Verbeterde UPLC-UV-methode voor de kwantificering van vitamine C in sla variëteiten(Lactuca sativa L.) en Crop Wild Relatives(Lactuca spp.)

Vitamine C is een indicator van de voedingswaarde van groenten en fruit. We hebben een eenvoudige en betrouwbare methode nodig om het te kwantificeren, vooral in sla, de meest geconsumeerde bladgroente ter wereld. Deze methode voorkomt vitamine C afbraak, en biedt een verbeterde extractie en een snelle, betrouwbare kwantificering van zowel ascorbic en dehydroascorbine zuren, dankzij de nauwkeurigheid en gevoeligheid.

Deze methode kan worden gebruikt in de voedingstechnologie om voedingsfeitetiketten te maken, in de geneeskunde om voedseleffecten op de gezondheid en in de plantenveredeling te bestuderen, om het vitamine C-gehalte bij verschillende soorten te verhogen. Het demonstreren van de procedure met Ines Medina Lozano, zal Jose Angel Aranjuelo en Arantzazu Castellanos, twee analisten van mijn laboratorium. Om de plantenmonsters voor te bereiden, oogst ten minste één buiten- en één binnenblad per plant en bevries onmiddellijk de bladeren in vloeibare stikstof, voordat u ze in min 80 graden Celsius-opslag plaatst.

Om de bevroren plantenmonsters te lyofiliëren, plaatst u de niet-afgedekte monsterbuizen op de trays in de vriesdrogerkamer van de lyofielieverf en programmeert u de lyofieler zoals aangegeven. Houd de condensortemperatuur op min 80,2 graden Celsius, en de vacuümconstante op 112 Wanneer het materiaal volledig droog is, voeg dan 10 millimeter roestvrijstalen ballen met een diameter van 10 millimeter toe aan de lyoffiele monsters, in 20 milliliter polypropyleenbuizen. En gebruik een Multi-Tube Vortexer, op het juiste moment en intensiteit, om de monsters te malen tot een fijn stof.

Om ascorbinezuurstandaardvoorraad en verdunningsoplossingen voor te bereiden, weegt u precies 10 milligram ascorbinezuurnorm op een precisiebalans. En op 90 milliliter mobiele fase naar het monster. Gebruik een magnetische roerder om het monster op te lossen en gebruik een volumetrische kolf om nauwkeurig 100 milliliter van de resulterende oplossing te meten.

Het toevoegen van extra ultrazuiver water, verzuurd bij pH twee met mierenzuur, indien nodig. Bereid vervolgens vijf verdunningen uit de voorraad, om een kalibratiecurve te verkrijgen. Werken onder een lage lichtintensiteit, voeg een 50 milligram lyophilized grondmonster en vijf milliliter extractie oplosmiddel, om een 15 milliliter polypropyleen centrifuge buis en vortex de oplossing voor vijf seconden.

Na het schudden van het monster gedurende 10 minuten op een orbitale shaker bij 2000 omwentelingen per minuut, breng de buis gedurende 10 minuten naar een ultrasoon bad, bij kamertemperatuur en verzamel het monster door centrifugatie. Dan stam de supernatant door middel van een 0,22 micron geregenereerde cellulose filter, in een vijf milliliter amber flacon, om zowel de ascorbic en dehydroascorbine zuren te extraheren in extract een. Om de verdunning voor te bereiden voor het bepalen van de ascorbinezuurconcentratie in de bladmonsters, voeg 200 microliter uittreksel één en 800 microliter ultrazuiver water toe in een twee milliliter amberachtige vloeibare chromatografie flacon en sluit u de flacon met een PTFE/siliconenplug.

Voor de totale ascorbinezuurextractie, breng 200 microliter van het extract een, in een twee milliliter amber vloeibare chromatografie flacon, en voeg 200 microliter van het verminderen van oplossing aan de flacon. Sluit de flacon met een stekker en vortex de oplossing voor vijf seconden. Na een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht, gebruik 200 microliters van 0,4 Molar zwavelzuur, om de reactie te stoppen en het ascorbinezuur te stabiliseren, tot een zure pH.

Om de verdunning voor te bereiden voor het bepalen van de totale ascorbinezuurconcentratie in de monsters, voeg 400 microliter ultrazuiver water toe aan het totale ascorbinezuurextract twee. Sluit de flacon met een stekker. Bevestig ten minste een uur voor aanvang van het experiment dat alle werkoplossingen in het UPLC-systeem zijn geladen en schakel de drie UPLC-modules in.

Wanneer het interne kalibratieproces is voltooid, opent u de software en laadt u het instrumentale programma. Zodra de software is geladen klik op Quaternary Solvent Manager en klik op de knop Met de rechtermuisknop om Startconsole te selecteren om toegang te krijgen tot de UPLC-beheerconsole. Klik op Systeem, Controle en Opstarten, om door te gaan tot de voorbereiding en stabilisatie van het UPLC-instrument en klik op Prime Solvents, QSM, controleer A, B, C, D, Seal Wash en Duur van Prime, groter dan vijf minuten, om alle UPLC-lijnen gedurende ten minste vijf minuten te zuiveren.

Klik op SM, controleer Wash Solvent groter dan 45 seconden. Controleer Purge Solvent, en 35 cycli te zuiveren en schoon te maken van de injector. Als u de UPLC wilt equiliberen met de methodevoorwaarden, controleert u Equilibrate naar Methode en QSM en stelt u de stroom in op 0,3 milliliter per minuut.

Oplosmiddel A tot 2%solvent B tot 0%solvent C 98%en oplosmiddel D tot 0%Nog steeds in Equilibrate naar Method en SM en stel de steekproef in op 5 graden Celsius, en de kolom op 30 graden Celsius. Selecteer Lamp aan en klik op Start. Laat de apparatuur minstens een uur stabiliseren.

Als u de stabiliteit wilt controleren, klikt u op Consolesysteem starten en QSM en selecteert u QSM-systeemdruk, alleen om de druk in de kolom te controleren. Als er geen identificeerbare trends in de druk veranderingen, en de delta waarde is minder dan 10 pond per vierkante inch van de druk, in het snelle startscherm, vul de matrix met de namen van de normen en monsters worden geanalyseerd. Om de ascorbinezuurconcentratie in de normen te bepalen, injecteer u vijf microliter van elke verdunning in het UPLC-instrument en voert u de chromatografie uit, vanaf de meest verdunde, tot de meest geconcentreerde oplossing zoals aangegeven in de tabel.

Om het ascorbinezuur en de totale ascorbinezuurconcentratie in de bladmonsters te bepalen, injecteer u vijf microliters van het verdunde extract één en extrahert twee in het UPLC-instrument voor chromatografische analyse. Om de ascorbinezuur en totale ascorbinezuurconcentraties te berekenen, klikt u in de software op Quickstart, Browse Project, Kanalen, de naam van de standaard of het monster en PDA-kanaal één, 245 nanometer op 1,2 nanometer. Als u de standaard- en monsterchromatogrammen wilt openen, klikt u op het beginpunt van het chromatogram en sleept u deze naar het eindpunt om de overeenkomstige piek in de normen en monsters te integreren.

Gebruik vervolgens de gegevens van de ascorbinezuurstandaardverdunningen, om een kalibratiecurve op te bouwen, om de chromatografisch bepaalde absorptiewaarden weer te geven en de absorptiewaarden van het monster te interpoleren, om het ascorbinezuur en de totale ascorbinezuurconcentratie te verkrijgen, volgens de formule. Vitamine C kwantificering in Lactuca matrices, vereist de ontwikkeling van een chromatografische aanpak die betrouwbare resultaten kan garanderen. Hier kan een chromatogram als gevolg van een niet-geoptimaliseerd protocol presenteren en ascorbine zuur piek, samen met een niet-geïdentificeerde op mijnwerker schouder kan worden waargenomen.

Niettemin, na het verbeteren van de extractie en chromatografische omstandigheden, kan een opgeloste ascorbinezuurpiek zonder interferenties van onbekende verbindingen worden bereikt. Bovendien vermindert het gebruik van UPLC ultraviolette apparatuur, in plaats van HPLC ultraviolet, de retentie- en gebruikstijden. Storingen in ascorbinezuurpieken leiden consequent tot onderschatting van het vitamine C-gehalte, als gevolg van een onvoldoende scheiding tijdens het chromatografische proces.

Als de overlappende piekgebieden worden geïntegreerd door een verticale daling op het diepste punt tussen hen. Bovendien voorkomt het gebruik van een niet-geoptimaliseerd protocol de extractie van een nuttige conclusie, uit de resultaten. Zoals alle monsters lijken te hebben een soortgelijk vitamine C-gehalte, in een van de vormen.

Met behulp van het geoptimaliseerde protocol kunnen statistisch significante verschillen tussen de verschillende soorten monsters worden gedetecteerd. Zorg ervoor dat u meerdere monsters te verzamelen, om de monsters correct te bewaren, om de blootstelling van de steekproef aan oxiderende stoffen te minimaliseren en om beide vormen van vitamine C te kwantificeren.Het totale vitamine C-gehalte kan niet alleen worden gekwantificeerd in elke plantensoort, maar ook, in alle vruchten in een groenten en fruit, of zelfs verwerkt voedsel met weinig techniek wijzigingen.