het is mogelijk om weefselmonsters te oogsten voor verdere histologische of immunocyto chemische analyse. Bijvoorbeeld, de meting van c-fos expressie kan worden gebruikt als een proxy van neuronale activiteit.

in-vivo-intracellular-recording-type-identified-rat-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze nieuwe methode maakt het gelijktijdig intracellulaire opname van een volwassen muis motoneuron en de meting van de kracht die door de spiervezels. De gecombineerde onderzoek van de elektrische en mechanische eigenschappen van motoreenheden in normale en genetisch gemodificeerde dieren is een doorbraak voor de studie van het neuromusculaire systeem.

Gelijktijdig Intracellulaire opnemen van een lumbale motoneuron en de kracht die door de motor in de volwassen muis<em&gt; In vivo</em

This video demonstrates the recording of electrical signals from single brain neurons using a fine-tipped glass micropipette and a specialized setup. The micropipette is carefully inserted into the rat's brain and is buzzed to penetrate the neuron to record internal neuronal electrical signals.

In Vivo Recording of Intracellular Signals from a Single Neuron

This video describes the in vivo intracellular recording of rat motoneurons under trans-spinal direct current stimulation. The protocol describes how to measure membrane properties and record the rhythmic firing of motoneurons before, during, and after anodal or cathodal polarization of the spinal cord.

Trans-Spinal Direct Current Stimulation of a Rat&#39;s Spinal Motoneuron

This video demonstrates the procedure for recording compound muscle action potential (CMAP) in rats by applying electrical stimuli to the ulnar nerve, adjusting electrodes for optimal signal, and increasing stimulation to assess nerve functionality. This method enables the in vivo investigation of the peripheral nerve functions in neurological disorders.

In Vivo Measurement of the Compound Muscle Action Potential in a Rat

This video demonstrates a single-fiber recording of C-fiber nerve conduction in rats. An anesthetized rat is incised to expose the sciatic nerve, which provides sensory and motor supply to the lower limbs. The individual C-fibers are then exposed. Electrical stimulation is provided using stimulus electrodes implanted in the foot, and a response is recorded from a single nerve fiber.

In Vivo Single-Fiber Recording of Sciatic Nerve C-Fibers in Rats

GABAergic presynaptische remming is een krachtig remmend mechanisme op het ruggenmerg belangrijk motorische en sensorische signalen integratie in ruggenmerg netwerken. Onderliggende primaire afferente depolarisatie kan worden gemeten door registratie van de dorsale wortel potentialen (DRP). Hier laten we een methode van in vivo opname van DRP in muizen.

Meten Spinal Presynaptische Remming in muizen door dorsale wortel Potentiële Recording<em&gt; In Vivo</em

We laten zien hoe we schuine plakjes van het ruggenmerg in jonge muizen bereiden. Deze voorbereiding maakt de stimulatie van de ventrale wortels mogelijk.

De Voorbereiding van de Oblique Spinal Cord Slices voor Ventral Root Stimulation

Single-Fiber opname is een effectieve elektrofysiologische techniek die toepasbaar is op de centrale en perifere zenuwstelsels. Samen met de voorbereiding van intact DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw, het mechanisme van geleiding falen wordt onderzocht. Beide protocollen verbeteren het begrip van de relatie van het perifere zenuwstelsel met pijn.

Gebruik van in vivo single-Fiber opname en intact dorsale wortel ganglion met bijgevoegde Sciatische zenuw om het mechanisme van geleidings falen te onderzoeken

Deze methode maakt het mogelijk de opname van de kracht van twitch en tetanische contracties en actie potentialen in drie soorten motorische eenheden in de rat mediale gastrocnemius spier. De functionele isolatie van een enkele motorunit wordt veroorzaakt door elektrische stimulatie van de axon.

Functionele isolatie van enkele motoreenheden van Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Dit protocol beschrijft een methode met behulp van een patch-clamp om de elektrische reacties van motorneuronen op ruggenmergstimulatie (SCS) met een hoge spatiotemporele resolutie te bestuderen, wat onderzoekers kan helpen hun vaardigheden te verbeteren bij het scheiden van het ruggenmerg en het tegelijkertijd handhaven van de levensvatbaarheid van de cel.

De ex vivo bereiding van een doorsnede van het ruggenmerg voor de opname van de patchklem in motorneuronen met hele cellen tijdens stimulatie van het ruggenmerg

We beschrijven een protocol voor spinale meerkanaals extracellulaire registratie naast het registreren en analyseren van de hartfunctie van de spinale dorsale hoornneuronen. Deze methode biedt een tijdelijk gesynchroniseerd kader voor het bestuderen van spinale mechanismen die ten grondslag liggen aan thoracale viscerale functionele veranderingen veroorzaakt door acupunctuur.

Studie van de coderende profielen van somatische stimulatie op cardiaal-vergrendelde neuronale responsen in de ruggengraatwervelkolom van de rat

Leer intracellulaire opname van rattenmotoneuronen tijdens trans-spinale directe stroomstimulatie. Deze methode onderzoekt membraaneigenschappen en ritmische vuurpatronen in volwassen zenuwstelsels voor neurorevalidatie.

In Vivo intracellulaire opname van type-geïdentificeerde Rat Spinal Motoneurons tijdens trans-spinale directe stroomstimulatie

Meer video's verkennen