Name: Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Leer indirecte immunofluorescentie om DNA-reparatie-eiwitten te detecteren en hun ruimtelijke en temporele rekrutering in HeLa-cellen te analyseren. Deze methode maakt kwantificering van colocalisatie en eiwit-eiwitinteracties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de San Antonio Area Foundation. Het Mays Cancer Center wordt ondersteund door NCI kankercentrum ondersteuning kern subsidie P30 CA054174. We willen Stephen Holloway bedanken voor zijn hulp bij het inkopen van de reagentia, en het Sung laboratorium voor het verstrekken van ruimte en microscopie capaciteit.

1. HeLa celcultuur
<ol><li>Voorbehandel ronde glazen coverslips met 1 M HCl bij 50 °C gedurende 16-18 uur. Spoel af met ddH2O en bewaar in 100% EtOH.</li>
	<li>Bereid celkweekmedium voor: voeg 10% (v/v) FBS toe aan DMEM medium.</li>
	<li>Kweek 4,0 x 104 cellen/put in steriele 12-put plaat met een 18 mm ronde glazen coverslip bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde couveuse. Groei cellen tot 80% samenvloeiing (ongeveer 24 uur).</li>
</ol>2. Celbehandeling met straling (IR)
<ol><li>Om de vorming van dubbelstrengbreuken te veroorzaken, stelt u cellen bloot aan 4 Gy γ-bestraling (controle: Geen bestraling, t=0). In de Gamma Cell -40 komt dit overeen met 4,54 min, op 0,815 Gy per min.</li>
	<li>Incubeercellen bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde couveuse voor de juiste tijdsduur (hier gekozen tijdstippen t=1, 2, 4, 16 h).</li>
</ol>3. Nucleaire extractie en celfixatie
<ol><li>Bereid voorraadoplossingen voor: 0,2 M PIPES (pH 6.8), 5 M NaCl, 2 M sacharose, 1 M MgCl2, 0,1 M EGTA (pH 8.0).</li>
	<li>Bereid nucleaire extractiebuffer (NEB) voor: los 10 mM PIPES (pH 6.8), 100 mM NaCl, 300 mM sucrose, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA (pH 8.0) en 0,5% (v/v) Triton X-100 in ddH2O. Mix volledig opgelost.</li>
	<li>Bereid 4% (v/v) paraformaldehyde (PFA) voor: los 10 mL van 16% PFA waterige oplossing op in 30 mL PBS. Meng tot volledig opgelost.</li>
	<li>Op het juiste tijdstip (t=0, 1, 2, 4, 16 h), was cellen twee maal met 1 mL PBS. Verwijder PBS volledig.</li>
	<li>Voeg 200 μL NEB toe aan elke put voor celkernenextractie (cytoplasma wordt afgebroken, alleen kern blijft over) (figuur 2). Incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur en verwijder volledig. LET OP: Niet langer dan 2 minuten.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig02.jpg"> Figuur 2: Nucleaire winning. Representatieve afbeeldingen van cellen voorafgaand aan (links) en post (rechts) nucleaire extractie. Cytoplasma moet worden verteerd, maar de nucleaire structuur moet intact blijven na de extractie (rechts). A) 20x vergroting; schaalbalk = 20 μm en (B) 40x vergroting; schaalbalk = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<ol start="6"><li>Was cellen met 1 mL PBS. Verwijder PBS volledig. Voeg PBS zorgvuldig, cellen zijn zeer kwetsbaar bij deze stap.</li>
	<li>Voeg 200 μL van 4% (v/v) PFA toe aan elke put voor celfixatie. Incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder PFA volledig.</li>
	<li>Voeg 1 mL PBS toe. LET OP: Cellen kunnen worden opgeslagen in PBS bij 4 °C.</li>
</ol>4. Kleuring van immunofluorescentie
<ol><li>Voormaken van blokkeringsoplossing: los 5% BSA (w/v) op in PBS en voeg 0,3% (v/v) Triton X-100 toe. Meng tot volledig opgelost.</li>
	<li>Bereid verdunningsbuffer voor: los 1% BSA (w/v) op in PBS en voeg 0,3% (v/v) Triton X-100 toe. Meng tot volledig opgelost.</li>
	<li>Voeg voor het blokkeren 200 μL blokkeringsoplossing toe aan elke put. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 16-18 uur bij 4 °C. OPMERKING: Als geitenantilichaam wordt gebruikt, voegt u 5% geitenserum toe aan de blokkeringsoplossing.</li>
	<li>Verdun het primaire antilichaam in verdunningsbuffer (1:500; zie tabel 2 voor de lijst met antilichamen) en vortex tot ze goed gemengd zijn. OPMERKING: Als geitantilichaam wordt gebruikt, voeg dan 1% geitenserum toe aan de verdunningsbuffer.</li>
	<li>In een vochtigheids-/incubatiedoos, hechten een stuk parafilm. Voeg 10 μL primair antilichaam toe (in één druppel). Lijn een rand van de coverslip met de druppel en langzaam lager op de parafilm, voor de vloeistof te verspreiden over (vermijd bubbels indien mogelijk). Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Was covers drie keer in PBS gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Verdun secundair antilichaam in verdunningsbuffer (uiteindelijke concentratie: 2 μg/mL) en vortex tot het goed gemengd is.</li>
	<li>Breng 10 μL secundair antilichaam aan zoals beschreven voor de primaire antilichamen. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur. LET OP: Bescherm tegen licht.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antilichaam</td>
			<td>Bedrijf</td>
			<td>Verwijzing</td>
			<td>Bron</td>
		</tr>
<tr>
<td>53BP1</td>
			<td>Celsignalering</td>
			<td>4937</td>
			<td>Konijn</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam Abcam</td>
			<td>ab150103</td>
			<td>Ezel</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-fosfo-Histone H2A. X (Ser139), kloon JBW301</td>
			<td>Millipore Millipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td>Muis</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam Abcam</td>
			<td>ab150081</td>
			<td>Geit</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Gebruikte antilichamen. Lijst van antilichamen die in deze studie worden gebruikt.
<ol start="9"><li>Was covers drie keer in PBS gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Was coverslips met H2O gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Counterstain DNA met DAPI: breng 10 μL van 300 nM DAPI (zoals beschreven voor antilichamen), incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en monteer vervolgens op glazen schuif met een op glycerol gebaseerde montagemedia. U ook één druppel (10 μL) van commerciële antifademontagemedia met DAPI op een dia toevoegen en een coverslip aanbrengen. Druk voorzichtig op de coverslip en verwijder overtollig vocht eromheen met een papieren handdoek.</li>
	<li>Verzegel coverslips met transparante nagellak en laat ze 20 minuten drogen.</li>
	<li>Bewaar dia's bij 4 °C.</li>
</ol>5. Beeldacquisitie
<ol><li>Plaats een druppel onderdompelingsolie op de 60x objectieve lens. Gebruik DAPI om de kernen te lokaliseren door middel van oogstuk.<ol>
<li>Voor XYZ-beeldacquisitie, open acquisitiesoftware en geselecteerde parameters: Scannertype: Galvano; Scannermodus: rondreis; Afbeeldingsgrootte: 512×512; PMT-modus: VBF; PMT gemiddeld: frame (4 keer); PMT sequentiële scan: lijn.</li>
		<li>Selecteer de kleurstof en de detectoren: Kanaal (CH1), Kleurstof (DAPI), Detector (SD1) Kanaal (CH2), Kleurstof (Alexa Fluor 488), Detector (HSD3) Kanaal (CH3), Kleurstof (Alexa Fluor 647), Detector (HSD4)</li>
		<li>Selecteer AAN in 'Z'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pas de live-afbeelding aan. Druk op de knop Live in het live-venster.<ol>
<li>Pas de focus aan en stel laserintensiteit in (%), gevoeligheid (HV), gain en offset op het gereedschapsvenster "PMT".<ol>
<li>Pas de laserintensiteit aan (%): voor helderheid en bleken. Hoe hoger de laserintensiteit, hoe sterker het signaal, maar het monster zal fotobleach.</li>
			<li>Pas de gevoeligheid (HV): geluidsniveau aan. Hoe hoger de HV, hoe sterker het signaal, maar het beeld zal luidruchtig zijn als te hoog. LET OP: Houd de spanning altijd constant.</li>
			<li>Pas de verschuiving aan: achtergrondniveau.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Selecteer Start/einde (15 segmenten) voor Z-stapels.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Start de overname.<ol>
<li>Selecteer de map om afbeeldingen op te slaan. Druk op de LSM-startknop om de afbeelding te verkrijgen. Druk op de knop Series Done om de afbeeldingsverwerving te voltooien.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Gegevensanalyse
<ol><li>Open de analysesoftware voor beeldanalyse.<ol>
<li>Druk op het gereedschapsvenster Batch, selecteer de afbeeldingen die u wilt analyseren en selecteer uitvoermap.</li>
		<li>Druk op het venster Van het gereedschap Analyse en selecteer Projectie (geeft de maximale intensiteitsprojectie van 15 segmenten weer).</li>
		<li>Selecteer onder Instelling invoer/uitvoerde gemaakte batch.</li>
		<li>Druk op Proces om afbeeldingen te verwerken.</li>
		<li>Afbeeldingen exporteren als .tiff-bestanden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor nucleaire foci kwantificering, open CellProfiler.<ol>
<li>Open de γH2AX en 53BP1 foci quantification pipeline (zie Aanvullende informatie).</li>
		<li>Grafiekgegevens met behulp van een tabelsoftware.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Open CellProfiler voor colokalisatieanalyse.<ol>
<li>Open de Colocalisatiepijplijn (zie Aanvullende informatie). Er wordt een spreadsheetbestand gemaakt en opgeslagen op de gewenste locatie. Grafieken zelf worden echter niet automatisch opgeslagen. Er wordt voorgesteld om een momentopname van de vensters te nemen om bij te houden voor het registreren van de resultaten.</li>
		<li>Grafiekgegevens met behulp van een tabelsoftware.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Prakash, R., Zhang, Y., Feng, W., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+human+health%3A+the+roles+of+BRCA1%2C+BRCA2%2C+and+associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and human health: the roles of BRCA1, BRCA2, and associated proteins.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (4), 016600(2015).</li>
<li>Jalan, M., Olsen, K. S., Powell, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Roles+of+RAD52+in+Genome+Maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Emerging Roles of RAD52 in Genome Maintenance.</a> Cancers (Basel). 11 (7), (2019).</li>
<li>Oh, J., Symington, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+Mre11+Complex+in+Preserving+Genome+Integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Role of the Mre11 Complex in Preserving Genome Integrity.</a> Genes (Basel). 9 (12), (2018).</li>
<li>Uziel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+MRN+complex+for+ATM+activation+by+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage.</a> The EMBO Journal. 22 (20), 5612-5621 (2003).</li>
<li>Lee, J. H., Paull, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATM+activation+by+DNA+double-strand+breaks+through+the+Mre11-Rad50-Nbs1+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex.</a> Science. 308 (5721), 551-554 (2005).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 5858-5868 (1998).</li>
<li>Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-H2AX+in+recognition+and+signaling+of+DNA+double-strand+breaks+in+the+context+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">γ-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin.</a> Nucleic Acids Research. 36 (17), 5678-5694 (2008).</li>
<li>Martin, O. A., Pilch, D. R., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2AX+in+DNA+damage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Histone H2AX in DNA damage repair.</a> Cancer Biology & Therapy. 2 (3), 233-235 (2003).</li>
<li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-916 (1999).</li>
<li>Stucki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+directly+binds+phosphorylated+histone+H2AX+to+regulate+cellular+responses+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks.</a> Cell. 123 (7), 1213-1226 (2005).</li>
<li>Lou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDC1+maintains+genomic+stability+by+participating+in+the+amplification+of+ATM-dependent+DNA+damage+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">MDC1 maintains genomic stability by participating in the amplification of ATM-dependent DNA damage signals.</a> Molecular Cell. 21 (2), 187-200 (2006).</li>
<li>Chapman, J. R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospho-dependent+interaction+between+NBS1+and+MDC1+mediate+chromatin+retention+of+the+MRN+complex+at+sites+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Phospho-dependent interaction between NBS1 and MDC1 mediate chromatin retention of the MRN complex at sites of DNA damage.</a> EMBO Reports. 9 (8), 795-801 (2008).</li>
<li>Melander, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+SDT+repeats+in+the+MDC1+N+terminus+triggers+retention+of+NBS1+at+the+DNA+damage-modified+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of SDT repeats in the MDC1 N terminus triggers retention of NBS1 at the DNA damage-modified chromatin.</a> Journal of Cell Biology. 181 (2), 213-226 (2008).</li>
<li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+DNA+repair+throughout+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of DNA repair throughout the cell cycle.</a> Nature Review. Molecular Cell Biology. 9 (4), 297-308 (2008).</li>
<li>Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+double-strand+breaks+by+end+joining%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Repair of double-strand breaks by end joining.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757(2013).</li>
<li>Mehta, A., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sources+of+DNA+double-strand+breaks+and+models+of+recombinational+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Sources of DNA double-strand breaks and models of recombinational DNA repair.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (9), 016428(2014).</li>
<li>Symington, L. S., Gautier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+break+end+resection+and+repair+pathway+choice%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-strand break end resection and repair pathway choice.</a> Annual Review of Genetics. 45, 247-271 (2011).</li>
<li>Huertas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+resection+in+eukaryotes%3A+deciding+how+to+fix+the+break%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA resection in eukaryotes: deciding how to fix the break.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (1), 11-16 (2010).</li>
<li>Nimonkar, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BLM-DNA2-RPA-MRN+and+EXO1-BLM-RPA-MRN+constitute+two+DNA+end+resection+machineries+for+human+DNA+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">BLM-DNA2-RPA-MRN and EXO1-BLM-RPA-MRN constitute two DNA end resection machineries for human DNA break repair.</a> Genes & Development. 25 (4), 350-362 (2011).</li>
<li>Garcia, V., Phelps, S. E. L., Gray, S., Neale, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+resection+of+DNA+double-strand+breaks+by+Mre11+and+Exo1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bidirectional resection of DNA double-strand breaks by Mre11 and Exo1.</a> Nature. 479 (7372), 241-244 (2011).</li>
<li>Sturzenegger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA2+cooperates+with+the+WRN+and+BLM+RecQ+helicases+to+mediate+long-range+DNA+end+resection+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA2 cooperates with the WRN and BLM RecQ helicases to mediate long-range DNA end resection in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (39), 27314-27326 (2014).</li>
<li>Daley, J. M., Niu, H., Miller, A. S., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+mechanism+of+DSB+end+resection+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">Biochemical mechanism of DSB end resection and its regulation.</a> DNA Repair. 32, 66-74 (2015).</li>
<li>Sartori, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CtIP+promotes+DNA+end+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human CtIP promotes DNA end resection.</a> Nature. 450 (7169), 509-514 (2007).</li>
<li>Chen, L., Nievera, C. J., Lee, A. Y. L., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+complex+formation+of+BRCA1-CtIP-MRN+is+important+for+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent complex formation of BRCA1-CtIP-MRN is important for DNA double-strand break repair.</a> Journal of Biological Chemistry. 283, 7713-7720 (2008).</li>
<li>Yun, M. H., Hiom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CtIP-BRCA1+modulates+the+choice+of+DNA+double-strand+break+repair+pathway+throughout+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CtIP-BRCA1 modulates the choice of DNA double-strand break repair pathway throughout the cell cycle.</a> Nature. 459 (7245), 460-463 (2009).</li>
<li>Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+homologous+recombination%3A+mediators+and+helicases+take+on+regulatory+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of homologous recombination: mediators and helicases take on regulatory functions.</a> Nature Review. Molecular Cell Biology. 7, 739-750 (2006).</li>
<li>San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+eukaryotic+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of eukaryotic homologous recombination.</a> Annual Review of Biochemistry. 77, 229-257 (2008).</li>
<li>Jasin, M., Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repair+of+strand+breaks+by+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Repair of strand breaks by homologous recombination.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (11), 012740(2013).</li>
<li>Dynan, W. S., Yoo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Ku+protein+and+DNA-dependent+protein+kinase+catalytic+subunit+with+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Interaction of Ku protein and DNA-dependent protein kinase catalytic subunit with nucleic acids.</a> Nucleic Acids Research. 26 (7), 1551-1559 (1998).</li>
<li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li>
<li>Cejka, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+end+resection%3A+nucleases+team+up+with+the+right+partners+to+initiate+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA end resection: nucleases team up with the right partners to initiate homologous recombination.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 22931-22938 (2015).</li>
<li>Mirman, Z., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1%3A+a+DSB+escort%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">53BP1: a DSB escort.</a> Genes & Development. 34, 7-23 (2020).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+requirement+for+53BP1+in+the+biological+response+to+genomic+instability+induces+by+BRCA1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A selective requirement for 53BP1 in the biological response to genomic instability induces by BRCA1 deficiency.</a> Molecular Cell. 35 (4), 534-541 (2009).</li>
<li>Zimmermann, M., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1%3A+Pro+choice+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">53BP1: Pro choice in DNA repair.</a> Trends in Cell Biology. 24 (2), 108-117 (2014).</li>
<li>Mavragani, I. V., Nikitaki, Z., Kalospyros, S. A., Georgakilas, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+Radiation+and+Complex+DNA+Damage%3A+From+Prediction+to+Detection+Challenges+and+Biological+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Ionizing Radiation and Complex DNA Damage: From Prediction to Detection Challenges and Biological Significance.</a> Cancers (Basel). 11 (11), (2019).</li>
<li>Nikitaki, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+complex+DNA+damage+induction+and+repair+in+human+cellular+systems+after+exposure+to+ionizing+radiations+of+varying+linear+energy+transfer+%28LET%29%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Measurement of complex DNA damage induction and repair in human cellular systems after exposure to ionizing radiations of varying linear energy transfer (LET).</a> Free Radical Research. 50, sup1 64-78 (2016).</li>
<li>Redon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H2A+variants+H2AX+and+H2AZ%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Histone H2A variants H2AX and H2AZ.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 12 (2), 162-169 (2002).</li>
<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA Repair. 3 (8-9), 959-967 (2004).</li>
<li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).</li>
<li>Sy, S. M. H., Huen, M. S. Y., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+is+an+integral+component+of+the+BRCA+complex+required+for+homologous+recombination+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">PALB2 is an integral component of the BRCA complex required for homologous recombination repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (17), 7155-7160 (2009).</li>
<li>Buisson, R., Masson, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+self-interaction+controls+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PALB2 self-interaction controls homologous recombination.</a> Nucleic Acids Research. 40 (20), 10312-10323 (2012).</li>
<li>Belotserkovskaya, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PALB2+chromatin+recruitment+restores+homologous+recombination+in+BRCA1-deficient+cells+depleted+of+53BP1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">PALB2 chromatin recruitment restores homologous recombination in BRCA1-deficient cells depleted of 53BP1.</a> Nature Communications. 11 (1), 819(2020).</li>
<li>Betts, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+CUPID1+and+CUPID2+mediate+breast+cancer+risk+at+11q13+by+modulating+the+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs CUPID1 and CUPID2 mediate breast cancer risk at 11q13 by modulating the response to DNA damage.</a> American Journal of Human Genetics. 101 (2), 255-266 (2017).</li>
<li>Dray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+enhancement+of+the+meiotic+DMC1+recombinase+by+RAD51+associated+protein+1+%28RAD51AP1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for enhancement of the meiotic DMC1 recombinase by RAD51 associated protein 1 (RAD51AP1).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (9), 3560-3565 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Analyse van de timing en efficiëntie van DNA schade reparatie door microscopie is essentieel gebleken om te begrijpen hoe de DNA-reparatie machines functioneren, in normale cellen en in menselijke pathologieën zoals kanker.
De ontwikkeling van specifieke antilichamen die detectie van actieve eiwitten in hun fosforyleerde versie mogelijk maken (zoals γH2AX, pRPA, pRAD50 en anderen10,23,39,<s...

Menselijke cellen worden voortdurend blootgesteld aan een verscheidenheid van DNA-schadelijke stoffen van verschillende oorsprong. Exogene bronnen bestaan meestal uit blootstelling aan straling, chemicaliën (waaronder chemotherapeutische agentia en sommige antibiotica), en virussen, terwijl de belangrijkste endogene bronnen fouten in DNA-replicatie en oxidatieve stress omvatten. De directe effecten van genotoxische blootstelling kunnen variëren van een gewijzigde basis tot een potentieel dodelijke DNA double-strand break (DSB), afhankelijk van de stress en de blootstellingsdosis. Uiteindelijk kan niet-gerepareerde of verkeerd gerepareerde DNA-schade leiden tot de accumulatie van mutaties, genomische herschikkingen, instabiliteit van het genoom en uiteindelijk leiden tot carcinogenese1. Zoogdiercellen hebben complexe paden ontwikkeld om specifieke soorten DNA-schade2,,3 te herkennen en ze tijdig te herstellen, gesynchroniseerd met de progressie van de celcyclus.
Ioniserende straling (IR) beschadigt de DNA dubbele helix en creëert dubbelstrengbreuken (DSB's), een van de meest schadelijke vormen van DNA-schade. Het MRN -complex (MRE11, RAD50, NBS1) functioneert als een sensor van DNA-uiteinden en activeert het eiwit kinase ataxie telangiectasia gemuteerd (ATM)4,5. Na de eerste activering van ATM door DNA-einden, ACTIVEert ATM een cascade van DDR-gebeurtenissen op de plaats van de pauze, initiërend met een belangrijke gebeurtenis, de fosforylatie van de histonevariant H2AX6. H2AX fosforylatie op residu S139 activeert het in γH2AX, verspreid over regio's tot megabases rond de DNA-laesie6,7,8,9. Deze gebeurtenis verhoogt de toegankelijkheid van DNA, wat leidt tot de werving en accumulatie van andere DNA-reparatieeiwitten7. Omdat γH2AX overvloedig en specifiek wordt geïnduceerd omliggende DSB's, kan het gemakkelijk worden gevisualiseerd met behulp van specifieke antilichamen, en wordt vaak gebruikt als surrogaat marker voor DSB's in het DNA-reparatieveld. Zodra de breuk is gesignaleerd, activeren cellen hun DNA-hersteltrajecten en verwerken ze de DNA-schade. Het eiwit MDC1 (bemiddelaar van DNA-schadepostwit 1) bindt direct γH2AX10, interageert met ATM11 en ook met NBS112,13. Het draagt bij aan het verhogen van de concentratie van MRN-complex bij de DSB en het initiëren van een positieve ATM-feedbacklus. γH2AX wordt snel verwijderd zodra de breuk is gerepareerd, waardoor de DSB-klaring kan worden gecontroleerd. Gevolgd door microscopie, de daling van γH2AX na verloop van tijd zorgt voor een indirecte meting van resterende breuken en DNA-reparatie efficiëntie.
Eukaryotische cellen kunnen DSB's via verschillende trajecten herstellen, waarbij de twee belangrijkste niet-homologe end-joining (NHEJ) en homologe recombinatie (HR)(figuur 1)zijn. NHEJ ligat in wezen DNA dubbelstrengeinden zonder het gebruik van uitgebreide homologie en werkt gedurende de celcyclus14,15. HR wordt overheersend tijdens S- en G2-fasen, en wordt anders onderdrukt, omdat het een zuster chromatid vereist als een homologe sjabloon voor reparatie14,16. De keuze van het traject tussen NHEJ en HR hangt niet alleen af van de fysieke nabijheid van de zusterchromatoïde, maar ook van de uitbreiding van DNA-eindresectie17, wat NHEJ remt.
Homologie-afhankelijke DSB reparatie initieert door nucleolytische afbraak van de 5 'streng van de pauze eindigt op het genereren van 3 'single-streng DNA (ssDNA) staarten, een proces aangeduid als 5 '-3' resectie. Het MRN-complex initieert DNA-eindresectie en verdere resectie wordt verwerkt in combinatie met BLM/EXO1 (Bloom syndrome protein/exonuclease 1) of BLM/DNA2 (DNA-replicatie ATP-afhankelijke helicase/nuclease)18,19,20,21,22. DNA-eindresectie wordt versterkt door CtIP (CtBP-interactief eiwit) door de directe interactie met MRN complex23 en rekrutering van BRCA1 (borstkanker type 1 gevoeligheideiwit)24,25. Replicatie-eiwit A (RPA) bindt zich onmiddellijk aan de blootgestelde ssDNA en wordt vervolgens verplaatst door het recombinase-eiwit RAD51 om een nucleoproteïne filament te vormen dat homologe zoek- en strenginvasie katalyseert26,27,28.
De initiatie van resectie is een kritieke stap voor reparatie traject keuze. Zodra de resectie is gestart, worden de DNA-uiteinden slechte substraten voor binding door Ku70/Ku80 heterodimer (component van NHEJ-pad) en zijn cellen toegewijd aan HR17,29,30. De Ku70/Ku80 heterodimeer bindt zich aan DSB-uiteinden en werft DNA-PKcs en p53 Binding Protein 1 (53BP1)29,30. 53BP1 fungeert als een barrière voor resectie in G1, waardoor HR wordt geblokkeerd terwijl het NHEJ31,32bevordert , maar het wordt in de S-fase op een BRCA1-afhankelijke manier verwijderd, waardoor resectie33,34kan plaatsvinden . Daarom spelen 53BP1 en BRCA1 tegengestelde rollen in DSB-reparatie, waarbij 53BP1 een NHEJ-facilitator is, terwijl BRCA1 werkt om breuken te repareren via HR.
In het laboratorium kan DSB-vorming worden veroorzaakt door ioniserende straling (IR). Terwijl dit voorbeeld maakt gebruik van een hoge dosis van 4 Gy, 1 Gy en 2 Gy ook een aanzienlijke hoeveelheid DSB's, geschikt voor de analyse van foci vorming door overvloedige eiwitten. Het is belangrijk op te merken dat het type en de dosis van de gebruikte straling kan leiden tot verschillende laesies in het DNA en in de cel: terwijl IR induceert DSB's, het kan ook leiden tot single streng breuken of basis modificatie (zie35,36 voor een verwijzing naar straling lineaire energieoverdracht (LET) en type dna-schade). Om de kinetiek van ioniserende straling-geïnduceerde foci (IRIF) vorming en hun klaring te bepalen, die wijzen op herstel van de schade en omkering van de geactiveerde DDR8,9,37,38, foci vorming kan worden gecontroleerd op verschillende tijdstippen na ioniserende straling. Timing van activering en klaring van alle belangrijke DNA-schade eiwitten is bekend39, en velen worden onderzocht als surrogaat markers van belangrijke gebeurtenissen. PRPA, dat een hoge affiniteit heeft met ssDNA, wordt bijvoorbeeld gebruikt als surrogaat van de pauzeresectie, MRN-eiwitten (MRE11, RAD50, NBS1) en exonleases kunnen ook worden gebruikt om de resectie-efficiëntie te beoordelen. Terwijl RAD51, BRCA1, BRCA2 (borstkanker type 2 gevoeligheideiwit) en PALB2 (partner en localizer van BRCA2) kunnen worden gecontroleerd om hr-efficiëntie te evalueren, worden de aanwezigheid van de Ku-eiwitten of 53BP1 gebruikt als markers van NHEJ(figuur 1).
Aangezien de proteïnen van de reparatiemachines van DNA elkaar aan de onderbreking aan de onderbreking aanwerven en in super-complexen assembleren, kunnen de interacties van DNA-eiwit en eiwit-eiwit door hun individuele lokalisatie in tijd volgen en colokalisatie van proteïnen analyseren, zoals gevisualiseerd door overlappende signalen in cel40,41,42. In cellijnen maakt de introductie van puntmutaties of verwijdering in specifieke DNA-herstelgenen, hetzij door genoombewerking, hetzij door overexpressie van op plasmid gebaseerde mutanten, onderzoek mogelijk naar specifieke residuen en hun mogelijke rol bij de herkenning van DNA-schade (bijvoorbeeld colokalisatie met γH2AX) of complexe assemblage (colokalisatie met een andere, of meerdere, eiwitten), evenals hun impact op DNA-reparatie. Hier gebruiken we indirecte immunofluorescentie als een middel om de vorming en resolutie van DSB's te onderzoeken door γH2AX foci in de loop van de tijd te volgen. We presenteren ook een voorbeeld van foci vorming en co-lokalisatie analyse door een belangrijke speler in DSB reparatie: p53 Binding Protein 1 (53BP1)32. Zoals eerder vermeld, 53BP1 wordt beschouwd als centraal in DNA reparatie traject keuze. Na 53BP1 accumulatie en de co-lokalisatie met γH2AX biedt kostbare informatie over celcyclus fase, DNA schade accumulatie, en route gebruikt om DSB's te repareren. Het doel van indirecte immunolokalisatie is het beoordelen van de efficiëntie van DNA-schadeherstel in cellijnen, naar aanleiding van IR zoals in deze studie, of na blootstelling aan verschillende spanningen in de cel, van DNA-kruislinking tot verstopping van de replicatievork (een lijst van DNA-schadelijke stoffen is opgenomen in tabel 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2.jpg"> Figuur 1: DNA double strand breaks (DSB) reparatie trajecten. DSB reparatie omvat twee belangrijke trajecten: Homologous Recombinatie (HR, links) en Non-Homologous End-Joining (NHEJ, rechts). Na de pauze worden eiwitten geactiveerd om de pauze te markeren (γH2AX), deel te nemen aan eindresectie (MRN), de resected ssDNA (pRPA) te coaten, recombinatie te bevorderen (BRCA1, PALB2, BRCA2, RAD51) of hersectie te beperken en NHEJ (53BP1) te bevorderen. Andere eiwitten nemen deel aan schadeherstel, maar de genoemde eiwitten worden routinematig gevolgd door indirecte immunofluorescentie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61447/61447fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>DNA-beschadigend middel</td>
			<td>Werkingsmechanisme</td>
			<td>Aanbevolen dosis</td>
		</tr>
<tr>
<td>γ-stralen/röntgenstralen</td>
			<td>Straling Vorming van dubbelstranden breekt met een aantal ongecontroleerde cellulaire effecten</td>
			<td>1-4 Gy</td>
		</tr>
<tr>
<td>
36. Ar ionen</td>
			<td>Straling Vorming van dubbelstranden</td>
			<td>270 keV/μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>α-deeltjes</td>
			<td>Straling Vorming van dubbelstranden</td>
			<td>116 keV/μm</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bleomycine</td>
			<td>Remmer van DE synthese van DNA</td>
			<td>0,4-2 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Camptothecin</td>
			<td>Remmer van topoisomerase I</td>
			<td>10-200 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cisplatine</td>
			<td>Alkylating agent (inducerende intrastrand crosslinks)</td>
			<td>0,25-2 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Doxorubicine</td>
			<td>Intercalating agent Remmer van topoisomerase II</td>
			<td>10-200 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Etopozijde</td>
			<td>Remmer van topoisomerase II</td>
			<td>10 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hydroxyurea Hydroxyurea</td>
			<td>Remmer van DE synthese van DNA (door ribonucleotide reductase)</td>
			<td>10-200 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Methymethfonaat</td>
			<td>Alkylating agent</td>
			<td>0,25-2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mitomycine C</td>
			<td>Alkylating agent</td>
			<td>0,25-2 μM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ultraviolet (UV) licht</td>
			<td>Vorming van thymidine dimers (het genereren van vervorming van de DNA-keten)</td>
			<td>50-100 mJ/cm2
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Genotoxische middelen. Voorbeelden van DNA-schadelijke stoffen, hun werkingsmechanisme en de schade veroorzaakt op basis van de voorgestelde werkconcentratie.

<table><tbody><tr><td>16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) waterige oplossing</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Microscopie kwaliteit van de PFA zorgt voor de beste beelden. Als u 'zelfgemaakte PFA' gebruikt, filter dan voor gebruik.</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>Heat-shock fractie wordt aanbevolen om precipitatie/achtergrond te voorkomen.</td></tr><tr><td>Dekglaasje #1, 18 mm rond (dekglasjes)</td><td>Neuvitro</td><td>NC0308920</td><td>Dekglasjes moeten worden gereinigd en gesteriliseerd voor gebruik, met HCl of ethanol.</td></tr><tr><td>DMEM, Hoge Glucose [(+) 4,5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Natrium Pyruvaat]</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td>Pas het groeimedium aan de behoeften van de gebruikte cellijn aan.</td></tr><tr><td>DPBS, geen calcium, geen magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>PBS voor weefselkweek.</td></tr><tr><td>Ethyleenglycol-bis(&beta;-aminoethylether)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraazijnzuur (EGTA)</td><td>Research Products International</td><td>E57060</td><td>Kernextractiebuffer.</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>104370028</td><td>De kwaliteit van FBS kan worden beoordeeld door gH2AX foci vorming te testen. Als er sporen van genotoxische endotoxinen in de batch aanwezig zijn, zal gH2AX positief zijn bij afwezigheid van stress.</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride (MgCl2)</td><td>Research Products International</td><td>M24000</td><td>Kernextractiebuffer.</td></tr><tr><td>Piperazine-N,N&prime;-bis(2-ethaansulfonzuur) (PIPES)</td><td>Research Products International</td><td>P40150</td><td>Kernextractiebuffer.</td></tr><tr><td>SlowFade Diamond Antifade Mountant met DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>S36973</td><td>300 nM DAPI met VECTASHIELD Antifade Montage Medium kan in plaats daarvan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Research Products International</td><td>S23020</td><td>Kernextractiebuffer.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Research Products International</td><td>S24060</td><td>Kernextractiebuffer.</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscoopglaasjes</td><td>Fisherbrand</td><td>1255015</td><td>Polysine glaasjes kunnen in plaats daarvan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>TC-Behandelde Meerdere Welborden, maat 12 welven</td><td>Costar</td><td>3513</td><td>Zaden op dekglaasjes wordt gedaan in 12-welven plaat.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>AmericanBio</td><td>AB02025</td><td>Kernextractiebuffer.</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym (1X), Geen Fenol Rood</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>Trypsin-EDTA kan in plaats daarvan worden gebruikt.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,5%), Geen Fenol Rood</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>TrypLE kan in plaats daarvan worden gebruikt.</td></tr></tbody></table>

visualisatie van dna repair proteins interaction door immunofluorescentie

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Zoogdiercellen worden voortdurend blootgesteld aan chemische stoffen, straling, en natuurlijk voorkomende metabolische bijproducten, die specifieke soorten DNA-beledigingen te creëren. Genotoxische middelen kunnen de DNA-ruggengraat beschadigen, breken of de chemische aard van individuele basen wijzigen. Na DNA-belediging worden DNA damage response (DDR) trajecten geactiveerd en eiwitten aangeworven die betrokken zijn bij de reparatie. Een overvloed aan factoren zijn betrokken bij het waarmaken van het type schade en het activeren van de juiste reparatierespons. Het niet correct activeren en rekruteren van DDR-factoren kan leiden tot genomische instabiliteit, wat ten grondslag ligt aan veel menselijke pathologieën, waaronder kanker. Studies van DDR-eiwitten kunnen inzicht geven in de reactie van genotoxische geneesmiddelen en cellulaire mechanismen van resistentie tegen geneesmiddelen.
Er zijn twee belangrijke manieren om eiwitten in vivote visualiseren: directe observatie, door het eiwit van belang te taggen met een fluorescerend eiwit en het te volgen door live beeldvorming, of indirecte immunofluorescentie op vaste monsters. Terwijl visualisatie van fluorescerende gelabelde eiwitten nauwkeurige monitoring na verloop van tijd mogelijk maakt, kan directe tagging in N- of C-terminus interfereren met de eiwitlokalisatie of functie. Observatie van eiwitten in hun ongewijzigde, endogene versie heeft de voorkeur. Wanneer DNA-reparatie-eiwitten worden aangeworven voor de DNA-belediging, hun concentratie stijgt lokaal en ze vormen groepen, of "foci", dat kan worden gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie met behulp van specifieke antilichamen.
Hoewel detectie van eiwitfoci geen definitief bewijs van directe interactie biedt, geeft colokalisatie van eiwitten in cellen aan dat ze zich hergroeperen naar de plaats van schade en kunnen ze informeren over de volgorde van gebeurtenissen die nodig zijn voor complexe vorming. Zorgvuldige analyse van foci ruimtelijke overlap in cellen uitdrukken wilde type of mutant versies van een eiwit kan kostbare aanwijzingen geven over functionele domeinen belangrijk voor DNA reparatie functie. Ten slotte duidt colokalisatie van eiwitten op mogelijke directe interacties die kunnen worden geverifieerd door co-immunoprecipitatie in cellen, of directe pulldown met behulp van gezuiverde eiwitten.

Op dag 2, of 24 uur na het zaaien van cellen op coverslips, cellen hebben ondergaan een verdeling en zijn 80% confluent. Specifieke knock downs of mutaties in DNA-hersteleiwitten kunnen de verdubbelingstijd verhogen of cellen sensibiliseren voor genotoxische behandeling, en de zaaidichtheid en behandelingsdoses moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Om de beste werkomstandigheden te bepalen, kan de timing van de DNA-schaderespons worden vastgesteld door westerse blotting van γH2AX in de tijd, en de gevoeligheid voor...

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA ...

Indirecte immunofluorescentie maakt het mogelijk om DNA-hersteleiwitten, foto's van ruimtelijke en temporele rekrutering te detecteren en helpt bij het ondervragen van Eiwitproteïne interacties op de plaats van DNA-schade. Na DNA-schade worden DNA-hersteleiwitten gerekruteerd voor de DNA-belediging, terwijl hun concentratie lokaal toeneemt, en ze vormen groepen genaamd foci die kunnen worden gevisualiseerd door indirecte immunofluorescentie op vaste monsters. Deze techniek kan worden gebruikt om eiwitfoci te detecteren en om colocalisatie van het heden in cellen te kwantificeren.Dit kan helpen verklaren de volgorde van gebeurtenissen die nodig zijn voor complexe vorming en voor DNA-reparatie. bepaalde eiwitproteïne interacties kunnen worden met zich meebrengt uit dergelijke experimenten. Het aantonen van de procedure zal Barbara De La Pena, een zeer getalenteerde Postdoc Foto uit mijn laboratorium Begin door het kweken van 40,000 HeLa cellen in elk goed meer dan 12 goed plaat met een 18 millimeter ronde glazen coverslip tot 80%confluency.Na het blootstellen van de cellen aan vier grijze gamma bestraling, was ze twee keer met een milliliter PBS. Verwijder vervolgens de PBS volledig en voeg 200 microliters van NDB aan elke put. Incubeer de cellen gedurende twee minuten bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens de NDB.Houd er rekening mee dat de incubatietijd kan variëren afhankelijk van de cellijn, maar over het algemeen niet langer mag zijn dan twee minuten. Was de cellen met een milliliter PBS. Verwijder vervolgens de PBS volledig en voeg 200 microliters van 4% PFA toe aan elke put voor celfixatie.Broed de cellen 10 minuten in bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens de PFA en voeg een milliliter PBS aan elke put. Verwijder PBS volledig en voeg vervolgens 200 microliter blokkeringsoplossing toe aan elke put en ontcubeer de cellen gedurende twee uur bij kamertemperatuur of 16 tot 18 uur bij vier graden Celsius.verdun de primaire antilichaam en verdunningsbuffer en vortex tot het goed gemengd in een vochtigheidsdoos en hier een stuk parafilm en voeg 10 microliters van primaire antilichaam in een enkele druppel. Lijn een rand van de coverslip van de put met de druppel en langzaam lager op de parafilm verspreiden van de vloeistof. de afdekking gedurende twee uur bij kamertemperatuur in tecubateren.Na de incubatiewas uitglijden glijdt de hoes drie keer in PBS gedurende één minuut per wasbeurt. verdun de secundaire antilichaam- en verdunningsbuffer en vortex totdat goed gemengd 10 microliters secundair antilichaam op elk deklip aanbrengen zoals eerder beschreven en ontcubeer het gedurende twee uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Was de hoes drie keer met PBS en eenmaal met water gedurende één minuut per wasbeurt.Monteer ze vervolgens op glazen platen met een op glycerol gebaseerde montagemedia met DAPI-afdichtingsafdruiten met transparante nagellak en laat ze 20 minuten drogen. Plaats een druppel onderdompelingsolie op de 60 x objectieve lens en gebruik DAPI om de kernen door het oculair voor XYZ-beeldverwerving te lokaliseren, de aanschafsoftware te openen en het scannertype in te stellen als galvano het scannertype als rondreis en 512 bij 512 beeldgrootte. In het PMT-paneel de modus instellen op VBM-gemiddelde om te framen en sequentiële scan naar lijn.Vervolgens stel de kleurstof en warmte detectoren kanaal een op DAPI en SD een, kanaal twee naar alexafluor 488 en HSD drie, en kanaal drie naar alexafluor op 647 en HSD vier selecteren op Z.To aanpassen van de live-afbeelding, druk op de live-knop op het live venster en de focus aan te passen. Gebruik vervolgens het pmt-gereedschapsvenster om laserintensiteitsgevoeligheid, versterking en verschuiving in te stellen Voor z-stacks selecteert u begin tot eind en 15 segmenten. Selecteer de map om afbeeldingen op te slaan en druk op de knop Start van LSM om te beginnen met acquireren.Als u klaar bent, drukt u op de knop Serie gereed om de afbeeldingsverwerving te voltooien. Open de analysesoftware en druk vervolgens op het venster van het batchgereedschap en selecteer de afbeeldingen die u wilt analyseren. Ga naar het venster van het analysegereedschap en selecteer projectie, die de maximale intensiteitsprojectie van 15 segmenten weergeeft.Selecteer onder de invoeruitvoerinstelling de gemaakte batch en uitvoermap. Druk op het proces voor het verwerken van afbeeldingen en exporteer de afbeeldingen als TIFF-bestanden. Voer nucleaire kwantificering uit met cellprofiler volgens de handschriftaanwijzing.Cellen niet behandeld met de straling vertonen zeer weinig gamma H2AX expo teken. Bij afwezigheid van essentiële DNA-reparatieeiwitten kan gamma H2AX-accumulatie worden waargenomen bij DNA-breuken. Accumulatie van niet-gerepareerde pauzes kan leiden cellen te worden pre hypotonische aangegeven door vaste gamma H2AX kernen.Na bestraling vertonen kernen een groot aantal dubbelstrengs pauzes waargmaG H2AX extreem snel is. Terwijl weinig of geen foci worden waargenomen bij afwezigheid van een straling werd het aantal foci gekwantificeerd bij één twee vier en 16 uren na een straling en voor de NOA stralingscontrole. Afhankelijk van de ingediende biologische vraag en het type gegevens dat nodig is, moeten verschillende plottingsopties worden overwogen Colocalisatie kan worden onderzocht door multiplexing primaire antilichamen die bij verschillende diersoorten worden gekweekt en waarbij secundaire antilichamen worden gebruikt, worden gelabeld met verschillende fluoroforen.Superpositie van groen en rood, geeft aanleiding tot gele hotspots, de twee eiwitten van belang zijn aanwezig in dezelfde pixels. Kwantitatieve analyse van colocalisatie kan worden bereikt door een objectgebaseerde benadering of door een statistische benadering die op intensiteitscorrelatiecoëfficiënten gebaseerde analyses uitvoert. Een combinatie van primaire antilichamen die bij verschillende diersoorten worden gekweekt, kan in dit protocol worden gebruikt.Zorg ervoor dat de antilichamen compatibel zijn en niet met elkaar interfereren. U moet het secundaire antilichaam op de juiste wijze instellen dat tegen elk van de primaire antilichamen moet worden gebruikt en een bepaalde spectrale overlap overwegen bij het selecteren van de minder kracht die moet worden gebruikt. Colocalisatie of eiwitten wijzen op mogelijke directe interacties.Dit kan worden geverifieerd door korrelige neerslag in cellen, of door direct neergezet met behulp van gezuiverde eiwitten in vitro.

visualization-of-dna-repair-proteins-interaction-by-immunofluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we describe the immunofluorescence method to visualize the localization of the DNA repair proteins γH2AX and 53BP1 at the sites of double-strand DNA breaks in irradiated cell nuclei.

Immunofluorescence-Based Visualization of DNA Repair Protein Interactions

In this video, we describe the immunofluorescence microscopy technique to detect specific DNA damage response proteins localized at the sites of DNA double-strand breaks in human mononuclear cells. The proteins are recognized by specific primary antibodies, which in turn bind to fluorophore-tagged secondary antibodies that fluoresce during microscopic visualization, enabling visualization of the proteins as distinct fluorescent foci within the cell nuclei.

Immunofluorescence Microscopy for the Analysis of DNA Double-Strand Breaks

Elektronenspectroscopisch beeldvorming kan nucleïnezuur en eiwitten onderscheiden met een resolutie van nanometer. Het kan worden gecombineerd met het miniSOG-systeem, dat gelabelde eiwitten specifiek kan markeren in transmissie-elektronenmicroscopie-monsters. We illustreren het gebruik van deze technologieën met dubbelstrengsbreukreparatiefoci als voorbeeld.

Visualisatie van miniSOG Tagged DNA reparatie-eiwitten in combinatie met Electron spectroscopische beeldvorming (ESI)

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Dit manuscript biedt een protocol voor de analyse van DNA dubbele-strand einden door immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1.

Immunofluorescentie microscopie van γH2AX en 53BP1 voor het analyseren van de vorming en de reparatie van DNA dubbele-strand einden

Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.

Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

De door straling veroorzaakte DNA-schaderespons die wordt geactiveerd door neutronenmixstraal die wordt gebruikt in de boorneutronvangtherapie (BNCT) is nog niet volledig vastgesteld. Dit protocol biedt een stapsgewijze procedure voor het detecteren van door straling geïnduceerde foci (RIF) van reparatie-eiwitten door immunofluorescentie kleuring in menselijke darmkankercellijnen na bestraling met de neutronen gemengde straal.

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

Het huidige protocol beschrijft methoden voor het evalueren van DNA-schadehersteleiwitten in van patiënten afgeleide eierstokkankerorganoïden. Hier zijn uitgebreide plating- en kleuringsmethoden opgenomen, evenals gedetailleerde, objectieve kwantificeringsprocedures.

Het visualiseren van DNA-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests

Het volgende protocol presenteert de detectie van enkelstrengs DNA-foci in de G1-fase van de celcyclus met behulp van celcyclussynchronisatie gevolgd door RPA2-immunofluorescerende kleuring.

Visualisatie van enkelstrengs DNA-foci in de G1-fase van de celcyclus

Leer indirecte immunofluorescentie om DNA-reparatie-eiwitten te detecteren en hun ruimtelijke en temporele rekrutering in HeLa-cellen te analyseren. Deze methode maakt kwantificering van colocalisatie en eiwit-eiwitinteracties mogelijk.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Meer video's verkennen