Differentiatie en karakterisering van neurale voorlopercellen en neuronen uit embryonale stamcellen van muizen

Naast het protocol voor differentiatie van muis embryonale stamcellen tot neuroncellen, laten we ook een reeks experimenten zien die het differentiatieproces volledig kunnen analyseren. Deze technieken zijn relevant voor vroege ectodermische embryonale ontwikkeling en bieden onderzoekers mogelijkheden om de differentiatie van neuroncellen te analyseren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het essentieel om te beginnen met stamcellen in optimale conditie.

Daarom is het belangrijk dat de EB's, MPC's en neuronen worden gekweekt in vers en optimaal medium. Visuele demonstratie van dit protocol is belangrijk, omdat het kleine details bevat die van invloed kunnen zijn op het succes en de effectiviteit, vooral het differentiatiedeel. Begin met het opzetten van een druppelcultuur voor celcultuur.

Voor een 10-centimeter celcultuurplaat, pas de concentratie aan tot 500 cellen per 20 microliter differentiatiemedium. Bereid voldoende celsuspensie voor voor 50 druppels van 20 microliter. Gebruik een micropipet of een herhalingspipet om 20 microliter druppels celsuspensie op het deksel van een weefselkweekplaat te plaatsen, ervoor zorgen dat de druppels niet te dicht bij elkaar zijn, om te voorkomen dat ze samensmelten.

Vul de plaat met vijf tot 10 milliliter PBS en zet het deksel voorzichtig weer op de plaat. Incubeer de cultuur in de 37 graden Celsius incubator. Na twee dagen, verzamel de druppels van het deksel en plaats ze in een 10-centimeter celcultuur suspensieplaat gevuld met 10 milliliter differentiatiemedium, en zet de plaat vervolgens op een orbitale shaker ingesteld op lage snelheid in de incubator.

Na nog eens twee dagen, centrifugeer de cellen bij 200 keer G gedurende drie minuten en verwijder het supernatant. Om embryoïd lichaamsdifferentiatie in neurale stamcellen te induceren, resuspendeer de cellen in differentiatiemedium met vijf micromolair retinoïnezuur. Incubeer de plaat gedurende twee dagen, en vervang vervolgens de minste helft van het medium door vers medium door de plaat te kantelen en het uit te pipetten.

Verzamel de cellen twee dagen later door ze gedurende drie minuten bij 200 keer G te centrifugeren en het supernatant te verwijderen. Fixeer de embryoïd lichamen en neurale stamcellen met 4%PFA in PBS gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de PFA en was de cellen gedurende vijf minuten in PBS.

Incubeer de cellen seriëel in PBS 10, 20 en 30% sucrose oplossingen, bij 25 tot 28 graden Celsius, met elke incubatie die 30 minuten of langer duurt totdat de cellen zich aan de bodem van de buis nestelen. En gebruik het om het monster naar het centrum van een Cryomold te brengen, het overtollige vocht eruit pipet. Voeg voorzichtig optimum snijtemperatuur of OCT oplossing toe aan de mal, zonder het monster opnieuw te suspenderen, en verwijder vervolgens overtollige luchtbellen met een pipet.

Plaats de mal met het monster op een laboratoriummixer op lage snelheid gedurende 15 minuten, waardoor de embryoïd lichamen en neurale stamcellen zich aan de bodem van de OCT oplossing nestelen. Vries dan snel het monster in door de mal in vloeibare stikstof te plaatsen. Blokkeer OCT secties of kweekkamers die neuronen bevatten in 10% normaal ezelsserum en 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Bekijk vervolgens de monsters in primaire antilichamen, verdund in 5% normaal ezelsserum en 0,05% Triton X-100 in PBS, bij vier graden Celsius gedurende de nacht. Was de volgende dag de monsters in PBS met 0,1% Triton X-100 drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt. Incubeer ze met secundair antilichaam, verdund in 5% normaal ezelsserum en 0,05% Triton X-100 in PBS, gedurende een uur bij kamertemperatuur.

Herhaal de wasbeurten in Triton X-100 en PBS, en incubeer vervolgens het monster in één microgram per milliliter DAPI. Monteer het monster met een dekglas en wat montagemedium, laat het drogen en beeld het af met een fluorescentiemicroscoop. Om neurondifferentiatie uit te voeren, werden E14 cellen gekweekt op gamma-geïrradieerd muis embryonale fibroblasten totdat de fibroblastpopulatie verdund was.

De pluripotentie van de E14 cellen werd bevestigd met alkalische fosfataseverkleuring. Na differentiatie hadden embryonale lichamen een ronde vorm die continu in omvang toenam. Op dag 10 hadden neurale stamcellen die zich tot neuronen ontwikkelden een langwerpige celvorm.

Immunofluorescence experimenten werden uitgevoerd op neurale stamcellen op dag acht en op neuronen op dag 12. Positieve kleuring werd waargenomen voor nestvorming in neurale stamcellen en voor neurofilament in neuronen. Een muis embryonale stamcel lijn die een Sox1 promotor-aangedreven GFP reporter tot expressie brengt werd gedifferentieerd, en flowcytometrie werd uitgevoerd op de embryonale stamcellen en neurale stamcellen.

Er werd gevonden dat 58,7% van de totale cellen in het NPC-stadium GFP-positief is, terwijl 0% GFP-positief is in het ESC-stadium. RNA sequentie experimenten werden uitgevoerd op E14 embryonale stamcellen, embryoïd lichamen en neurale stamcellen. De genen in de RNA sequentie heatmap werden gesorteerd op basis van hun expressieniveaus.

Gene ontologie analyse van de vier genclusters toonde aan dat ze corresponderen met verschillende cellulaire functies of paden. Bij het uitvoeren van dit protocol, moeten EBS eruit zien als sferische, verdonkerde cellenmassa's. Om ervoor te zorgen dat EBS met zodanig groeit, ververs het medium op dag een, als het medium geel begint te worden.

Dezelfde aanpak is belangrijk voor MPC-kweek, aangezien zowel EB's als MPC's zich in een kritisch stadium van vroege embryonale ontwikkeling bevinden. Andere functionele genomische assays, zoals ChIPseek en chromatine bevestigingsvangst assays uit de verschillende stadia van neurondifferentiatie, kunnen worden uitgevoerd om de onderliggende biologische processen te begrijpen. Integratie van chemische en functionele genoomonderzoeken in het neurondifferentiatieproces, stelt onderzoekers in staat om de moleculaire mechanismen van vroege embryonale ontwikkeling beter te omschrijven.