Name: Grafeen behuizing van chemisch vaste zoogdiercellen voor vloeibare fase elektronenmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer hoe je membraanproteïnen in intacte zoogdiercellen labelt met HER2-markering en grafeen gebruikt voor vloeibare-fase elektronenmicroscopie. Deze methode behoudt de native omgeving en minimaliseert elektronenbundelartefacten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken D. B. Peckys voor hulp met het celcultuurprotocol, F. Weinberg voor het herzien van het manuscript, T. Trampert voor hulp met de experimenten en de cijfers, S. Smolka voor hulp met de cijfers, en E. Arzt voor zijn steun door INM. Dit onderzoek wordt gefinancierd door Else Kröner-Fresenius-Stiftung.

<ol><li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-field+optical+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-field optical nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li>
<li>Williams, D. B., Carter, C. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+DB+%22The+Transmission+Electron+Microscope%22">The Transmission Electron Microscope</a>. , Springer. (2009).</li>
<li>Bozzola, J. J., Russell, L. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBozzola%2C+JJ+%22Electron+Microscopy+Principles+and+Techniques+for+Biologists%22">Electron Microscopy Principles and Techniques for Biologists</a>. , Jones and Barlett Publishers. (1999).</li>
<li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li>
<li>Lucic, V., Leis, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography+of+cells%3A+connecting+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography of cells: connecting structure and function.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 185-196 (2008).</li>
<li>Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+technical+elements+of+freeze-fracture%2Ffreeze-etch+in+biological+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (91), e51694(2014).</li>
<li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> Journal of Structural Biology. 169 (3), 438-449 (2010).</li>
<li>Dahmke, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+Liquid+Enclosure+for+Single-Molecule+Analysis+of+Membrane+Proteins+in+Whole+Cells+Using+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy.</a> ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).</li>
<li>Maruyama, Y., Ebihara, T., Nishiyama, H., Suga, M., Sato, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno+EM-OM+correlative+microscopy+in+solution+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy+%28ASEM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Immuno EM-OM correlative microscopy in solution by atmospheric scanning electron microscopy (ASEM).</a> Journal of Structural Biology. 180 (2), 259-270 (2012).</li>
<li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 469-483 (2014).</li>
<li>Hauwiller, M. R., Ondry, J. C., Alivisatos, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+graphene+liquid+cell+transmission+electron+microscopy+to+study+in+situ+nanocrystal+etching%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using graphene liquid cell transmission electron microscopy to study in situ nanocrystal etching.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57665(2018).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Use+of+Graphene+and+Its+Derivatives+for+Liquid-Phase+Transmission+Electron+Microscopy+of+Radiation-Sensitive+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid-Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens.</a> Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2017).</li>
<li>Meng, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene-Based+Fibers%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Graphene-Based Fibers: A Review.</a> Advanced Materials. 27 (35), 5113-5131 (2015).</li>
<li>Sun, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+on+gas+impermeability+of+graphene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Limits on gas impermeability of graphene.</a> Nature. 579 (7798), 229-232 (2020).</li>
<li>Kato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-precision+thickness+control+of+ice+layer+on+CVD+grown+bilayer+graphene+for+cryo-TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Carbon%22%5BJournal%5D)">High-precision thickness control of ice layer on CVD grown bilayer graphene for cryo-TEM.</a> Carbon. 160, 107-112 (2020).</li>
<li>Keskin, S., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Radiation+Damage+in+Transmission+Electron+Microscopy+of+Proteins+in+Graphene+Liquid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Reduced Radiation Damage in Transmission Electron Microscopy of Proteins in Graphene Liquid Cells.</a> Nano Letters. 18 (12), 7435-7440 (2018).</li>
<li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nature Methods. 2, 743-749 (2005).</li>
<li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 273-283 (2011).</li>
<li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence+and+liquid+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. 1 (6), 1500165(2015).</li>
<li>Eigenbrot, C., Ultsch, M., Dubnovitsky, A., Abrahmsen, L., Hard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+high-affinity+HER2+receptor+binding+by+an+engineered+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (34), 15039-15044 (2010).</li>
<li>Textor, M., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+Preparing+Graphene+Liquid+Cells+for+Transmission+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Strategies for Preparing Graphene Liquid Cells for Transmission Electron Microscopy.</a> Nano Letters. 18, 3313-3321 (2018).</li>
<li>Henjes, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+EGFR+signaling+in+cell+line+models+of+ERBB2-amplified+breast+cancer+attenuates+response+towards+ERBB2-targeting+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">Strong EGFR signaling in cell line models of ERBB2-amplified breast cancer attenuates response towards ERBB2-targeting drugs.</a> Oncogenesis. 1, 16(2012).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+Stoichiometry+of+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+in+Intact+Cells+using+Correlative+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (103), e53186(2015).</li>
<li>Pirkmajer, S., Chibalin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+starvation%3A+caveat+emptor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Serum starvation: caveat emptor.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 301 (2), 272-279 (2011).</li>
<li>Kohl, H., Reimer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKohl%2C+H+%22Transmission+electron+microscopy%3A+physics+of+image+formation%22">Transmission electron microscopy: physics of image formation</a>. , Springer. (2008).</li>
<li>Yi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+immunogold+labeling+of+cell+surface+proteins+and+viral+glycoproteins+for+cryo-electron+microscopy+and+cryo-electron+tomography+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Native immunogold labeling of cell surface proteins and viral glycoproteins for cryo-electron microscopy and cryo-electron tomography applications.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (10), 780-792 (2015).</li>
<li>Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-scanning+transmission+electron+tomography+of+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cryo-scanning transmission electron tomography of vitrified cells.</a> Nature Methods. 11 (4), 423-428 (2014).</li>
<li>Dukes, M. J., Ramachandra, R., Baudoin, J. P., Jerome, W. G., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+locations+of+gold-labeled+proteins+in+a+whole+mount+eukaryotic+cell+obtained+with+3+nm+precision+using+aberration-corrected+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional locations of gold-labeled proteins in a whole mount eukaryotic cell obtained with 3 nm precision using aberration-corrected scanning transmission electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 174, 552-562 (2011).</li>
<li>Meier, C., Beckmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+fracture%3A+new+avenues+for+the+ultrastructural+analysis+of+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Freeze fracture: new avenues for the ultrastructural analysis of cells in vitro.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (1), 3-13 (2018).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+scanning+transmission+electron+microscopy%3A+imaging+protein+complexes+in+their+native+environment+in+whole+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Liquid scanning transmission electron microscopy: imaging protein complexes in their native environment in whole eukaryotic cells.</a> Microscopy and Microanalysis. 20 (2), 346-365 (2014).</li>
<li>Egerton, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+radiation+damage+in+the+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Control of radiation damage in the TEM.</a> Ultramicroscopy. 127, 100-108 (2013).</li>
<li>Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene-enabled+electron+microscopy+and+correlated+super-resolution+microscopy+of+wet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Graphene-enabled electron microscopy and correlated super-resolution microscopy of wet cells.</a> Nature Communications. 6, 7384(2015).</li>
<li>Huebinger, J., Spindler, J., Holl, K. J., Koos, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+protein+mobility+and+associated+reshuffling+of+cytoplasm+during+chemical+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Quantification of protein mobility and associated reshuffling of cytoplasm during chemical fixation.</a> Scientific Reports. 8 (1), 17756(2018).</li>
<li>Glauert, A. M., Lewis, P. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlauert%2C+AM+%22Biological+specimen+preparation+for+transmission+electron+microscopy%22">Biological specimen preparation for transmission electron microscopy</a>. , Princeton University Press. (2014).</li>
<li>Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell+Electron+Microscopy+Using+Graphene+Veils%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Live Cell Electron Microscopy Using Graphene Veils.</a> Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%2C+2+edn%22">Handbook of biological confocal microscopy, 2 edn</a>. , Springer. (1995).</li>
<li>Chung, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464 (7289), 783-787 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Om de eiwitfunctie beter te begrijpen, is het belangrijk om informatie te verkrijgen over eiwitlocaties in het plasmamembraan van intacte cellen. Methoden voor het verkrijgen van deze informatie omvatten superresolutie fluorescentie microscopie1,2. Hoewel de microscopie met superresolutie zich de afgelopen jaren verder heeft ontwikkeld, is de resolutie ervan nog steeds beperkt tot ongeveer 20 nm voor praktische omstandigheden van celexperimenten, terwijl typische receptoreiwitten maten hebben in het bereik van 1-10 nm. De beeldvorming van eiwitten op eencellig en enkelvoudig molecuulniveau met voldoende resolutie om eiwitten te visualiseren is mogelijk met EM. Maar als gevolg van sectioning, conventionele EM-methoden meestal niet laat de cel intact26, wat leidt tot het verlies van belangrijke informatie over de context en de ruimtelijke verdeling van eiwitten in het plasmamembraan. Methoden voor hele cellen met cryo-TEM zijn ontwikkeld6, is het haalbaar om eiwit etikettering te combineren met cryo-EM27, ook cryo-STEM is aangetoond28. Cryo-EM workflows zijn echter geoptimaliseerd voor het bestuderen van de cellulaire ultrastructuur en eiwitstructuur, en niet zozeer voor het analyseren van membraaneiwit ruimtelijke distributies. Kritiek punt drogen is een andere hele cel voorbereiding methode, maar de monsters worden onderworpen aan verschillende droogstappen, en de techniek is zeer tijdrovend29. Membraaneiwitten zijn ook onderzocht via vriesfractuur7. Bij deze methode worden cellen vast, bevroren en gebroken. De gebroken delen worden gerepliceerd door koolstof- en platinalagen en het biologische monster wordt verwijderd. De replica's kunnen vervolgens worden geanalyseerd met EM30. Hele celanalyse is onmogelijk met vriesfractie omdat informatie over de verdeling van eiwitten in het membraan binnen de context van de hele cel verloren gaat.
De hier gepresenteerde methode maakt het mogelijk het celmembraan te bestuderen zonder het monster9,31te hoeven snijden. De cellen worden intact gehouden zodat de lokalisatie van de membraaneiwitten zichtbaar is van de fluorescentiebeelden, die gecorreleerd zijn met de EM-beelden. Het bestuderen van eiwitten op het niveau van één cel en enkelvoudig molecuul in intacte cellen in gehydrateerde toestand heeft aangetoond mogelijk te zijn met een resolutie van 2 nm met behulp van STEM van QD gelabelde eiwitten met behulp van deze grafeenbehuizingsmethode9. Het houden van cellen in hun eigen staat is van cruciaal belang, omdat het de ruimtelijke verdeling van membraaneiwitten zodanig behoudt dat analyses mogelijk zijn op het niveau van één cel en enkelvoudig molecuul, wat belangrijk is voor het begrijpen van eiwitfuncties, en het ontwikkelen van nieuwe geneesmiddelen voor therapiebenaderingen.
Een ander kritiek aspect van beeldvorming biologische monsters met EM is de stralingsschade van de monsters veroorzaakt door de elektronenbundel. Oplossingen omvatten vaak de vermindering van de elektronendosis zoveel mogelijk of verschillende coatingmethoden, zoals het inkapselen van het monster tussen dunne lagen koolstof32. Onze methode toont aan dat grafeen coating vermindert beam-geïnduceerde artefacten die ontstaan op het celoppervlak voor niet-gecoate monsters. Onderzoek van de chemisch vaste, en grafeen gecoate biologische monsters is mogelijk onder elektronenbundel bestraling bij 200 keV straal energie tot D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2 zonder stralingsschade, zoals heldere vlekken, verschijnen op het monster. In vergelijking met andere EM-methoden die een uitgebreide monstervoorbereiding omvatten, bijvoorbeeld kleuring, inbedding, (cryo-) secties, breken, enz., is de hier beschreven methode minder tijdrovend. Etikettering van de eiwitten wordt uitgevoerd binnen een paar uur, en grafeen coating vereist slechts ongeveer 15 minuten voor opgeleide onderzoekers. Het monsterpreparaat is vergelijkbaar met de procedures die nodig zijn voor fluorescentiemicroscopie.
Het protocol kan in sommige stappen worden gewijzigd. Het grafeen op de microchip kan ook worden gedroogd om ervoor te zorgen dat het grafeen niet beweegt wanneer het met een filterpapier wordt uitgewist. Als het grafeen met zout is verontreinigd, is het mogelijk om het ongeveer een uur op het wateroppervlak te laten drijven om het zout op te lossen en zo verontreiniging te minimaliseren. Voorkomende koper- of PMMA-verontreiniging op het grafeen kan worden verminderd door de bijbehorende etsstappen in het protocol uit te breiden. Andere grafeencoatingmethoden zijn beschreven waarbij bijvoorbeeld grafeen-PMMA rechtstreeks op cellen werd afgezet en de PMMA werd verwijderd door het wassen in aceton achteraf33. In onze methode werd PMMA verwijderd voordat de coating werd verwijderd om eventuele schade aan de cellen veroorzaakt door extra acetonwasstappen te voorkomen. NaCl werd gekozen als een substraat hier omdat het plat is, dus het kreukt het grafeen niet, en het lost op in water om het grafeen9vrij te geven. Bovendien kan het in de gewenste grootte worden gesneden en blijven er geen substraatresten over op het grafeen. Maar rekening houdend met deze criteria, kunnen ook andere substraten zoals kaliumchloride worden gebruikt.
Om de kans op potentiële label-geïnduceerde clustering te verminderen, kan de GA fixatie stap direct na FA fixatie worden geïmplementeerd, waarna alle membraaneiwitten worden geïmmobiliseerd. De eerste fixatiestap met FA bevestigt al de biologische structuur, maar een verlaagd niveau van membraaneiwitdiffusie kan nog steeds optreden34, wat mogelijk leidt tot label geïnduceerde clustering als gevolg van de aanwezigheid van meerdere Streptavidin per QD. Fixatie met GA kan leiden tot een autofluorescentiesignaal tijdens LM, en wordt daarom na LM in het beschreven protocol gedaan, maar kan worden verminderd zoals elders beschreven34. Cacodylaat buffer is vrij giftig, en andere fixatiemiddelen kunnen ook worden gebruikt, maar cacodylaat wordt hier gebruikt omdat het een veelgebruikte buffer voor EM-protocollen is, neerslag vermijdt, de groei van bacteriële en schimmels voorkomt en compatibel is met calciumionen die nodig zijn om de ultrastructurele integriteit van lipidemembranen te behouden35. Indien nodig kan osmiumteroxide worden gebruikt als extra fixatie voor het stabiliseren van de lipiden. Dit zou helpen om het contrast van de celstructuur te verbeteren, maar ook een ander metaal toe te voegen aan het systeem en het contrast verkregen op de QDs te verminderen.
Het hier beschreven protocol bevat veel stappen die een goede instructie vereisen. Enige training is vereist voor het hanteren van microchips om krassen op het SiN-oppervlak van de microchips te voorkomen en breuk te voorkomen. Zoals eerder vermeld, is het raadzaam om microchips in duplicaten te bereiden, omdat het SiN-venster van tijd tot tijd kan breken. Het verkrijgen van het vereiste aantal cellen op een microchip vereist ook enige ervaring. Coating van de cellen met grafeen heeft enige training nodig, omdat het moeilijk kan zijn om de juiste kantelhoek te vinden om grafeen op water te zweven. Bij het vangen van het grafeen uit water, kan het ook moeilijk zijn om het dunne grafeen te zien. Zodra het grafeen op de microchip staat, moet overtollig water worden afgewimpeld met een filterpapier. Dit mag alleen worden gedaan met de punt van een filter papier om te voorkomen dat het grafeen uit de microchip.
Grafeencoating voorkwam dat artefacten op het monster konden worden weergegeven. Maar voor D < 4 x 102 e-/ Å2 ook geen artefacten ontstaan voor de niet-gecoate monster, en artefacten verscheen voor 2 niet-gecoate monsters alleen. Zo lijken onderzoeken van niet-gecoate cellen ook mogelijk, hoewel het beter zou zijn om grafeen te gebruiken en het risico van artefactvorming te vermijden. De samenstelling van deze artefacten kan worden geanalyseerd in de toekomst om hints te geven over hoe ze hun vorming te voorkomen. Wat de structurele stabiliteit van de cellen betreft, werd slechts een kleine verbetering van de grafeencoating waargenomen. De vaste cellen werden blijkbaar gestabiliseerd in de onderzochte dunne gebieden, waar hun structuur in dichte nabijheid van het membraan SiN was. Wat we hier niet hebben onderzocht, waren echter drogen artefacten waarvan bekend is dat ze optreden voor cellulaire monsters bij blootstelling aan vacuüm4. Het drogen van de cellen zou leiden tot krimp van de cellen, zodat ook de QD afstanden bijgevolg zouden veranderen. Voor de hier gebruikte elektronendosis bleef de afstand van QD's van met grafeen bedekte en niet-gecoate monsters stabiel. Verdere studies zijn nodig om het effect van grafeencoating op de cellen voor EM te onderzoeken.
Een beperking van deze methode is dat de chemische fixatie van de cellen noodzakelijk is; daarom kunnen geen levende celexperimenten worden uitgevoerd. Maar in het geval dat de etikettering niet nodig is en cellen met een hogere structurele stabiliteit worden gebruikt, bijvoorbeeld bacteriën, dan kunnen niet-vaste cellen worden ingesloten in grafeen voor EM36 zij het met een andere elektronendosistolerantie. Ook zijn de eiwitten niet direct detecteerbaar, dus QD's zijn nodig om de eiwitten te visualiseren. De methode zou profiteren van kleinere labels. Een punt van discussie is of het goed of slecht is dat de ultrastructuur niet duidelijk zichtbaar is. Onze methode is vergelijkbaar met die van fluorescentie microscopie waar alleen geselecteerde eiwitten zichtbaar zijn37. Het vergroten van de zichtbaarheid van de ultrastructuur zou ook veel meer informatie toevoegen aan de afbeelding, en dan op een gegeven moment voorkomen dat detectie van de individuele label posities. Bovendien is de hier beschreven methode voor één eiwitsoort, en toevoegingen van het protocol zijn nodig om meerdere eiwitten te kunnen labelen. Ten slotte werkt de methode wanneer een kleine hoge affiniteit specifiek bindende molecuul zoals antilichaam mimetische21 of nanobody38 beschikbaar is. Veelgebruikte antilichamen zijn veel groter en zouden de detectie van de functionele toestand van de eiwitsubeenheden in oligomeren voorkomen.
Onze methode is nuttig voor het bestuderen van eiwitfunctie op hele cellen met behulp van EM terwijl de cellen in gehydrateerde toestand. Het is gemakkelijk mogelijk om reeksen cellen te onderzoeken. Andere soorten cellen en eiwitten kunnen ook worden bestudeerd. Als eiwitlabeling niet nodig is, kan een deelverzameling van het protocol worden gebruikt voor grafeencoating van grote verscheidenheid aan biologische specimens. De mogelijkheid om hele cellen te bestuderen is relevant in cellulair onderzoek voor het begrijpen van correlaties van membraaneiwitfunctie op moleculair niveau.

Analyse van membraaneiwitfunctie is essentieel voor celbiologisch onderzoek en voor de ontwikkeling van geneesmiddelen. Een klasse van belangrijke experimenten omvat het onderzoek van membraan eiwitposities in cellen. Deze informatie kan worden gebruikt om conclusies af te leiden over de assemblage van eiwitten in eiwitcomplexen en hun specifieke locaties in het plasmamembraan, die, via dynamische assemblage en demontage, een breed scala aan cellulaire functies aandrijft. Onder andere technieken, lichtmicroscopie (LM) en elektronenmicroscopie (EM) worden gebruikt voor het bestuderen van eiwitfuncties in cellen. LM maakt de analyse van hele cellen in vloeistof mogelijk; de resolutie is echter beperkt tot 200-300 nm voor conventionele en tot 20 nm voor superresolutie fluorescentiemicroscopie onder praktische omstandigheden1,2. EM biedt ongeveer 1 Å resoluties3,maar conventionele monster voorbereiding vereist uitdroging, metalen vlekken om het beeldcontrast te verbeteren, en inbedding in een montage stof, zoals hars, voor transmissie elektronen microscopie (TEM)4. Om biologische monsters in een meer native-achtige omgeving te bewaren, kunnen cryo-EM-technieken worden gebruikt5,6. De monsters worden snel ingevroren in amorf ijs, en, indien nodig, ge sectionteerd. Een andere optie is freeze-breken EM7.
EM-technieken voor het bestuderen van membraaneiwitten in intacte cellen in hun oorspronkelijke, vloeibare toestand zijn in het afgelopen decennium8,9,10,11ontstaan .9 Een ruimtelijke resolutie van 2 nm werd bereikt op quantum dot (QD) gelabelde membraaneiwitten in hele cellen gekweekt op een SiN-membraan en omsloten door een laag grafeen9.
Hier worden details beschreven van een protocol voor eiwitlabeling en grafeencoating9,12. Het doel van dit protocol is om de ruimtelijke verdeling van HER2 te analyseren in het membraan van hele, vaste cellen, met behoud van de cellen in een gehydrateerde toestand. Coating met grafeen voorkomt drogen van de cellen in vacuüm, en vermindert ook stralingsschade13. Deze methode biedt informatie over gelabelde membraaneiwitten in het intacte plasmamembraan, maar de methode is niet nuttig voor het bestuderen van de cellulaire ultrastructuur zoals gewoonlijk wordt gedaan met EM.
Grafeen is het dunste nanomateriaal bekend, en bestaat uit een enkel koolstofatoom dikke kristallijne plaat gerangschikt in een honingraat rooster14. Het heeft unieke eigenschappen, waaronder hoge flexibiliteit en mechanische sterkte. Recent onderzoek heeft aangetoond dat defectvrij grafeen ondoordringbaar is voor gassen en vloeistoffen, maar gebreken maken waterstofpermeatiemogelijk 15. Deze lekkage kan worden verminderd door het gebruik van meerlaags grafeen zoals hier gebruikt. Bilayer grafeen heeft onlangs aangetoond nuttig te zijn als een steun voor cryo-EM monsters, het verbeteren van de homogeniteit van de dunne ijslaag in vergelijking met grafeenoxide waar alleen niet-uniforme lagen kunnen worden gevormd16. Grafeen bleek ook de bundelschade van biologische monsters te verminderen tijdens de vloeibare fase transmissie elektronenmicroscopie13,17. Als voorbeeldig experiment werd HER2, uitgedrukt in de borstkankercellijn VAN ZOogdieren, AANGEDUID MET QDs18 en de ruimtelijke verdeling ervan geregistreerd met STEM. Cellen werden gezaaid op een Si microchip met een elektron transparante SiN membraan19. De microchips zijn gekozen als ondersteuning omdat ze robuust zijn, compatibel met LM en EM, en de gehele etiketteringsprocedure kan direct op de microchip19worden uitgevoerd. Na de celbevestiging werd HER2 gelabeld met een labelprotocol20in twee stappen. Eerst werd een biotinylated anti-HER2 antilichaam mimetische verbinding21 bevestigd aan HER2. De cellen werden vervolgens chemisch bevestigd om label-geïnduceerde receptorclustering te voorkomen en om de stabiliteit van de cellulaire ultrastructuur te verhogen. Streptavidin-gecoate QD's werden vervolgens gekoppeld aan het HER2-antilichaam mimetisch complex. Het heldere fluorescentiesignaal en de elektronendichte kern van de QDs maakten correlatieve fluorescentie- en elektronenmicroscopie (CLEM)20mogelijk . CLEM is vooral handig omdat cellulaire regio's die van belang zijn voor STEM-analyse kunnen worden geselecteerd uit het overzicht fluorescentiemicroscopie afbeeldingen die de lokalisatie van HER2 op de cellen benadrukken. Cellen werden geanalyseerd door fluorescentie microscopie om cellulaire regio's met hoge HER2-niveaus te identificeren. Daarna werd een 3-5 laag dikke plaat van grafeen overgebracht op de cellen voor coating9,22. Vervolgens werd het monster gemonteerd in een EM-specimenhouder. STEM-gegevens werden verkregen met behulp van de ringvormige donkere veld (ADF) detector, het verstrekken van informatie over de ruimtelijke verdeling van HER2 op het celoppervlak ten opzichte van het celoppervlak locatie, maar het geven van geen informatie over de ultrastructuur van de cel. Om de stabiliteit van het monster onder elektronenbundelbestraling te bepalen, werden de monsters onderzocht bij toenemende dosis(D)in een beeldreeks. Het verschil tussen grafeengecoate en niet-gecoate monsters werd onderzocht. Verschillende soorten stralingsschade werden geëvalueerd.
Het hier beschreven protocol maakt gebruik van de HER2 overexpressie zoogdier borstkanker cellijn SKBR3 als een model systeem voor het richten van HER223. Het protocol omvat de voorbereiding van een grafeen gecoate monster, en een soortgelijk monster, maar zonder grafeen coating voor vergelijking. Het experiment wordt in tweevoud voorbereid omdat het SiN-venster eens per keer kan breken en in de meeste gevallen een experimenteel duplicaat kan verkrijgen. De totale opbrengst van de methode is hoog, wat betekent dat microchips met met grafeen bedekte cellen meestal worden verkregen met een uitzonderlijke fout, hoewel niet het hele SiN-venster in alle gevallen met grafeen kan worden bedekt. Duplicaten worden niet beschreven in het protocol.
Het etiketteringsprotocol (stap 1-5) is vergelijkbaar met het protocol van de etikettering van de epidermale groeifactorreceptor in COS7 fibroblastcellen die eerder24zijn gepubliceerd; details in dat papier worden genoemd met betrekking tot de behandeling van de microchips, en het gebruik van de put platen. Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor het labelen van HER2, grafeencoating9en het onderzoeken van de stralingstolerantie van het monster.

<table><tbody><tr><td>Aceton voor HPLC (min. 99,8 %)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Duitsland</td><td>2626-1L</td><td></td></tr><tr><td>AL54 analytische balans</td><td>Mettler-Toledo GmbH, Giessen, Duitsland</td><td>30029077</td><td></td></tr><tr><td>Albumine Fractie V, biotin-vrij, &ge; 98 %, voor moleculaire biologie</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Duitsland</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HER2 Affibody Molecule, biotin geconjugeerd 20 &micro;M</td><td>Affibody, Solna, Zweden</td><td>10.0817.02.0001</td><td></td></tr><tr><td>analytisch microscoop met atoomresolutie JEM-ARM200F</td><td>JEOL (Germany) GmbH, Freising, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cacodylzuur natriumzout trihydraat &ge; 98 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Duitsland</td><td>5169.1</td><td></td></tr><tr><td>Cell Cultuur Flacons, PS, behandeld, steriel, Filterschroefdop 50ml</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Duitsland</td><td>7696781</td><td></td></tr><tr><td>Cell Cultuur Flacons, PS, behandeld, steriel, Filterschroefdop 250ml</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Duitsland</td><td>7696782</td><td></td></tr><tr><td>Cell Cultuur Multiwell platen, behandeld, 24-well</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Duitsland</td><td>7696792</td><td></td></tr><tr><td>Cell Cultuur Multiwell platen, behandeld, 96-well</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Duitsland</td><td>7696794</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Cultuur Flacons TC behandeld, 250 ml</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Duitsland</td><td>658170</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Cell Cultuur Multiwell Platen 96-well</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Duitsland</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR Centrifugeerbuizen 15 ml steriele</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Duitsland</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>CELLview cell cultuur schaal, PS, 35/10mm, glazen bodem, 1 compartiment</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Duitsland</td><td>627861</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5418</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Duitsland</td><td>5401000010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeerbuizen 50 ml steriele</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Duitsland</td><td>7696705</td><td></td></tr><tr><td>Corning CellStripper niet-enzymatisch oplossing voor celdissociatie</td><td>Corning, NY, USA</td><td>25-056-CI</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Saccharose min. 99,7 %, poedervormig</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Duitsland</td><td>9286.1</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Hemocytometer C-Chip Neubauer verbeterd</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Duitsland</td><td>PK36.1</td><td></td></tr><tr><td>Easypet</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Duitsland</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipetten variabel, 0,1 - 2,5 &micro;l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Duitsland</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette variabel, 2 -20 &micro;l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Duitsland</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette variabel, 10 - 100 &micro;l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Duitsland</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus pipette variabel, 100 - 1000 &micro;l</td><td>Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Duitsland</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absoluut voor HPLC (min. 99,9 %)</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Duitsland</td><td>2222-1L</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin-achtig gemodificeerd eiwit*poly mer-plus</td><td>Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Duitsland</td><td>F8141</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop Leica DMI6000</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), hoge glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Foetaal Rundserum (FCS)</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>10099141</td><td>lot nummer: 1751893</td></tr><tr><td>Gibco Geitenserum, Nieuw-Zeelandse oorsprong</td><td>FisherScientific, Hampton, NH, USA</td><td>16210064</td><td>lot nummer: 1788320</td></tr><tr><td>Gibco Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10010015</td><td></td></tr><tr><td>Galaxy 48R CO2 Incubator</td><td>New Brunswick, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Duitsland</td><td>CO48310001</td><td></td></tr><tr><td>Gatan Model 950 Solarus&mdash; Plasma Cleaner</td><td>Gatan GmbH, München, Duitsland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde-oplossing Grade I, 25% in H2O, speciaal gezuiverd voor gebruik als elektronenmicroscoopfixatief</td><td>Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Duitsland</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Glycine &ge; 98,5 % Ph.Eur., USP, BP</td><td>Carl Roth GmbH + Co KG, Karlsruhe, Duitsland</td><td>T873.1</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerde Laboratorium Microscoop Leica DM IL LED</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Duitsland</td><td>DM IL LED</td><td></td></tr><tr><td>Hot plate</td><td>Heidolph Instruments GmbH &amp; CO. KG, Schwabach, Duitsland</td><td>MR 3002</td><td></td></tr><tr><td>MEM niet-essentiële Aminozuren (NEAAs) 100x W/O L-Glutamine</td><td>Biowest, Nuaillé, Frankrijk</td><td>X0557-100</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglasjes 76 mm x 26 mm</td><td>DWK Life Sciences GmbH, Wertheim/Main</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microbuizen (1,5 ml, 2 ml) niet-steriel</td><td>Labsolute, Th. Geyer GmbH + Co. KG, Renningen, Duitsland</td><td>1,5 ml: 7696751

grafeen behuizing van chemisch vaste zoogdiercellen voor vloeibare fase elektronenmicroscopie

Graphene Enclosure of Chemically Fixed Mammalian Cells for Liquid-Phase Electron Microscopy

Een protocol wordt beschreven voor het onderzoeken van de menselijke epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) in het intacte plasmamembraan van borstkankercellen met behulp van scanning transmissie elektronenmicroscopie (STEM). Cellen van de zoogdier borstkanker cel lijn SKBR3 werden gekweekt op silicium microchips met silicium nitride (SiN) ramen. Cellen werden chemisch gefixeerd, en HER2-eiwitten werden gelabeld met quantum dot nanodeeltjes (QD's), met behulp van een twee-staps biotine-streptavidin binding protocol. De cellen werden bekleed met meerlaags grafeen om een gehydrateerde toestand te behouden en te beschermen tegen schade aan elektronenbundels tijdens STEM. Om de stabiliteit van de monsters onder elektronenbundelbestraling te onderzoeken, werd een dosisreeksexperiment uitgevoerd. Grafeen-gecoate en niet-gecoate monsters werden vergeleken. Beam geïnduceerde schade, in de vorm van heldere artefacten, verscheen voor sommige niet-gecoate monsters bij verhoogde elektronendosis D, terwijl er geen artefacten verschenen op gecoate monsters.

Figuur 1A toont cellen die zodanig zijn ingezaaid dat het venster bedekt is, maar voldoende ruimte heeft om ze af te vlakken en te hechten, wat leidt tot een samenloop van ongeveer 2/3rd (figuur 1B). In het geval dat er te veel cellen op een microchip worden gezaaid(figuur 1C),is er onvoldoende ruimte voor alle cellen om zich aan de microchip te hechten. Figuur 1D toont dezelfde microchip na 24 uur. Meer dan de helft van de cellen heeft niet afgevlakt. Aan de andere kant, als er te weinig cellen worden gezaaid (figuur 1E), zal het SiN-venster na 24 uur eindigen met een grote lege ruimte, zoals te zien is in figuur 1F. Figuur 1G toont de DIC-afbeelding van de cellen in figuur 1A en figuur 1B. Figuur 1H toont de overeenkomstige fluorescentie afbeelding vals gekleurd in geel aangeeft succesvolle etikettering van HER2.
Representatieve STEM-gegevens worden weergegeven in figuur 4. Grafeengecoate (linkerkolom) en niet-gecoate (rechterkolom) SKBR3 cellen werden onderzocht. Figuur 4A,B tonen M = 800x overzichtsafbeeldingen van de cellen op het venster. De gebieden die als insets werden weergegeven, werden afgebeeld bij M = 80.000x tijdens de dosisreeks, zie figuur 4C,D. De QD's zijn hier zichtbaar als lichtpuntjes. Figuur 4E en figuur 4F tonen M = 50.000x vergrote beelden die zijn verkregen op de locaties van de rechthoeken in figuur 4C,D. Beide beelden werden opgenomen na de verwerving van een dosisreeks met D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. De dosisserie werd geregistreerd bij M = 80.000x. De blootgestelde gebieden kunnen worden herkend als rechthoeken, waarbij de rechthoek duidelijk zichtbaar was voor het niet-gecoate monster (figuur 4F).
Om de aanwezigheid van grafeen te verifiëren, werden diffractiepatronen van gebieden zonder cellen, maar met of zonder grafeen op het SiN-venster verworven. De zeshoekige structuur van het grafeen werd waargenomen in het diffractiepatroon van het met grafeen gecoate monster (figuur 4G),terwijl het afwezig was voor het niet-gecoate monster (figuur 4H). Het diffractiepatroon van enkel kristalgrafeen zal zesvoudige symmetrie hebben als gevolg van een hoogst geordende zeshoekige structuur van grafeen. De zeshoekige structuur geeft de aanwezigheid van grafeen op de monsters aan.
Om het effect van elektronenbundelverlichting op het monster te onderzoeken, werden STEM-beelden verkregen in een beeldreeks met een accumulerende elektronendosis. Representatieve resultaten voor monsters met niet-gecoate en grafeencoating zijn respectievelijk weergegeven in figuur 5A-D en figuur 5E-G. Alle gegevens werden verkregen aan de rand van de cel, waar de cel de platste is, en de waargenomen structuur is dus het dichtst bij het SiN-membraan. De blootstelling van een niet-gecoate monsters leidde tot heldere structuren die op de celoppervlakken bij D = (1,9 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (figuur 5B) verschenen. Deze structuren werden groter met hogere doses, dus ze waren duidelijk zichtbaar in het laatste beeld van de serie bij D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2 (Figuur 5C,D). Deze vlekken verschenen niet op een van de met grafeen gecoate monsters(figuur 5E-G).
Aanvullende microchips werden bereid en onderzocht met behulp van het protocol beschreven in het bovenstaande. In totaal werden zes gecoate en zeven niet-gecoate monsters onderzocht. Twee van de zeven niet-gecoate monsters toonden deze artefacten. Geen van de gecoate monsters toonde geen extra lichtpuntjes.
Als een andere maatregel van stralingsschade, werd de afstand tussen QDs onderzocht. Als er structurele schade zou optreden, zou men verwachten dat de afstanden tussen QD's zullen veranderen. Veranderingen in afstanden werden gemeten voor verschillende paren QDs met het accumuleren van D voor een reeks paarafstanden. Figuur 5H toont aan dat de relatieve verandering van de deeltjes voor niet-gecoate monsters gemiddeld onder de 1,3% bleef, terwijl de gemiddelde relatieve afstand voor de gecoate monsters onder 0,8% bleef. Men kan dus concluderen dat de grafeencoating het monster stabiliseerde, maar de gedroogde monsters zonder grafeencoating waren ook opmerkelijk stabiel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig01.jpg"> Figuur 1: Celzaaien op een SiN-venster van een siliciummicrochip en HER2 gelabeld. (A) Voorbeeldig beeld van een SiN venster gebied met SKBR3 cellen 5 min na het zaaien op de microchip. (B) Dezelfde cellen verspreid op dezelfde SiN venster na 24 uur (C) SKBR3 cellen op een Si microchip 5 min na het zaaien. (D) Dezelfde cellen als in (C) na 24 uur. Cellen niet goed af te vlakken als er te veel cellen op de chips bij het zaaien. (E) Cellen op een microchip 5 min na het zaaien. (F) Slechts weinig cellen waren zichtbaar op het venster omdat er te weinig cellen op de microchip werden gezaaid. (G) DIC-beeld van dezelfde SKBR3-cellen na QD-etikettering van HER2. (H) Overlay afbeelding van DIC en overeenkomstige fluorescentie afbeelding van gelabelde SKBR3 cellen met HER2-QD655 (vals gekleurd in geel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig02.jpg"> Figuur 2: Schoonmaken en overbrengen van grafeen op NaCl-kristallen. (A) PMMA-grafeen-op-polymeer wordt ondergedompeld in zuiver water om PMMA-grafeen vrij te geven. PMMA-grafeen kan worden gevangen met een glazen schuif. (B) Verontreinigingen op basis van koper werden geëtst met behulp van natriumpersulfaatoplossing. Om het grafeen schoon te maken, werd het overgebracht naar een beker met gedeïoniseerd water. Deze stappen werden 3 keer herhaald. Het PMMA-grafeen werd vervolgens overgebracht naar verzadigde oplossing van NaCl in zuiver water. Een NaCl kristal werd gebruikt om het grafeen op te halen uit de zoutoplossing. (C) Het PMMA-grafeen op NaCl kristal werd uitgedroogd gedurende 30 min bij kamertemperatuur. PMMA werd verwijderd door het blok in aceton voor 30 min uit te broeden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2.jpg"> Figuur 3: Grafeencoating van cellen gezaaid op een Si microchip. (A) Procedure van grafeencoating. Grafeen op NaCl kristal wordt vrijgegeven op het wateroppervlak. Het grafeenstuk wordt vervolgens gevangen met een metalen lus en overgebracht naar de Si microchip. (B) Microchip (2,0 x 2,6 mm) met een SiN-venster van afmetingen 400 x 160 μm zonder grafeen. SKBR3-cellen waren zichtbaar als donkere vlekken. (C) Grafeen (rode cirkel) drijvend op het oppervlak van een beker gevuld met water. (D) Grafeen gevangen met een metalen lus. (E) De microchip bevestigd aan de waterdruppel zodat het grafeen was op de top van de SiN venster. (F) Microchip na grafeencoating. Het grafeen was zichtbaar als een paarse glans. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig04v2.jpg"> Figuur 4: STENGEL van gecoat grafeen en niet-gecoate SKBR3-cellen op het SiN-venster. (A) STEM-beeld van een met grafeen bekleed monster dat is verkregen bij een M = 800x. (B) STEM-afbeelding van een niet-gecoate steekproef die is verkregen bij M = 800x. (C) M = 80.000x beeld dat is opgenomen op de positie van de blauwe rechthoek in A. Gele lijnen vertegenwoordigt voorbeeldenafstanden gemeten binnen deeltje. (D) M = 80.000x beeld opgenomen op de positie van de blauwe rechthoek in B. Gele lijn vertegenwoordigt voorbeelden afstanden gemeten in deeltjes. (E) M = 50.000x beeld van hetzelfde gebied als C blootgesteld aan D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2. (F) M = 50.000x beeld van hetzelfde gebied als D en blootgesteld aan D = (7.8±0.4) x 103 e-/Å2. Het blootgestelde gebied was duidelijk te zien. (G) Diffractiepatroon van een met grafeen bekleed monster uit een gebied zonder cellen. De zesvoudige symmetrie van het grafeen is zichtbaar als lichtpuntjes. (H) Diffractiepatroon van een monster zonder grafeen dat geen 6-voudige lichtpuntjes vertoont. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61458/61458fig05.jpg"> Figuur 5: Artefacten die ontstaan op monsters zonder grafeencoating. (A) Eerste afbeeldingen van gebieden op monsters zonder grafeencoating die bij M = 80.000x zijn verworven en zijn blootgesteld aan D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2. (B) Afbeeldingen met de eerste artefacten die zich voordoen bij D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (gele pijlen). C,D) Laatste beeld van de serie verworven met D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. Artefacten waren zichtbaar als lichtpuntjes. (E-G) Grafeen gecoate monsters zonder zich voorwerpelijk artefacten. (E) D = (0,39 ± 0,02) x 102 e-/Å2 (F) D = (1,94 ± 0,1) x 103 e-/Å2 (G) D = (7,8 ± 0,4) x 103 e-/Å2. (H) Relatieve verandering in deeltjesafstanden voor gecoat grafeen en niet-gecoate monsters. Twee van de niet-gecoate monsters met artefacten, waarvan er een getoond in (A-C), en de laatste afbeelding van het tweede monster in D, evenals drie gecoate monsters werden geanalyseerd (een wordt weergegeven in E-G). In totaal werden tien QD-paren per monster onderzocht met afstanden tussen 250 nm en 3 μm. De relatieve verandering weerspiegelt het gemiddelde van alle metingen in één groep. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61458/61458fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullende tabel 1: Recepten voor oplossingen en buffers. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61458/Preparation_of_Solutions.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Hier gepresenteerd is een protocol voor het labelen van membraaneiwitten in zoogdiercellen en het monster bedekt met grafeen voor vloeibare-fase scanning transmission electron microscopie. De stabiliteit van de monsters tegen de schade veroorzaakt door straling kan ook bestudeerd met dit protocol.

Grafeen behuizing van chemisch vaste zoogdiercellen voor vloeibare fase elektronenmicroscopie

A protocol is described for investigating the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) in the intact plasma membrane of breast cancer cells using ...

Deze methode houdt biologische monsters in een inheemse omgeving en vermindert elektronenbundel geïnduceerde artefact. Het belangrijkste voordeel is dat deze techniek van toepassing is op hele cellen. Cellen hoeven dus niet uitgedroogd, gekleurd of gesectied te worden voor elektronenmicroscopie.Het vermogen om receptoren op kankercellen in de context van het hele intacte plasmamembraan te beelden is een belangrijk aspect dat kan leiden tot nieuwe therapiebenaderingen en de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen tegen kanker. Ik zal het werk demonstreren met cellen, grafeencoating en microscopie, en Sercan Keskin zal laten zien hoe het grafeen voor te bereiden. Om te beginnen, voeg 100 microliter van celsuspensie toe aan twee putten van een 96 putplaat die PLL en FLP gecoate microchips met het siliciumnitridemembraan omhoog en 50 microliters van serum-vrij middel bevat.Broed de plaat op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende vijf minuten om cellen te bevestigen aan de microchip. Controleer de dichtheid van de cellen op de microchip met een omgekeerde microscoop en zorg ervoor dat de cellen het venster bedekken met voldoende ruimte om af te vlakken en te hechten. Om HER2 in de cellen te labelen, plaatst u de microchips in de putten van de eerste rij van de etiketteerplaat.Was vervolgens de microchips met PBS BSA. Om niet-specifieke binding van het antilichaam mimetisch te voorkomen, broed je de microchips vijf minuten uit met PBS BSA GS. Dan met 200 nanomolar antilichaam mimetisch gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide.Om het PMMA grafeen uit het polymeer te verwijderen, pipet een paar druppels water op het polymeer rond het PMMA grafeen. Dompel het vervolgens onder in water met een hoek van 30 tot 45 graden om het PMMA-grafeen vrij te geven. Om verontreinigingen op basis van koper te etnen, prepair een 50 milliliter oplossing van 0,42 molaire natriumpersulfaat in water.Gebruik een standaard glazen schuif om PMMA grafeen over te brengen in de natriumpersulfate oplossing met het grafeen kant naar beneden. Het PMMA grafeen zal naar de top van de oplossing zweven. Laat het daar 's nachts.Breng de volgende dag het PMMA-grafeen van de natriumpersulfaatoplossing over in schoon water. Laat het een half uur in het water drijven. Herhaal de was in totaal drie keer om alle natriumpersulfaatresten uit het PMMA-grafeen te verwijderen.Breng vervolgens het PMMA-grafeen over op een natriumchloridekristal. Bereid een verzadigde oplossing van natriumchloride in water in een petrischaal en breng het PMMA-grafeen bovenop de oplossing met de grafeenzijde naar beneden. Houd het natriumchloridekristal met een pincet vast en pak het zwevende PMMA-grafeen.Houd het vervolgens twee minuten verticaal vast om overtollig water eruit te laten stromen. Laat het 30 minuten drogen op kamertemperatuur en bak het 20 minuten in een oven op 100 graden Celsius. Verwijder het water volledig.Verwarm aceton in een glazen petrischaal tot ongeveer 50 graden Celsius op een hete plaat in de rookkap. Let goed op de temperatuur om brand te voorkomen. Dompel het PMMA grafeen onder op zout in de petrischaal gevuld met aceton en laat het 30 minuten lang de PMMA oplossen.Laat het grafeen op zout lucht-droog grondig alvorens het te gebruiken voor monsterbereiding. Was een bereide en gelabelde microchip in zuiver water om eventuele resten zout uit de buffer te verwijderen en plaats het op filterpapier. De cellen moeten zichtbaar zijn als donkere vlekken.Gebruik een scheermesje om het meerlaags grafeen op het natriumchloridekristal in een stuk te snijden dat past bij het siliciumnitridevenster van een microchip. Verwijder het grafeen uit het natriumchloridekristal door het in een bekerglas water te dompelen en het kristal in een hoek van 45 graden te kantelen ten opzichte van het oppervlak. Vang het grafeen met een metalen lus van het oppervlak van het water, raak dan het bovenste oppervlak van de microchip aan met het onderste lusoppervlak, waardoor de microchip aan de metalen lus blijft kleven.Het grafeen is te zien op de top van de microchip. Gebruik onder een stereomicroscoop filterpapier om het resterende water uit de microchip te verwijderen, zodat het grafeen alle cellen op het siliciumnitridevenster bedekt. Plaats de microchip op een filterpapier met een pincet.Het grafeen is zichtbaar als een paarse glans op de microchip. Breng de microchip van het papier naar een compartiment Petri schotel. Pipette een druppel water in een van de vrije compartimenten en sluit het deksel om een waterverzadigde atmosfeer te bieden.Sluit vervolgens de schotelschotel af met paraffinefolie en bewaar deze in de koelkast op vier graden Celsius. Stel de STEM in op 200 kilovoltstraalenergie met behulp van een uitlijnmonster voor een sondegrootte van ten minste 0,2 nanometer door de condensorlenzen aan te passen. Stel een sonde stroom van 180 Picoampere en een bundel convergentie semi-hoek van 13,2 milliradians door het invoegen van een diafragma.Stel de ADF STEM detector opening semi-hoek bereik in op 68 tot 280 milliradians door de projector lens instellingen aan te passen. Stel vervolgens de STEM-afbeeldingsgrootte in op 2048 bij 2048 pixels en de pixeltijd op zes microseconden. Laad de microchip met met grafeen gecoate cellen in een standaard monsterhouder voor tem zodanig dat de cellen naar boven gericht zijn en de houder in de elektronenmicroscoop laden.Verkrijg een overzichtsfoto bij vergroting van 800 X. Identificeer vervolgens een gebied van belang en beeld van de quantum dot nanodeeltjes op 80,000 X met een pixelgrootte van 1,3 nanometer. Optimaal gezaaide cellen worden hier weergegeven.Het venster is bedekt, maar er is voldoende ruimte om ze af te vlakken en te hechten. Wanneer er te veel cellen op een microchip werden gezaaid, was er onvoldoende ruimte voor alle cellen om zich aan te hechten. Na 24 uur, meer dan de helft van de cellen niet plat.Als er te weinig cellen worden gezaaid, zal het siliciumnitridevenster na 24 uur eindigen met een grote lege ruimte. DIC en fluorescentie beelden van optimaal gezaaide cellen worden hier getoond, waaruit blijkt succesvolle etikettering van HER2. STEM werd uitgevoerd op grafeengecoate en niet-gecoate SKBR3 cellen.De insets in de 800 X vergroting beelden werden afgebeeld op 80, 000 X.The quantum dot nanodeeltjes zijn zichtbaar als lichtpuntjes op 50,000 X vergroting. Om het effect van elektronenbundelverlichting op het monster te onderzoeken, werden STEM-beelden verkregen in een beeldreeks met een accumulerende elektronendosis. Representatieve resultaten voor niet-gecoate en grafeen gecoate monsters worden hier weergegeven.De blootstelling van niet-gecoate monsters leidde tot heldere structuren verschijnen op de celoppervlakken, die niet voorkomen met een van de grafeen gecoate monsters. De gemiddelde relatieve afstandsverandering van deeltjesparen bleef onder 1,3% voor niet-gecoate monsters en minder dan 0,8% voor de gecoate monsters. Na deze procedure kunnen verschillende soorten membraaneiwitten op hele cellen worden afgebeeld met behulp van andere microscopiemethoden.Deze techniek maakt het mogelijk om eiwitten in het intacte plasmamembraan in beeld te brengen om meer informatie te krijgen over de organisatie van het plasmamembraan en de interactie tussen eiwitten.

graphene-enclosure-chemically-fixed-mammalian-cells-for-liquid-phase

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Grafeen vloeibare cel elektronenmicroscopie kan worden gebruikt om te observeren dynamiek van de nanocrystal in een vloeibare omgeving met meer ruimtelijke resolutie dan andere vloeibare cel elektronenmicroscopie technieken. Etsen premade nanokristallen en na hun vorm met behulp van grafeen vloeibare cel transmissie-elektronenmicroscopie kan opleveren belangrijke mechanistische informatie over transformaties van de nanoparticle.

Met behulp van grafeen vloeistof cel transmissie-elektronenmicroscopie om te studeren in Situ Nanocrystal etsen

Een protocol voor de bereiding van met grafeen ondersteunde titer vloeistof cellen voor in-situ elektronenmicroscopie van goud nano van de haucl4 precursor oplossing wordt gepresenteerd. Bovendien wordt een analyse routine gepresenteerd om waargenomen etsen en groeidynamiek te kwantificeren.

Bereiding van met grafeen ondersteunde Microwell vloeistof cellen voor in-situ transmissie elektronenmicroscopie

Hier beschrijven we een protocol voor het aanbrengen van een enkele monolaag grafeen op elektronenmicroscopieroosters en hoe deze voor te bereiden op gebruik bij cryoEM-structuurbepaling.

Fabricage van monolayer grafeen-gecoate roosters voor cryo-elektronenmicroscopie

De toepassing van steunlagen op cryogene elektronenmicroscopie (cryoEM)-roosters kan de deeltjesdichtheid verhogen, interacties met de lucht-waterinterface beperken, door bundels geïnduceerde beweging verminderen en de verdeling van deeltjesoriëntaties verbeteren. Dit artikel beschrijft een robuust protocol voor het coaten van cryoEM-roosters met een monolaag grafeen voor een betere voorbereiding van cryomonsters.

Toepassing van monolaag grafeen op cryo-elektronenmicroscopieroosters voor structuurbepaling met hoge resolutie

Op lange termijn Imaging zoogdiercellen met behulp van Wide-Field Microscopie

Werkwijze voor het observeren individuele DNA-moleculen in levende cellen beschreven. De techniek is gebaseerd op de binding van een fluorescent gelabeld lac repressor eiwit bindingsplaatsen ontworpen in het DNA van belang. Deze methode kan worden aangepast aan vele recombinant DNA volgen in levende cellen in de tijd.

Monitoring Plasmide Replicatie in Live zoogdiercellen over meerdere generaties door fluorescentie microscopie

Veranderde niveaus van intracellulair heem worden geassocieerd met veelvoorkomende ziekten zoals kanker. Daarom is er behoefte aan het meten van de niveaus van heembiosynthese in verschillende cellen. Het doel van dit protocol is om een snelle en gevoelige methode te bieden om de niveaus van heemsynthese in verschillende cellen te meten en te vergelijken.

Meting van Heme Synthesis Levels in zoogdiercellen

Het verkrijgen van hoogwaardige transmissie-elektronenmicroscoopbeelden is een uitdaging, vooral in het geval van plantencellen, die overvloedige grote watergevulde vacuolen en beluchte ruimtes hebben. Tandem hogedrukvriestechniek en snelle vriessubstitutie verminderen de bereidingstijd van plantenmonsters voor TEM aanzienlijk, terwijl ze monsters produceren met uitstekende ultrastructurele behoud.

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Dit protocol beschrijft de verschillende technieken die nodig zijn voor de transmissie-elektronenmicroscopie, met inbegrip van negatieve kleuring, uiterst dunne segmenteren voor gedetailleerde structuur en immuno-goud etikettering om te bepalen van de standpunten van bepaalde eiwitten in exosomes.

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Leer hoe je membraanproteïnen in intacte zoogdiercellen labelt met HER2-markering en grafeen gebruikt voor vloeibare-fase elektronenmicroscopie. Deze methode behoudt de native omgeving en minimaliseert elektronenbundelartefacten.

Grafeen behuizing van chemisch vaste zoogdiercellen voor vloeibare fase elektronenmicroscopie

Meer video's verkennen