Een eencellige dissociatiebenadering voor moleculaire analyse van urineblaas in de muis na ruggenmergletsel

Dit protocol is belangrijk omdat het biologische informatie gebruikt om de generatie van een enkele celsuspensie met een hoge cellevensvatbaarheid te vergemakkelijken. Het grote voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om enkele celsuspensies te genereren die een hoge cellevensvatbaarheid en een passende vertegenwoordiging van de geïsoleerde celtypen behouden. Het aantoonbaar maken van de chirurgische procedure zal worden gedaan door Hussein Atta, een collega in mijn laboratorium.

Het aantoonbaar maken van de weefseldissociatieprocedure zal worden gedaan door Ali Hashemi, en de FACS-analyse, Yaser Heshmati. Na het bevestigen van een gebrek aan respons op peesreflex bij een volwassen anesthetische muis, palpeert u het meest prominente spinaaluitsteeksel in de thoracale wervelkolom. Pijnstillers en antibiotica worden toegediend vóór de operatie.

Scheer een longitudinaal rechthoek op de rug van de muis vanaf de onderhals tot net onder het meest prominente spinaaluitsteeksel en een centimeter aan elke kant van de middenlijn. Desinfecteer de blootgestelde huid drie keer met sequentiële 10%povidoonjodium en 70%ethanoldoekjes in een cirkelvormige beweging, beginnend bij de plaats van incisie en naar buiten toe werkend. Na de laatste afveging, bedek de muis met een steriele 4 bij 4 inch stuk gaasje met een raam boven het chirurgische veld.

Om de ruggenmergletsel te induceren, maakt u eerst een 1,5 centimeter incisie in het midden van de rug en gebruikt u scherpe stompe dissectie om de spieren te scheiden van de spinaaluitsteeksels en de laminae van de T9, T10 en T11 wervels. Gebruik fijne schaar om de interspinale ligamenten tussen T9 en T10 en T10 en T11 scherp te verdelen voordat u een bilaterale laminectomie van het T10 spinaaluitsteeksel uitvoert. Wanneer de laminae volledig zijn verwijderd, gebruikt u de schaar om het ruggenmerg door te snijden.

Om de laterale kolommen volledig door te snijden, veegt u delicaat de punt van de fijne schaar aan beide zijden. Gebruik een steriele katoenen punt toepassing om eventuele bloedingen te comprimeren. Nadat de hemostasis is bereikt, sluit u de huid met 7-0 polyglactine910 continue hechtingen en levert u subcutaan één milliliter zoutoplossing af om postoperatieve uitdroging te voorkomen, en brengt u het dier terug naar een frisse kooi met bewaking tot volledige recumbentie.

Elke 12 uur, het dier met één hand vasthouden en met de andere het onderste deel van de buik masseren, gebruikt u de wijs- en middelvinger om de opgezwollen urineblaas te lokaliseren en voorzichtig samen te knijpen om handmatige blaasexpressie te stimuleren totdat het dier in staat is om zelfstandig te plassen. Voor downstream-analyse van de blaasceltypen van belang, op het juiste experimentele tijdstip en zodra het dier voldoende verdoving heeft, voer een middenlijnlaparotomie uit van het bekken tot het middenrif en snijd het middenrif los van de ribben. Volg de botkraakbeengrens parallel aan het borstbeen, open de borstkas langs de ribben aan beide zijden van het dier, beginnend bij het middenrif en doorgaande tot de eerste rib.

Na het fixeren van de voorste thoracale wand boven het hoofd van het dier, gebruikt u fijne schaar om het pericard af te snijden en sluit u een 23 gauge naald aan op het perfusieapparaat. Steek de naald in het linker ventrikel en duw de naald langzaam in de aorta zonder het weefsel te puncteren. Wanneer de naald op zijn plaats is, begint u met het infunderen van het weefsel met PBS met een stroomsnelheid van 15 milliliter per minuut en gebruikt u de uiteinden van een paar fijne schaar om snel een kleine snede in het rechter atrium te maken.

Wanneer de drainage helder is en een verlichte leverkleur kan worden waargenomen, stopt u de perfusie en bevrijdt u de blaas van de vasculaire pedikels en urethra, en plaatst u de blaas in een microcentrifugebuisje met ijskoud Tyrode's oplossing. Om een enkele celsuspensie te bereiden, wanneer alle blaasjes zijn verzameld, scheurt u een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met 100 microliter Tyrode's oplossing. Na het wegen, hak de blaasjes fijn in een 10 centimeter petrischaaltje met 100 microliter Tyrode's oplossing en gebruik een breedbuisige pipettepunt om de weefselfragmenten over te brengen in 2,5 milliliter spijsverteringsbuffer per blaasje.

Incubeer het weefsel gedurende 40 minuten bij 37 graden Celsius op een Nutatormixer en gebruik een vijf milliliter pipettepunt om de steekproef gedurende één minuut te tritureren voordat u de gedissocieerde cellen en weefsels verzamelt door centrifugatie. Resuspendeer de pellet in één milliliter celafvoeroplossing en plaats de cellen gedurende een extra 10 minuten op de Nutatormixer. Aan het einde van de incubatie, verzamel de cellen met een andere centrifugatie en resuspendeer de pellet in één milliliter rode cellysebuffer.

Na één minuut, stop de lyse met de toevoeging van negen milliliter PBS en filter de cellen door een 70 micrometer zeef in een 50 milliliter buis, centrifugeer vervolgens de cellen opnieuw en resuspendeer de pellet in 200 microliter kleuringsbuffer aangevuld met FC-blok. Na een 10-minuten incubatie op ijs, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspendeer de pellet in het juiste volume van fluorofoor geconjugeerd antilichaam master mix gedurende 20 minuten op ijs beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de cellen met één milliliter celkleuringsbuffer en resuspendeer de pellet in 100 microliter vers celkleuringsbuffer aangevuld met vijf microliter FITC Annexine V en één microliter propidiumjodide.

Na 15 minuten op kamertemperatuur, voeg 400 microliter Annexine-bindingbuffer toe aan de cellen en meng door omkering. Om de cellen door middel van flowcytometrie te analyseren, gebruikt u eerst een ongekleurd celmonster om de side en forward scatter parameters van de cellen in te stellen, meet vervolgens de fluorescentie-emissie bij 530 nanometer en groter dan 575 nanometer om de dode cellen uit te sluiten. Gebruik de rasters op elke dot blot om de negatieve populatie in de eerste verval te definiëren en gebruik de fluorescentie minus één control