Name: Een eencellige dissociatiebenadering voor moleculaire analyse van urineblaas in de muis na ruggenmergletsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Leer een geoptimaliseerde weefseldissociatiemethode voor enkelvoudige-celanalyse van muizenblaas na ruggenmergletsel met behulp van flowcytometrie. Deze techniek genereert hoog levensvatbare celpopulaties.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01 DK077195 aan R.M.A, R01 DK104641 aan R.M.A en D.R.B). We erkennen waardevolle input van Dr. Stuart Orkin in de Afdeling Hematologie/Oncologie, Boston Children's Hospital, Department of Pediatrics, Harvard Medical School en het Dana-Farber Cancer Institute. We erkennen ook steun van Kyle Costa bij postoperatieve zorg voor muizen, Mary Taglienti en Dr. Habiballah Shojaeisaadi (Dr. Yang Shi Laboratory, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Dept. of Pediatrics, Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School) voor technische hulp en nuttige discussies.

<ol><li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+characterization+and+functional+analysis+of+human+tumor+immune+infiltration+after+mechanical+and+enzymatic+disaggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation.</a> Journal of Immunological Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).</li>
<li>van den Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Seth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+discrete+modes+of+spinal+cord+injury+on+bladder+muscle+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Urology%22%5BJournal%5D)">The impact of discrete modes of spinal cord injury on bladder muscle contractility.</a> BMC Urology. 13, 24(2013).</li>
<li>Doyle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inosine+attenuates+spontaneous+activity+in+the+rat+neurogenic+bladder+through+an+A2B+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Inosine attenuates spontaneous activity in the rat neurogenic bladder through an A2B pathway.</a> Scientific Reports. 7, 44416(2017).</li>
<li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+miRNA-regulated+networks%2C+hubs+of+signaling%2C+and+biomarkers+in+obstruction-induced+bladder+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Characterization of miRNA-regulated networks, hubs of signaling, and biomarkers in obstruction-induced bladder dysfunction.</a> JCI Insight. 2 (2), 89560(2017).</li>
<li>Gheinani, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concordant+miRNA+and+mRNA+expression+profiles+in+humans+and+mice+with+bladder+outlet+obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Concordant miRNA and mRNA expression profiles in humans and mice with bladder outlet obstruction.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 6 (6), 219-233 (2018).</li>
<li>Krishna, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+contusion+model+of+severe+spinal+cord+injury+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A contusion model of severe spinal cord injury in rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50111(2013).</li>
<li>The Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris.</a> Nature. 562 (7727), 367-372 (2018).</li>
<li>Gray, C. J., Boukouvalas, J., Szawelski, R. J., Wharton, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline+p-nitroanilide+as+a+substrate+for+papain+and+other+plant+cysteine+proteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Benzyloxycarbonylphenylalanylcitrulline p-nitroanilide as a substrate for papain and other plant cysteine proteinases.</a> Biochemical Journal. 219 (1), 325-328 (1984).</li>
<li>Feodorova, Y., Koch, M., Bultman, S., Michalakis, S., Solovei, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quick+and+reliable+method+for+retina+dissociation+and+separation+of+rod+photoreceptor+perikarya+from+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Quick and reliable method for retina dissociation and separation of rod photoreceptor perikarya from adult mice.</a> MethodsX. 2, 39-46 (2015).</li>
<li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bladder+extracellular+matrix.+Part+I%3A+architecture%2C+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The bladder extracellular matrix. Part I: architecture, development and disease.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 596-611 (2009).</li>
<li>Aitken, K. J., Bagli, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bladder+extracellular+matrix.+Part+II%3A+regenerative+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Urology%22%5BJournal%5D)">The bladder extracellular matrix. Part II: regenerative applications.</a> Nature Reviews Urology. 6 (11), 612-621 (2009).</li>
<li>The ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Yue, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome.</a> Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).</li>
<li>Wu, Y. E., Pan, L., Zuo, Y., Li, X., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Activated+Cell+Populations+Using+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Detecting Activated Cell Populations Using Single-Cell RNA-Seq.</a> Neuron. 96 (2), 313-329 (2017).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten aangegeven.

Het hier beschreven letselmodel van het ruggenmerg van de muis biedt een reproduceerbare methode om een functionele obstructie van de blaasuitlaat te creëren als gevolg van verlies van coördinatie tussen blaascontractie en externe uretthrale sluitspierontspanning. Dit roept op zijn beurt al 2 weken na de verwonding een grondige remodellering van de blaaswand op, gekenmerkt door uitbreiding van urotheliale en gladde spiercompartimenten. Kritieke stappen in de implementatie van het SCI-model bij knaagdieren omvatten (i) strikte aandacht voor handmatige blaasexpressie tijdens de periode van spinale shock die volgt gedurende 10 \u201214 dagen na letsel; ii) voedingsverrijking om gewichtsverlies tot een minimum te beperken; en iii) beperking van het potentieel voor urineverbranding, met name voor experimenten die verder gaan dan de terugkeer van reflexleegte. Beperkingen van het model omvatten het potentieel voor uretritale occlusie bij muizen uit bloedstolsels tijdens de periode van voorbijgaande hematurie, en bovendien bij mannelijke muizen uit spermacoagulum na retrograde ejaculatie na een operatie.
De hier beschreven weefseldissociatiebenadering illustreert het belang van het overwegen van structurele veranderingen in weefsels die voortvloeien uit de experimentele belediging, in dit geval significante weefselremodellering na SCI die downstreamanalyses kan beïnvloeden. Met de toename van eencellige analyses is het van cruciaal belang ervoor te zorgen dat verschillen in genexpressie niet alleen het gevolg zijn van dissociatie-geïnduceerde verstoringen, maar echt representatief zijn voor onderliggende biologische veranderingen die relevant zijn voor het ziektemodel. Het gebruik van openbaar beschikbare expressiegegevens stelde ons in staat om de formulering van vergistingsbuffers aan te passen om een effectieve vertering van extracellulaire matrix te garanderen en tegelijkertijd de levensvatbaarheid te maximaliseren. Aanvullende wijzigingen die in toekomstige toepassingen kunnen worden overwogen, zijn onder meer de toevoeging van actinomycine D, om transcriptie van onmiddellijke vroege genen die gevoelig zijn voor het dissociatieprotocol15te stoppen .
Pipetting techniek is cruciaal bij het dissocieren van weefsel of het overbrengen van cellen die al in suspensie zijn. Om fysieke schade aan cellen door afschuifkrachten te verminderen, is het belangrijk om zacht en langzaam te pipetten tijdens celreuspensie. Het wordt over het algemeen aanbevolen om pipetpunten met brede boring te gebruiken. Als u standaardtips gebruikt, is het vooral belangrijk om celsuspensies voorzichtig te pipetten om afschuifkrachten te voorkomen die anders cellen zouden beschadigen. Het gebruik van celstammen is onvermijdelijk in dit protocol, maar de celconcentratie kan met 20% of meer dalen, vergezeld van een volumeverlies van 100 μL of meer. We raden aan om de celconcentratie na het persen te bepalen om een nauwkeurig aantal cellen te garanderen.
In flowcytometrie bieden FMO-controles een meting van de achtergrond als gevolg van het bloeden van signalen van overlappende emissiepieken. Ze zijn geen maat voor niet-specifieke antilichaambinding of achtergrondvlekken die aanwezig kunnen zijn wanneer een antilichaam in dat kanaal wordt opgenomen. Om rekening te houden met de niet-specifieke antilichaambinding, moet men passende isotypecontroles opnemen; voor de achtergrondkleuring moet men negatieve controles opnemen. Samen zorgen deze controles voor een nauwkeurige meting van celpopulaties.

Verstoringen van de normale urineblaasfunctie kunnen voor veel mensen leiden tot een verminderde kwaliteit van leven. Om een beter inzicht te krijgen in hoe letsel of ziekte de normale blaasfunctie ontspoort, is het belangrijk om de normale biologische toestand van cellen in de blaas te onderzoeken en hoe ze veranderen bij experimentele verstoring. Tot op heden zijn de specifieke celpopulaties die zich in de urineblaas bevinden en hoe ze veranderen met letsel, echter onvolledig gekarakteriseerd.
Eencellige profileringsmethoden zoals flowcytometrie of single cell RNA sequencing (scRNA-seq) hebben het potentieel om licht te werpen op specifieke celtypen in de blaas. Om deze benaderingen informatief weefsel te laten zijn, moet echter worden verteerd op een manier die de levensvatbaarheid, genexpressie en representatieve celpopulatiepercentages van het geoogste weefsel niet beïnvloedt. Protocollen die enzymatische disaggregatie toepassen, kunnen de expressie van oppervlaktemarkers beïnvloeden door willekeurige proteaseactiviteit1, waardoor de celidentificatie door stroomcytometrie wordt beïnvloed, terwijl het dissociatieproces zelf kan leiden tot de inductie van onmiddellijke vroege genen, zoals onlangs beschreven door Van den Brink en collega's2. De auteurs toonden aan dat hoewel de door dissociatie aangetaste subpopulatie klein was, het een sterk vervuilend signaal kon veroorzaken in bulkexpressiestudies vanwege de hoge expressieniveaus van onmiddellijke vroege genen. Bovendien, de duur van de dissociatie protocol beïnvloed gedetecteerd bulk expressie niveaus van genen aangetoond dat uniek zijn voor sommige subpopulaties. Zo kunnen gegevenssets met één cel die worden gegenereerd zonder rekening te houden met de impact van het dissociatieprotocol genexpressieveranderingen opleveren die voortvloeien uit de dissociatiemethode, in tegenstelling tot de onderliggende biologie. Deze observaties suggereren dat gepubliceerde transcriptomics-gegevens met één cel met voorzichtigheid moeten worden geïnterpreteerd en dat de resultaten met onafhankelijke methoden moeten worden gevalideerd.
Hoewel harde en langdurige dissociatiemethoden de genexpressie in cellen2kunnen veranderen ; effectieve isolatie van cellen is essentieel om een nauwkeurige weergave van de aanwezige celtypen te verkrijgen. Aangezien de blaas een complex orgaan is dat uit meerdere celtypen bestaat, kunnen sommige populaties zoals urotheliale of stromale cellen relatief ondervertegenwoordigd zijn, terwijl andere celtypen zoals fibroblasten bestaan binnen de extracellulaire matrix en een uitdaging kunnen zijn om te isoleren. Dissociatie wordt nog uitdagender als de blaas een aanzienlijke remodellering en fibrose heeft ondergaan, zoals die waargenomen bij dwarslaesie3,4 of obstructie van de blaasuitlaat5,6.
Hier beschrijven we een geoptimaliseerde weefseldissociatiemethode voor downstream eencellige analyse in de gewonde muisblaas van het ruggenmerg. Met behulp van flowcytometrie vergeleken we vier enzymatische spijsverteringsprotocollen voor hun vermogen om een suspensie met één cel op te leveren, de levensvatbaarheid van cellen te ondersteunen en het juiste aandeel celpopulaties te behouden. Op basis van deze analyse concluderen we dat het minimaliseren van celdood, cellulaire aggregaten, niet-cellulaire nucleïnezuren en potentiële remmers van downstream-analyse van cruciaal belang zijn voor het bereiken van hoogwaardige gegevens.

```html
<table><tbody><tr><td>2.5 X Magnifying Loupes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7-0 Vicryl suture, 6.5mm needle 3/8 circle</td><td>ETHICON</td><td>J546</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m Cell Strainer</td><td>Thermofisher</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Accutase in BPBS, 0.5mM EDTA</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &micro;L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>Aerosol Filter Wide Orifice Pipettor Tips (1000 &micro;L)</td><td>VWR</td><td>89049-168</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD326 (Ep-CAM), rat monoclonal, IgG2a, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>118213</td><td></td></tr><tr><td>BB515 Rat Anti-Mouse CD45, rat monoclonal, IgG2b, &kappa;, Clone 30-F11</td><td>BD Biosciences</td><td>564590</td><td></td></tr><tr><td>BONN Micro Dissecting Forceps, Straight, 1x2 teeth, 3.75" length, 0.3mm tip width, 0.12mm teeth</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-5172</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>2115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>CASTROVIEJO Micro Suturing Needle Holder, Straight with lock, 5.75" length</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-6412</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit, 30 dual-chambered slides, 60 counts, with trypan blue</td><td>Biorad</td><td>1450003</td><td></td></tr><tr><td>Cell Staining Buffer</td><td>BioLegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium histolyticum</td><td>Sigma</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type III</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004182</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase, Type 6</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS005319</td><td></td></tr><tr><td>Dead Cell Apoptosis Kit with Annexin V Alexa Fluor 488 &amp; Propidium Iodide (PI)</td><td>Thermofisher</td><td>V13241</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>Enrofloxacin (Baytril)</td><td>Bayer Health Care LLC,</td><td>NADA # 140-913 Approved by FDA. Lot No.: AH01CGP</td><td>2.27% Injectable Solution</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml conical centrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml conical centrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>122505</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase from sheep testes, Type II</td><td>Sigma</td><td>H2126</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (100 &micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec, Inc.</td><td>130-110-917</td><td></td></tr><tr><td>McPHERSON-VANNAS, Micro Dissecting Spring Scissors, Straight, 4" length, 0.15mm tip width</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc.</td><td>RS-5630</td><td>ROBOZ Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg MD</td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-891-7959</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003119</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse CD19 Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>115509</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse CD3&epsilon; Antibody, Armenian hamster monoclonal, IgG, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>100309</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse CD4 Antibody, rat monoclonal, IgG2b, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>100409</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse CD8a Antibody, rat monoclonal, IgG2a, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>100709</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse NK-1.1 Antibody, mouse monoclonal, IgG2a, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>108715</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>PE/Cy5 anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody, IgG2b, &kappa;, affinity purified</td><td>BioLegend</td><td>116209</td><td>Dump Channel</td></tr><tr><td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), rat monoclonal, IgG2b, &kappa;, Clone 2.4G2</td><td>BD Biosciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10X)</td><td>BioLegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>Red Blood Cell Lysis Buffer 1x</td><td>Biolegend</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Screw-Cap microcentrifuge tubes, 1.5 ml</td><td>VWR</td><td>89004-290</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Automated Cell Counter</td><td>Biorad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Triple antibiotic ointment (neomycin/polymyxin B/ bacitracin)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-7216</td><td>skin protectant</td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X), no phenol red</td><td>Thermofisher</td><td>A1217701</td><td></td></tr><tr><td>Vetropolycin eye ointment</td><td>Dechra Veterinary Products</td><td>NADA # 065-016. Approved by FDA.</td><td>protect eyes during anesthesia</td></tr></tbody></table>
```

een eencellige dissociatiebenadering voor moleculaire analyse van urineblaas in de muis na ruggenmergletsel

A Single Cell Dissociation Approach for Molecular Analysis of Urinary Bladder in the Mouse Following Spinal Cord Injury

We beschrijven de implementatie van ruggenmergletsel bij muizen om detrusor-sluitspierdysynergie, een functionele obstructie van de blaasuitlaat en daaropvolgende herinrichting van de blaaswand uit te lokken. Om de beoordeling van de cellulaire samenstelling van de blaaswand bij niet-gewonde controle en ruggenmerggewonde muizen te vergemakkelijken, ontwikkelden we een geoptimaliseerd dissociatieprotocol dat een hoge levensvatbaarheid van de cel ondersteunt en de detectie van discrete subpopulaties door stroomcytometrie mogelijk maakt.
Dwarslaesie ontstaat door volledige transsectie van het thoracale ruggenmerg. Op het moment van weefseloogst wordt het dier doordrenkt met fosfaatgebufferde zoutoplossing onder diepe anesthesie en worden blaasjes geoogst in de buffer van Tyrode. Weefsels worden gehakt voorafgaand aan incubatie in de spijsverteringsbuffer die is geoptimaliseerd op basis van het collageengehalte van de muisblaas, zoals bepaald door ondervraging van openbaar beschikbare genexpressiedatabases. Na het genereren van een suspensie met één cel wordt materiaal geanalyseerd door stroomcytometrie voor de beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen, het celnummer en specifieke subpopulaties. We tonen aan dat de methode celpopulaties oplevert met een levensvatbaarheid van meer dan 90% en een robuuste weergave van cellen van mesenchymale en epitheeloorsprong. Deze methode maakt een nauwkeurige downstream-analyse van discrete celtypen in de muisblaas en mogelijk andere organen mogelijk.

Chirurgische ingreep Het succes van thoracale ruggenmergtranssectie wordt bepaald door beoordeling van een aantal parameters, waarvan hindlimbverlamming de meest voor de hand liggende is. Het dier beweegt alleen met behulp van zijn voorpoten en sleept zijn achterpoten. Anders zijn activiteitsniveaus, waaronder voeding, verzorging en alertheid, meestal normaal. Bovendien verliezen dieren de wilskrachtige blaascontrole, wat resulteert in de noodzaak van handmatige blaasexpressie door de onderzoeker om de 12 uur totdat reflex voiding terugkeert op 10 tot 14 dagen na letsel. Na euthanasie hebben extra tekenen van het succes van de verwonding voornamelijk betrekking op de toename van de verhouding tussen blaas en lichaamsgewicht, wat wijst op weefselremodellering. Histologische analyse onthult hyperplasie in zowel de urotheliale als gladde spiercompartimenten3.
Voorbereiding van eencellige suspensie Aan de hand van openbaar beschikbare expressiegegevens werd de verrijking van blaasweefsel voor extracellulaire matrixeiwitten bepaald (figuur 2) en gebruikt om de formulering van de spijsverteringsmix te informeren. Aangezien collageens belangrijke componenten van de blaaswand11,12zijn, probeerden we eerst de meest voorkomende collageen(s) in de muisblaas te bepalen met behulp van RNA-profileringsgegevenssets gegenereerd door het Mouse ENCODE-project13. Onze analyse toonde aan dat collageen 1A1, collageen 3A1, collageen 1A2 en collageen 6A1 de meest voorkomende collageentypen zijn binnen de muisblaas(figuur 2A). We gebruikten ook de Tabula Muris (een compendium van eencellige transcriptoomgegevens van muis (Mus musculus))8 om het mRNA-expressieniveau van collageen 1, 3, 6 en hyaluronan te bepalen. De gegevens maken een directe en gecontroleerde vergelijking mogelijk van genexpressie in celtypen die tussen weefsels worden gedeeld. Uit deze analyse bleek dat de expressie van deze extracellulaire matrixcomponenten vaker voorkomt in de mesenchymale celtypen in plaats van urothelium (figuur 2B).
Effect van dissociatie op de levensvatbaarheid van geïsoleerde cellen van de blaas Flowcytometrie analyse toonde aan dat enzymatische spijsvertering met behulp van de 4 verschillende protocollen een levensvatbaarheid van respectievelijk 83%, 86%, 93% of 90% opleverde. Protocol sectie 3 werd dus het meest waardevol geacht voor het behoud van de levensvatbaarheid van cellen. We merkten ook op dat ongeveer 4% van de cellen necrotisch was (PI+/Annexin V-) (figuur 4A). Deze observaties benadrukken de efficiëntie van het spijsverteringsprotocol en het daaruit voortvloeiende voordeel voor de levensvatbaarheid van cellen.
Effect van dwarslaesie op verschillende populaties cellen in de blaas We zagen een significante toename van het totale aantal cellen in blazen van SCI-muizen in vergelijking met controles. Het patroon van de stippercelen verkregen uit SCI-blazen was ook iets anders in overeenstemming met de lopende orgaanremodellering als gevolg van dwarslaesie (figuur 4B: eerste kolom). In vergelijking met controles vertoonden de blaasjes van SCI-dieren een aanzienlijke toename van CD45-positieve cellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig01.jpg"> Figuur 1: Representatieve perfusie voltooiing met lichtere kleur van de lever. (A) Toont de leverkleur aan het begin van de perfusie. (B) Toont de lichtere leverkleur aan het einde van de perfusie. De muis in (A) had ruggenmergtransection twee weken vóór perfusie resulterend in blaashypertrofie en zijn uitsteeksel uit het bekken in tegenstelling tot de muis in (B) die geen dwarslaesie had; in dit geval is de blaas klein en verborgen in het bekken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig02.jpg"> Figuur 2: Transcriptomische expressie van extracellulaire matrix (ECM) componenten in de muisblaas. (A) Staafdiagram van 43 verschillende collageentypen. De uitdrukking wordt vermeld door Reads Per Kilobase van transcriptie, per miljoen toegewezen reads (RPKM) (gegevens worden verzameld uit BioProject: PRJNA66167)14. (B) Vioolplots van genexpressie in celtypen verkregen uit microfluïdische druppeltelling op basis van 3'-eindtellingen in een pool van mannelijke en vrouwelijke gescheiden urineblaasmonsters (mannen en vrouwen). Tellingen werden voor elke cel genormaliseerd met behulp van de natuurlijke logaritme van 1+ tellingen per miljoen ln (CPM+1)8. Een pseudocount van 1 CPM werd toegevoegd voordat logaritmen werden genomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig03.jpg"> Figuur 3: Gatingstrategie en FMO-controles om fluorescentiespreiding te bepalen. (A) Selectie van celpopulatie. (B) Gating strategie voor singlets. (C) Gating voor necrotische, en vroege en late apoptotische cellen met behulp van PI en Annexin V antilichaam. (D\u2012F) Een schematisch stipplot van multicolor flowcytometrie (bijv. antilichamen geconjugeerd met A, B, C, D fluorchromen + (bijlage V en PI). Dit toont de fluorescentie verspreid in het antilichaam met fluorchroom A-kanaal weergegeven door de FMO-controle in vergelijking met een niet-bevlekte controle. Oranje stippellijn vertegenwoordigt FMO gating grens in vergelijking met niet-opgeslagen grens in rood. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61455/61455fig04.jpg"> Figuur 4: Flowcytometrie van verschillende celtypen in de blaas. (A) Annexin V/PI dubbele kleuring stroomdiagrammen. De verschillende combinaties van enzymen en chemicaliën die voor elk protocol worden gebruikt, worden weergegeven voor het overeenkomstige levensvatbaarheidsperceel. Deze gegevens tonen aan dat de hoogste levensvatbaarheid is verkregen met protocolsectie 3. (B) Representatieve histogrammen die de intensiteit illustreren van Ly-6A/E (Sca-1) en CD326 (Ep-CAM) gedetecteerd in afzonderlijke kanalen. (C) Effect van SCI op de celpopulatie van de muisblaas. Het bovenste paneel toont de resultaten van vlekken op drie gescheiden blaasjes verkregen uit controle niet-chirurgische muizen en het onderste paneel toont de resultaten van vlekken op drie dieren met SCI. De eerste kolom is de totale celpopulatie. De tweede kolom toont de selectie van singlet gating. De derde kolom toont de subpopulatie van levende cellen die negatief zijn voor B-cellen, T-cellen en NK-cellen. De vierde kolom toont de kleuring voor levende cellen positief voor CD45. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61455/61455fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Component</td>
			<td>Hoeveelheid (voor 500 ml)</td>
			<td>Molariteit</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nacl</td>
			<td>4.091 g</td>
			<td>140 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kcl</td>
			<td>0,186 g</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>0,0476 g</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-Glucose</td>
			<td>0,9 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1,19 g</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Componenten voor de bereiding van de oplossing van Tyrode. De aangegeven componenten zijn voor de bereiding van de oplossing van 500 ml Tyrode.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Component</td>
			<td>Bedrag</td>
			<td>Protocol sectie 1</td>
			<td>Protocol sectie 2</td>
			<td>Protocol sectie 3</td>
			<td>Protocol sectie 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>Bsa</td>
			<td>5 mg</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>0,03 mM</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenase Type I</td>
			<td>132,5 eenheden</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenase Type III</td>
			<td>96.4 eenheden</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Collagenase Type VI</td>
			<td>50 eenheden</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNase</td>
			<td>10 eenheden</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Papaïne</td>
			<td>115 eenheden</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pan Collagenase</td>
			<td>50 eenheden</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
			<td>10,5 eenheden</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase II</td>
			<td>1.25 eenheden</td>
			<td>Ja</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oplossing voor celdissociatie</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recombinant enzym</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
			<td>-</td>
			<td>Ja</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Componenten voor de voorbereiding van de vergistingsbuffer. De geïndiceerde componenten zijn voor de bereiding van 2,5 ml vergistingsmix (1 U katalyseert de hydrolyse van 1 μmol per substraat per minuut bij 37 °C. Raadpleeg het productinformatieblad voor de definitie van de eenheid van elk enzym).

Het doel van dit protocol is om een geoptimaliseerd weefseldissociatieprotocol toe te passen op een muismodel van ruggenmergletsel en de aanpak voor eencellige analyse door stroomcytometrie te valideren.

Een eencellige dissociatiebenadering voor moleculaire analyse van urineblaas in de muis na ruggenmergletsel

We describe the implementation of spinal cord injury in mice to elicit detrusor-sphincter dyssynergia, a functional bladder outlet obstruction, and ...

Dit protocol is belangrijk omdat het biologische informatie gebruikt om de generatie van een enkele celsuspensie met een hoge cellevensvatbaarheid te vergemakkelijken. Het grote voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om enkele celsuspensies te genereren die een hoge cellevensvatbaarheid en een passende vertegenwoordiging van de geïsoleerde celtypen behouden. Het aantoonbaar maken van de chirurgische procedure zal worden gedaan door Hussein Atta, een collega in mijn laboratorium.Het aantoonbaar maken van de weefseldissociatieprocedure zal worden gedaan door Ali Hashemi, en de FACS-analyse, Yaser Heshmati. Na het bevestigen van een gebrek aan respons op peesreflex bij een volwassen anesthetische muis, palpeert u het meest prominente spinaaluitsteeksel in de thoracale wervelkolom. Pijnstillers en antibiotica worden toegediend vóór de operatie.Scheer een longitudinaal rechthoek op de rug van de muis vanaf de onderhals tot net onder het meest prominente spinaaluitsteeksel en een centimeter aan elke kant van de middenlijn. Desinfecteer de blootgestelde huid drie keer met sequentiële 10%povidoonjodium en 70%ethanoldoekjes in een cirkelvormige beweging, beginnend bij de plaats van incisie en naar buiten toe werkend. Na de laatste afveging, bedek de muis met een steriele 4 bij 4 inch stuk gaasje met een raam boven het chirurgische veld.Om de ruggenmergletsel te induceren, maakt u eerst een 1,5 centimeter incisie in het midden van de rug en gebruikt u scherpe stompe dissectie om de spieren te scheiden van de spinaaluitsteeksels en de laminae van de T9, T10 en T11 wervels. Gebruik fijne schaar om de interspinale ligamenten tussen T9 en T10 en T10 en T11 scherp te verdelen voordat u een bilaterale laminectomie van het T10 spinaaluitsteeksel uitvoert. Wanneer de laminae volledig zijn verwijderd, gebruikt u de schaar om het ruggenmerg door te snijden.Om de laterale kolommen volledig door te snijden, veegt u delicaat de punt van de fijne schaar aan beide zijden. Gebruik een steriele katoenen punt toepassing om eventuele bloedingen te comprimeren. Nadat de hemostasis is bereikt, sluit u de huid met 7-0 polyglactine910 continue hechtingen en levert u subcutaan één milliliter zoutoplossing af om postoperatieve uitdroging te voorkomen, en brengt u het dier terug naar een frisse kooi met bewaking tot volledige recumbentie.Elke 12 uur, het dier met één hand vasthouden en met de andere het onderste deel van de buik masseren, gebruikt u de wijs- en middelvinger om de opgezwollen urineblaas te lokaliseren en voorzichtig samen te knijpen om handmatige blaasexpressie te stimuleren totdat het dier in staat is om zelfstandig te plassen. Voor downstream-analyse van de blaasceltypen van belang, op het juiste experimentele tijdstip en zodra het dier voldoende verdoving heeft, voer een middenlijnlaparotomie uit van het bekken tot het middenrif en snijd het middenrif los van de ribben. Volg de botkraakbeengrens parallel aan het borstbeen, open de borstkas langs de ribben aan beide zijden van het dier, beginnend bij het middenrif en doorgaande tot de eerste rib.Na het fixeren van de voorste thoracale wand boven het hoofd van het dier, gebruikt u fijne schaar om het pericard af te snijden en sluit u een 23 gauge naald aan op het perfusieapparaat. Steek de naald in het linker ventrikel en duw de naald langzaam in de aorta zonder het weefsel te puncteren. Wanneer de naald op zijn plaats is, begint u met het infunderen van het weefsel met PBS met een stroomsnelheid van 15 milliliter per minuut en gebruikt u de uiteinden van een paar fijne schaar om snel een kleine snede in het rechter atrium te maken.Wanneer de drainage helder is en een verlichte leverkleur kan worden waargenomen, stopt u de perfusie en bevrijdt u de blaas van de vasculaire pedikels en urethra, en plaatst u de blaas in een microcentrifugebuisje met ijskoud Tyrode's oplossing. Om een enkele celsuspensie te bereiden, wanneer alle blaasjes zijn verzameld, scheurt u een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met 100 microliter Tyrode's oplossing. Na het wegen, hak de blaasjes fijn in een 10 centimeter petrischaaltje met 100 microliter Tyrode's oplossing en gebruik een breedbuisige pipettepunt om de weefselfragmenten over te brengen in 2,5 milliliter spijsverteringsbuffer per blaasje.Incubeer het weefsel gedurende 40 minuten bij 37 graden Celsius op een Nutatormixer en gebruik een vijf milliliter pipettepunt om de steekproef gedurende één minuut te tritureren voordat u de gedissocieerde cellen en weefsels verzamelt door centrifugatie. Resuspendeer de pellet in één milliliter celafvoeroplossing en plaats de cellen gedurende een extra 10 minuten op de Nutatormixer. Aan het einde van de incubatie, verzamel de cellen met een andere centrifugatie en resuspendeer de pellet in één milliliter rode cellysebuffer.Na één minuut, stop de lyse met de toevoeging van negen milliliter PBS en filter de cellen door een 70 micrometer zeef in een 50 milliliter buis, centrifugeer vervolgens de cellen opnieuw en resuspendeer de pellet in 200 microliter kleuringsbuffer aangevuld met FC-blok. Na een 10-minuten incubatie op ijs, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspendeer de pellet in het juiste volume van fluorofoor geconjugeerd antilichaam master mix gedurende 20 minuten op ijs beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de cellen met één milliliter celkleuringsbuffer en resuspendeer de pellet in 100 microliter vers celkleuringsbuffer aangevuld met vijf microliter FITC Annexine V en één microliter propidiumjodide.Na 15 minuten op kamertemperatuur, voeg 400 microliter Annexine-bindingbuffer toe aan de cellen en meng door omkering. Om de cellen door middel van flowcytometrie te analyseren, gebruikt u eerst een ongekleurd celmonster om de side en forward scatter parameters van de cellen in te stellen, meet vervolgens de fluorescentie-emissie bij 530 nanometer en groter dan 575 nanometer om de dode cellen uit te sluiten. Gebruik de rasters op elke dot blot om de negatieve populatie in de eerste verval te definiëren en gebruik de fluorescentie minus één control

a-single-cell-dissociation-approach-for-molecular-analysis-urinary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het isoleren van volwassen stamcellen uit spier-en zachte weefsels op basis van de cel naleving snelheid kolf.

Het isoleren van stamcellen uit Soft musculoskeletale weefsels

Een geoptimaliseerde procedure om neurale lijst afgeleide neuronale voorlopercellen uit foetaal weefsel muis te zuiveren wordt beschreven. Deze methode maakt gebruik van expressie van fluorescerende reporter allelen van discrete populaties isoleren door middel van fluorescentie-geactiveerde cel sortering (FACS). De techniek kan worden toegepast neuronale subpopulaties isoleren door ontwikkeling of volwassen weefsels.

Een geoptimaliseerde Procedure voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) Isolatie van autonome neurale voorlopercellen uit viscerale organen van de foetus Muizen

Source: Yang, E., et al. Isolation of Single Intracellular Bacterial Communities Generated from a Murine Model of Urinary Tract Infection for Downstream Single-cell Analysis. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the manual isolation of single epithelial cells containing intracellular bacterial communities from infected mouse bladder using mouth micropipetting, enabling downstream single-cell analysis of viable host-associated E. coli populations in urinary tract infection...

Isolation of Mouse Bladder Epithelial Cells Containing Intracellular Bacterial Communities

De gevestigde model van transuretrale catheterisatie van muizen kan de studie blaas aandoeningen, met inbegrip van infectie van de urinewegen, maar kan alleen worden uitgevoerd bij vrouwtjes. Een nieuw model van mannelijke transuretrale instillation, gepresenteerde, kan onderzoek op een gebied dat gekenmerkt door sterke klinische en epizoötiologische verschillen tussen de geslachten.

Urineweginfectie in een kleine diermodel: transuretrale catheterisatie van mannelijke en vrouwelijke muizen

Hier tonen we de prestaties van een minimale ruggenmerg letsel model in een volwassen muis die de centrale kanaal niche huisvesting endogene neurale stamcellen (NSCs spaart). Laten we zien hoe de bepaling van de neurosphere kan worden gebruikt voor het kwantificeren van activering en migratie van definitieve en primitieve NSCs na verwonding.

Een test van de Neurosphere voor de evaluatie van de activering van de endogene neurale stamcellen in een muismodel van minimale dwarslaesie

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om één, besmet-blaas epitheliale cellen van een lymfkliertest model van urineweginfectie te isoleren.

Isolatie van één intracellulaire bacteriële gemeenschappen gegenereerd op basis van een lymfkliertest Model van urine landstreekbesmetting Downstream eencellige p.a.

Dit protocol probeert een herhaalbaar protocol vast te stellen voor primaire neuronen en glia-isolatie van rattenblaas voor verdere cellulaire experimenten.

Isolatie en cultuur van primaire neuronen en Glia van volwassen rat urineblaas

Dit neurale celdissociatieprotocol is bedoeld voor monsters met een lage hoeveelheid uitgangsmateriaal en levert een zeer levensvatbare eencellige suspensie op voor downstream-analyse, met optionele fixatie- en kleuringsstappen.

Gecombineerde mechanische en enzymatische dissociatie van hippocampusweefsel van muizenhersenen

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren en karakteriseren van muis urotheliale organoïden die deleties in genen van belang herbergen. De methoden omvatten het oogsten van muizenurotheelcellen, ex vivo transductie met adenovirus dat Cre-expressie drijft met een CMV-promotor, en zowel in vitro als in vivo karakterisering.

Ex Vivo Organoïde model van Adenovirus-Cre gemedieerde gendeleties in muizen urotheelcellen

Dit protocol schetst de isolatie van gezuiverde astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen, waardoor latere toepassingen zoals RNA-analyse en celkweek worden vergemakkelijkt. Het bevat gedetailleerde methoden en procedures voor celdissociatie die zijn ontworpen om zowel de kwaliteit als de opbrengst van geïsoleerde cellen te verbeteren.

Isolatie van pure astrocyten en microglia uit het ruggenmerg van volwassen muizen voor in-vitrotests en transcriptomische onderzoeken

Deze studie presenteert twee cruciale experimentele technieken: de constructie van een muiswondmodel voor het beoordelen van wondsluiting en de voorbereiding van suspensies van enkele cellen uit muishuid om de celviabiliteit te behouden.

Muizenwondmodellen en het bereiden van single-cell suspensies

Leer een geoptimaliseerde weefseldissociatiemethode voor enkelvoudige-celanalyse van muizenblaas na ruggenmergletsel met behulp van flowcytometrie. Deze techniek genereert hoog levensvatbare celpopulaties.

Een eencellige dissociatiebenadering voor moleculaire analyse van urineblaas in de muis na ruggenmergletsel

Meer video's verkennen