Name: Analyse van human natural killer cell metabolisme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer hoe u het metabolisme van humane Natural Killer-cellen analyseert met een extracellular flux analyzer. Deze methode meet glycolyse en mitochondriale ademhaling in real-time voor immunologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) voor steun en discussie. Deze studie werd ondersteund door de intramurale onderzoeksprogramma's van de National Institutes of Health, National Cancer Institute en National Heart, Lung, and Blood Institute. JT wordt ondersteund door het Ramon y Cajal programma (grant RYC2018-026050-I) van MICINN (Spanje).

<ol><li>Long, E. O., Kim, H. S., Liu, D., Peterson, M. E., Rajagopalan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+natural+killer+cell+responses%3A+integration+of+signals+for+activation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Controlling natural killer cell responses: integration of signals for activation and inhibition.</a> Annual Review of Immunology. 31, 227-258 (2013).</li>
<li>Caligiuri, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human natural killer cells.</a> Blood. 112 (3), 461-469 (2008).</li>
<li>Anton, O. M., Vielkind, S., Peterson, M. E., Tagaya, Y., Long, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+Cell+Proliferation+Induced+by+IL-15+Transpresentation+Is+Negatively+Regulated+by+Inhibitory+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK Cell Proliferation Induced by IL-15 Transpresentation Is Negatively Regulated by Inhibitory Receptors.</a> Journal of Immunology. 195 (10), 4810-4821 (2015).</li>
<li>Henney, C. S., Kuribayashi, K., Kern, D. E., Gillis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-2+augments+natural+killer+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-2 augments natural killer cell activity.</a> Nature. 291 (5813), 335-338 (1981).</li>
<li>Anton, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-endocytosis+of+intact+IL-15Ralpha-IL-15+complex+from+presenting+cells+into+NK+cells+favors+signaling+for+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Trans-endocytosis of intact IL-15Ralpha-IL-15 complex from presenting cells into NK cells favors signaling for proliferation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 522-531 (2020).</li>
<li>Marcais, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+checkpoint+kinase+mTOR+is+essential+for+IL-15+signaling+during+the+development+and+activation+of+NK+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The metabolic checkpoint kinase mTOR is essential for IL-15 signaling during the development and activation of NK cells.</a> Nature Immunology. 15 (8), 749-757 (2014).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+Maximum+Glycolytic+Capacity+Using+Extracellular+Flux+Measurements%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Determining Maximum Glycolytic Capacity Using Extracellular Flux Measurements.</a> PloS One. 11 (3), 0152016(2016).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Proton+Leak+Plays+a+Critical+Role+in+Pathogenesis+of+Cardiovascular+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 982, 359-370 (2017).</li>
<li>Terren, I., Orrantia, A., Vitalle, J., Zenarruzabeitia, O., Borrego, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+Cell+Metabolism+and+Tumor+Microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">NK Cell Metabolism and Tumor Microenvironment.</a> Frontiers in Immunology. 10, 2278(2019).</li>
<li>Felices, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+treatment+with+IL-15+exhausts+human+NK+cells+via+a+metabolic+defect%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Continuous treatment with IL-15 exhausts human NK cells via a metabolic defect.</a> Journal of Clinical Investigation Insight. 3 (3), 96219(2018).</li>
<li>Miller, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+First-in-Human+Phase+I+Study+of+Subcutaneous+Outpatient+Recombinant+Human+IL15+%28rhIL15%29+in+Adults+with+Advanced+Solid+Tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A First-in-Human Phase I Study of Subcutaneous Outpatient Recombinant Human IL15 (rhIL15) in Adults with Advanced Solid Tumors.</a> Clinical Cancer Research. 24 (7), 1525-1535 (2018).</li>
<li>Conlon, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL15+by+Continuous+Intravenous+Infusion+to+Adult+Patients+with+Solid+Tumors+in+a+Phase+I+Trial+Induced+Dramatic+NK-Cell+Subset+Expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">IL15 by Continuous Intravenous Infusion to Adult Patients with Solid Tumors in a Phase I Trial Induced Dramatic NK-Cell Subset Expansion.</a> Clinical Cancer Research. 25 (16), 4945-4954 (2019).</li>
<li>Dubois, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL15+Infusion+of+Cancer+Patients+Expands+the+Subpopulation+of+Cytotoxic+CD56%28bright%29+NK+Cells+and+Increases+NK-Cell+Cytokine+Release+Capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">IL15 Infusion of Cancer Patients Expands the Subpopulation of Cytotoxic CD56(bright) NK Cells and Increases NK-Cell Cytokine Release Capabilities.</a> Cancer Immunology Research. 5 (10), 929-938 (2017).</li>
<li>Traba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fasting+and+refeeding+differentially+regulate+NLRP3+inflammasome+activation+in+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fasting and refeeding differentially regulate NLRP3 inflammasome activation in human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4592-4600 (2015).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+Protocol+to+Analyze+Glycolysis+and+Mitochondrial+Respiration+in+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918(2016).</li>
<li>Horan, M. P., Pichaud, N., Ballard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+quantifying+mitochondrial+dysfunction+in+complex+diseases+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review: quantifying mitochondrial dysfunction in complex diseases of aging.</a> Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 67 (10), 1022-1035 (2012).</li>
<li>Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometry-based+Assay+for+the+Monitoring+of+NK+Cell+Functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), e54615(2016).</li>
<li>Theorell, J., Bryceson, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Intracellular+Ca%282%2B%29+Mobilization+in+Human+NK+Cell+Subsets+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Intracellular Ca(2+) Mobilization in Human NK Cell Subsets by Flow Cytometry.</a> Methods in Molecular Biology. 1441, 117-130 (2016).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+rates+of+glycolytic+and+oxidative+ATP+production+and+consumption+using+extracellular+flux+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular rates of glycolytic and oxidative ATP production and consumption using extracellular flux measurements.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (17), 7189-7207 (2017).</li>
<li>O'Brien, K. L., Finlay, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism+and+natural+killer+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism and natural killer cell responses.</a> Nature Reviews: Immunology. 19 (5), 282-290 (2019).</li>
<li>Ahn, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+mitochondrial+deacetylase+Sirt3+in+regulating+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A role for the mitochondrial deacetylase Sirt3 in regulating energy homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (38), 14447-14452 (2008).</li>
<li>Stram, A. R., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+in+mitochondria%3A+protein+signaling+in+the+powerhouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications in mitochondria: protein signaling in the powerhouse.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (21), 4063-4073 (2016).</li>
<li>Armstrong, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+alters+mitochondrial+bioenergetics+and+modifies+pancreatic+cell+death+independently+of+cyclophilin+D%2C+resulting+in+an+apoptosis-to-necrosis+shift%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress alters mitochondrial bioenergetics and modifies pancreatic cell death independently of cyclophilin D, resulting in an apoptosis-to-necrosis shift.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (21), 8032-8047 (2018).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+respiration+and+glycolysis+to+extracellular+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).</li>
<li>Mookerjee, S. A., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+and+Analysis+of+Extracellular+Acid+Production+to+Determine+Glycolytic+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measurement and Analysis of Extracellular Acid Production to Determine Glycolytic Rate.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53464(2015).</li>
<li>Lichtshtein, D., Kaback, H. R., Blume, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+lipophilic+cation+for+determination+of+membrane+potential+in+neuroblastoma-glioma+hybrid+cell+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of a lipophilic cation for determination of membrane potential in neuroblastoma-glioma hybrid cell suspensions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 650-654 (1979).</li>
<li>Michelet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+of+natural+killer+cells+in+obesity+limits+antitumor+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming of natural killer cells in obesity limits antitumor responses.</a> Nature Immunology. 19 (12), 1330-1340 (2018).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

In dit document hebben we een protocol opgesteld voor het efficiënt isoleren en kweken van zuivere en levensvatbare primaire menselijke NK-cellen uit perifeer bloed. We hebben ook de voorwaarden geoptimaliseerd voor de meting van de metabolische activiteit van deze NK cellen beoordeeld door zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring met behulp van een extracellulaire flux analyzer. In vergelijking met andere respirometrische methoden, de extracellulaire flux analyzer is snel, vereist kleine aantallen cellen, en maakt ...

Natural Killer (NK) cellen zijn aangeboren lymfocyten die anti-tumor en anti-virale reacties bemiddelen. NK-cellen bestaan uit 5-15% van alle lymfocyten in menselijk perifeer bloed, en kunnen ook worden gevonden in milt, lever, beenmerg en lymfeklieren. NK-cellen drukken geen polymorfe clonotyp receptoren uit, zoals T-celreceptoren (TCR) of B-celreceptoren (BCR). De activering van hun cytolytische functies daarentegen wordt ingegeven door de betrokkenheid van receptoren die onveranderlijke liganden herkennen op het oppervlak van een doelcel1,2.
Rustende menselijke NK cellen geïsoleerd uit perifeer bloed kan overleven voor meerdere dagen in cultuur medium aangevuld met menselijk serum. Activering van NK-cellen door cytokinen zoals IL-15 of IL-2 drijft de cellen tot proliferatie en tot een toename van hun moordvermogen, onder andere effecten3,4,5. Verschillende studies hebben een directe correlatie aangetoond tussen NK-celactivering en veranderingen in hun metabolische activiteit6. Deze metabolische veranderingen zijn bestemd om te voldoen aan de specifieke eisen van de cellen in termen van energie en biosynthese.
Aërobe cellen en organismen verkrijgen energie door middel van een reeks chemische reacties die de katabolisme en oxidatie van koolhydraten, vet en eiwitten te betrekken. Door een combinatie van glycolyse, de tricarboxylzuurcyclus (TCA) en oxidatieve fosforylatie voldoen eukaryotische cellen aan de meerderheid van hun ATP-vraag en verkrijgen ze tussenproducten die nodig zijn als bouwstenen voor macromolecules die essentieel zijn voor celgroei en proliferatie. Het proces van glycolyse (figuur 1A) begint met de invoer van glucose in de cel. In de cytosol wordt glucose gefossyleerd en omgezet in pyruvaat (met een nettoproductie van 2 moleculen ATP per glucosemolecuul), die kunnen worden gereduceerd tot lactaat of getransporteerd naar de mitochondriën om te worden omgezet in Acetyl-CoA en de TCA-cyclus binnen te gaan. De TCA-cyclus blijft fietsen gevoed met meer moleculen van Acetyl-CoA en produceert CO2 (die uiteindelijk buiten de cel zal verspreiden en, door te reageren met H2O in het medium, zal genereren koolzuur dat zal leiden tot de verzuring van het medium) en NADH, het molecuul belast met het doneren van elektronen aan de elektronentransportketen (ETC). De elektronen reizen door verschillende eiwitcomplexen en worden uiteindelijk geaccepteerd door zuurstof. Deze complexen (I, III en IV) pompen ook H+ van de mitochondriale matrix in de intermembrane ruimte. Als gevolg van de elektrochemische gradiënt gegenereerd, zal de H+ opnieuw in de matrix via de complexe V (ATP-synthase), het investeren van de potentiële energie verzameld in de generatie van ATP.
Zowel glycolyse als mitochondriale ademhaling kunnen op verschillende punten worden geblokkeerd met behulp van remmers. De kennis en het gebruik van deze remmers was de basis voor de ontwikkeling van de extracellulaire fluxtest. Door twee eenvoudige parameters in real time te meten, zoals pH en zuurstof, leidt de extracellulaire flux analyzer de snelheid van glycolyse en mitochondriale ademhaling af in een 96-put plaat. De glycolysestresstest wordt uitgevoerd in een basaal medium zonder glucose (figuur 1B)7. De eerste metingen van de extracellulaire verzuring (ECAR) zijn indicatief voor glycolyse-onafhankelijke verzuring. Het wordt aangeduid als niet-glycolytische verzuring en correleert met CO2 geproduceerd door de TCA die, zoals eerder uitgelegd, combineert met H2O in het medium om H+ (TCA-gekoppelde ECAR) te genereren. De eerste injectie is glucose om glucosegebruik te induceren en glycolyse te stimuleren. De tweede injectie combineert zowel rotenone, een Complexe I-remmer, en antimycine A, een Complexe III-remmer samen, om de ETC. Cellen te blokkeren reageren op deze dramatische afname van mitochondriale ATP-productie door het activeren van glycolyse om cellulaire ATP-niveaus te handhaven, en dit vertegenwoordigt de hoeveelheid glycolyse die niet wordt gebruikt door de cel in de basale toestand, maar mogelijk kan worden aangeworven als reactie op de toename van de ATP-vraag (compenserende glycolyse). De derde injectie is de glucose analoge 2-Deoxyglucose (DG), die concurreert met glucose als substraat voor het enzym hexokinase. Het product van deze fosforylatie, 2-deoxyglucose-6-fosfaat kan niet worden omgezet in pyruvaat, en daarom glycolyse wordt geblokkeerd, waardoor de ECAR tot zijn minimum wordt beperkt. De op dit punt gemeten ECAR omvat andere bronnen van extracellulaire verzuring die niet worden toegeschreven aan glycolyse of ademhalingsactiviteit, evenals eventuele resterende glycolyse die niet volledig door 2-DG (post 2-DG-verzuring) wordt geremd.
De mitochondriale stresstest wordt uitgevoerd in een medium met glucose (figuur 1C)8. De eerste metingen van het zuurstofverbruik (OCR) komen overeen met de basislijn van mitochondriale ademhaling (basale ademhaling). De eerste injectie is oligomycine, die de terugkeer van protonen via de ATP-synthase (complex V) remt, de ATP-synthese blokkeert en zo snel het mitochondriale membraan hyperpolariseert, wat verdere protonpompen door ademhalingscomplexen voorkomt en leidt tot een afname van OCR. De vergelijking tussen de basisinademing en de waarde die wordt gegeven door toevoeging van oligomycine vertegenwoordigt de atp-gekoppelde ademhaling. De resterende oligomycine-ongevoeligheidsgraad van zuurstofverbruik wordt protonlek genoemd, dat de stroom van protonen door de lipidebilayer of eiwitten in het binnenste mitochondriale membraan vertegenwoordigt, zoals de adenine nucleotide translocase9. De tweede injectie is de ontkoppelaar 2,4-dinitrophenol (DNP), een ionofoër die een massale binnenkomst van H+ in de mitochondriale matrix induceert, wat leidt tot depolarisatie van het mitochondriale membraan en verstoring van mitochondriale ATP-synthese. Cellen reageren op de dissipatie van de proton-bewegingskracht door het verhogen van de snelheid van elektronentransport en zuurstofverbruik tot maximale niveaus in een vergeefse poging om membraan potentieel (maximale ademhalingscapaciteit) te herstellen. Het verschil tussen de maximale ademhalingscapaciteit en de basale ademhaling is de reserveademhalingscapaciteit van de cel, die de hoeveelheid ademhaling vertegenwoordigt die niet door de cel wordt gebruikt om ATP in de basale toestand te genereren, maar mogelijk kan worden aangeworven als reactie op een toename van de ATP-vraag of onder stressomstandigheden8. De derde injectie is een combinatie van rotenone en antimycine A. Deze injectie stopt volledig de ETC en OCR daalt tot het laagste niveau, met de resterende zuurstofverbruik wordt niet-mitochondriaal (veroorzaakt door NADPH-oxidases, enz.).
Veranderingen in metabole trajecten kunnen op de een of andere manier de werking van NK-cellen voorspellen, omdat is gesuggereerd dat continue activering van NK-cellen met cytokines in vitro kan leiden tot NK-celuitputting door de studie van verschillende metabole trajecten10,11. De correlatie tussen NK cel metabolische status en functie is zeer belangrijk vanuit het oogpunt van kanker immunotherapie. Op dit gebied is de activering van NK-cellen met infusie van IL-15, alleen of in combinatie met monoklonale therapeutische antilichamen getest om het doden van tumorcellen12,13,14te verbeteren . De kennis van de metabolische status van de NK-cellen in reactie op deze behandelingsstrategieën zou een waardevolle voorspeller zijn van de NK-celactiveringsstatus en de moordfunctie.
De studie van metabole trajecten in andere myeloïde en lymfoïde cellen zoals monocyten, T- en B-cellen is beschreven15 en geoptimaliseerde methoden zijn gepubliceerd16. In dit protocol bieden we een methode die zowel een NK isolatieprotocol combineert dat hoge aantallen zuivere en levensvatbare NK-cellen oplevert als een geoptimaliseerd protocol om metabole activiteit te meten met behulp van een extracellulaire flux analyzer. Hier tonen we aan dat dit een geldige methode is voor de studie van metabole veranderingen in rust en IL-15 geactiveerde menselijke NK cellen. Voor de extracellulaire fluxtest zijn parameters zoals celnummer en medicijnconcentraties getest en geoptimaliseerd. Vergeleken met andere respirometrische methoden, de extracellulaire flux analyzer is volledig geautomatiseerd en in staat om te testen in real time, met zeer lage hoeveelheden cellen, tot 92 monsters tegelijk, en dus maakt hoge doorvoer screenings (met meerdere monsters en repliceert) in een relatief snelle manier17.
Deze methode kan worden gebruikt door onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het beoordelen van NK celfunctie door het bestuderen van NK celmetabolisme. Het kan ook worden toegepast op cellen geactiveerd door andere cytokinen, antilichamen of oplosbare stimuli.

<table><tbody><tr><td>2-Deoxy-D-glucose (2-DG)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D8375-5G</td><td>Glycolyisis stress test injector compound</td></tr><tr><td>2,4-Dinotrophenol (2,4-DNP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D198501</td><td>ETC uncoupler / mitochondrial stress test injector compound</td></tr><tr><td>96 Well Cell Culture Plate/ Round bottom with Lid</td><td>Costar</td><td>3799</td><td>NK cell culture</td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>MilliporeSigma</td><td>A8674</td><td>Complex III inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td></tr><tr><td>BD FACSDIVA Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow data acquisition</td></tr><tr><td>BD LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow data acquisition</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cell adhesive</td></tr><tr><td>CyQUANT cell proliferation assay</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C7026</td><td>Cell proliferation Assay voor DNA kwantificering. Bevat cell-lysis buffer en CyQUANT GR kleurstof</td></tr><tr><td>EasySep Human CD3 Positive Selection Kit II</td><td>Stemcell technologies</td><td>17851</td><td>NK cell isolatie uit PBMC's</td></tr><tr><td>EasySep Human NK cell Enrichment Kit</td><td>Stemcell technologies</td><td>19055</td><td>NK cell isolatie uit PBMC's</td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stemcell technologies</td><td>18001</td><td>NK cell isolatie uit PBMC's</td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8</td><td>Quality Biological</td><td>10128-446</td><td>NK cell scheidingsbuffer</td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>352235</td><td>Flow cytometry experiment</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Conical tubes</td><td>Falcon-Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>NK cell scheiding</td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td>NK cell scheidingsbuffer</td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow data analyse</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8270</td><td>Component van mitochondrial stress test medium. Glycolysis stress test injector compound</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Protease inhibitor 100X. Gebruik in RIPA lysis buffer</td></tr><tr><td>Human IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-50ug</td><td>NK cell stimulatie</td></tr><tr><td>Human serum (HS)</td><td>Valley Biomedical</td><td>9C0539</td><td>NK cell cultuurmedium supplement</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td>NK cell cultuurmedium</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25030-081</td><td>Component van stress test media</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34965</td><td>Viabiliteitskleurstof voor flow cytometry staining</td></tr><tr><td>LSM</td><td>mpbio</td><td>50494X</td><td>PBMC's scheiding uit menselijk bloed</td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD3 BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563725</td><td>T cell flow cytometry staining</td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD56 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>555516</td><td>NK flow cytometry staining</td></tr><tr><td>Mouse anti-human NKp46 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>557991</td><td>NK flow cytometry staining</td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>MilliporeSigma</td><td>75351</td><td>Complex V inhibitor / mitochondrial stress test injector compound</td></tr><tr><td>PBS pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td>NK cell scheidingsbuffer</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td>Voor bepaling van eiwitconcentratie</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td>Cel lysis</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>MilliporeSigma</td><td>R8875</td><td>Complex II inhibitor / glycolysis and mitochondrial stress test injector compound</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Controller Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Controller voor de Seahorse XFe96 Analyzer</td></tr><tr><td>Seahorse Wave Desktop Software</td><td>Agilent</td><td></td><td>Voor data analyse</td></tr><tr><td>Seahorse XF Base Medium</td><td>Agilent</td><td>102353-100</td><td>Extracellular Flux assay basismedium</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td>Extracellular Flux Analyzer</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>Bevat 20 XF96 celcultuurplaten, 18 XFe96 sensor cartridges, belastingsgidsen voor het overbrengen van verbindingen naar de testcartridge en 1 fles calibratieoplossing (500 ml).</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>MilliporeSigma</td><td>S5761</td><td>Voor de bereiding van de Cell-Tak oplossing</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate (100 mM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11360-070</td><td>Component van mitochondrial stress test medium</td></tr></tbody></table>

analyse van human natural killer cell metabolisme

Analysis of Human Natural Killer Cell Metabolism

Natural Killer (NK) cellen bemiddelen voornamelijk aangeboren anti-tumor en anti-virale immuunreacties en reageren op een verscheidenheid van cytokinen en andere stimuli ter bevordering van overleving, cellulaire proliferatie, productie van cytokinen zoals interferon gamma (IFNγ) en / of cytotoxiciteit programma's. NK celactivering door cytokine stimulatie vereist een aanzienlijke remodellering van metabole trajecten ter ondersteuning van hun bio-en bio-synthetische eisen. Er is een grote hoeveelheid bewijs dat suggereert dat verminderde NK celmetabolisme wordt geassocieerd met een aantal chronische ziekten, waaronder obesitas en kanker, die het klinische belang van de beschikbaarheid van een methode om NK celmetabolisme te bepalen benadrukt. Hier beschrijven we het gebruik van een extracellulaire flux analyzer, een platform dat real-time metingen van glycolyse en mitochondriaal zuurstofverbruik mogelijk maakt, als een hulpmiddel om veranderingen in het energiemetabolisme van menselijke NK-cellen te monitoren. De hier beschreven methode maakt het ook mogelijk om metabole veranderingen te monitoren na stimulatie van NK-cellen met cytokines zoals IL-15, een systeem dat momenteel wordt onderzocht in een breed scala aan klinische studies.

Isolatie van NK-cellen uit perifeer bloed zorgt voor een zuivere en levensvatbare populatie
De extracellulaire fluxtest is gebaseerd op de meting van de H+ en O2-concentratie in de put en zal geen onderscheid maken tussen verschillende populaties cellen of hun levensvatbaarheid. Om deze reden was het verkrijgen van een zeer zuivere en levensvatbare populatie van de cel van belang de belangrijkste stap om te slagen in deze experimenten.
<p class="jove_...

In dit artikel beschrijven we een methode om glycolyse en mitochondriale ademhaling te meten in primaire menselijke Natural Killer (NK) cellen geïsoleerd van perifeer bloed, in rust of na IL15-geïnduceerde activering. Het beschreven protocol kan gemakkelijk worden uitgebreid tot primaire menselijke NK-cellen die worden geactiveerd door andere cytokines of oplosbare stimuli.

Analyse van human natural killer cell metabolisme

Natural Killer (NK) cells mediate mainly innate anti-tumor and anti-viral immune responses and respond to a variety of cytokines and other stimuli to ...

Deze methode zorgt voor de bepaling van natuurlijke killer cel metabolisme. Een belangrijke parameter in de activering door het meten van zuurstofverbruik en pH-veranderingen in het extracellulaire medium. Het voordeel van de extracellulaire flux analyzer is dat het volledig geautomatiseerd is en in staat is om tot 92 monsters in real time te testen met lage hoeveelheden cellen.Dus waardoor hoge doorvoerschermen. Een geldige methode om glycolyse en ademhaling in inktcellen te bepalen is erg belangrijk in de kliniek. Aangezien er veel ziekten, waaronder obesitas en kanker waar inktcellen metabolisme is aangetast.Begin met het pipetten van 20 milliliter lymfocyten scheiding medium in een 50 milliliter conische buis. Terwijl het houden van de buis op 30 graden hoek, voorzichtig pipette 20 milliliter bloed over het medium. Het creëren van een zichtbare en goed gedefinieerde interface tussen de twee vloeistoffen.Centrifugeren de buizen gedurende 25 minuten op 1000 keer G.Dan zorgvuldig neem de buizen uit de centrifuge en leg ze in een rek. Controleer op de aanwezigheid van een opvallende laag cellen op de interface tussen LSM en plasma. Voorzichtig aspirate de mononucleaire cellaag met een 10 milliliter plastic pipet en plaats het in een nieuwe 50 milliliter conische buis.Was de mononucleaire cellen twee maal met 45 milliliter PBS. En centrifugeren ze op 800 keer G gedurende vijf minuten. Om de natuurlijke killer cellen of engaves te isoleren, tel de PVM zeeën en resuspend ze in NK scheiding buffer op een keer 10 tot de achtste cellen per milliliter.Breng vervolgens 10 milliliter van de celsuspensie over in een nieuwe buis van 50 milliliter. Voeg 500 microliters van NK celisolatie antilichaam mix. En 10 microliters van anti-cd drie positieve isolatie antilichaam mix aan de PBMCs.En broed ze 10 minuten op kamertemperatuur. Vortex magnetische kralen en voeg een milliliter aan de PBMCs en antilichamen. Vervolgens de MIGS 10 minuten bij kamertemperatuur incubeermen.Voeg 35 milliliter NK isolatiebuffer toe en plaats de buis 15 minuten op de magneet. Verzamel de supernatant voorzichtig met een 50 milliliter plastic pipet zonder de zijkanten of de onderkant van de buis aan te raken. Tel de cellen en centrifugeren ze op 800 keer G gedurende vijf minuten.Om de NK-cellen te stimuleren met oplosbaar gangpad 15, worden 750.000 cellen in 100 microliter van IMDM met 10%HS in een put van een 96 putplaat opnieuw opgetrokken. Verdun het menselijk gangpad 15 tot 1 microgram per milliliter in de IMDM en 10%HS. En voeg 100 microliter van het verdunde menselijke gangpad 15 toe aan de cellen.Herstel een controlemonster met niet-geprisuleerde cellen en plaats beide monsters in de couveuse op 37 graden Celsius. Stimuleer de cellen gedurende 48 uur en voer vervolgens de extracellulaire fluxtest uit. Daag de dag voor het experiment de analyzer in en laat hem opwarmen tot 37 graden Celsius.Open het censuurcartridgepakket en scheid de cartridge van de hulpplaat. Voeg vervolgens 200 microliter van de kalibrantoplossing toe aan elke put van de nutsplaat. En zet de centrale cartridge terug om ervoor te zorgen dat de sensoren volledig onder water staan.Voor optimale resultaten incubeer de cartridge 's nachts bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide vrije couveuse. Die goed bevochtigd. Om een met lijm bekleed mes te bereiden, pipette 25 microliter van de celkleefoplossing op elke put van de plaat.En geïncubeerd bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Verwijder vervolgens de oplossing en was de plaat twee keer met 200 microliter steriel water per put. Houd de plaat 15 minuten open in de celkweekkap om de putten te laten drogen.Centrifuge de eerder geïsoleerde NK cellen toe te voegen 200 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder vervolgens supernatants en was de cellen in opgewarmde mitochondriale stresstest medium of glycolyse stress test medium. Pellet de cellen opnieuw en resuspend ze naar de gewenste celconcentratie in hetzelfde medium.Leg 180 microliter celsuspensie per put in de testplaat. Gebruik putten A een, A 12 H een en H 12 als controle putten voor achtergrondcorrectie. Het toevoegen van 180 microliters van het testmedium aan deze Putten Incubbate de plaat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een koolstofdioxide vrije incubator.Centrifuge de plaat op 200 keer G gedurende vijf minuten. Observeer vervolgens de cellen onder de microscoop om te controleren of ze een manolaag vormen aan de onderkant van de put. Incubeer de cellen nog 25 minuten.Warm werkende oplossingen tot 37 graden Celsius. En hun pH aanpassen naar 7,4 indien nodig. Laad de eerder bereide verbindingen voor een mitochondriale stresstest of voor een glycolyse stresstest in de planken A, B en C van de gehydrateerde censuurcartridge Zet de geladen censuurcartridge terug in de couveuse tijdens het opzetten van het programma.Als u het extracellulaire fluxtestprotocol wilt instellen, opent u de software en gebruikt u groepsdefinities om de voorwaarden voor behandeling te definiëren. Gebruik het tabblad Plaatkaart om de groepen putten aan te geven die vergelijkbare voorwaarden hebben, geef ook de achtergrondcorrectie en lege putten aan. Stel vervolgens het programma in op het tabblad Protocollen.Start het programma en plaats de sensorcartridge en hulpplaat op de lade. Vervang na de kalibratiestap de rembrantplaat voor de testplaat door de bijgevoegde cellen. Zodra de run is voltooid, haalt u de gegevens op en analyseert u deze.Om de zuiverheid en levensvatbaarheid van de NK-cellen te beoordelen. Kleine Alec Watts van PVM zeeën en de geïsoleerde NK cel populatie werden gekleurd en geanalyseerd door stroom cytometrie. De zuiverheid van de NK cel populatie werd vastgesteld door dubbele verblijf tegen CD drie en CD 56 of NKP 46.Veel mitochondriaal zuurstofverbruik voor de menselijke NK cellen worden hier getoond. Zoals verwacht ik celnummers weergegeven hogere OCR waarden. Celnummers correleerden ook lineair met de hoeveelheid DNA of eiwit in de put.Enerzijds waren de hogere celaantallen niet optimaal. Omdat op aanvulling van DNP, de zuurstofconcentratie in de put was volledig uitgeput in elke cyclus. Die de nauwkeurige berekening van OCR verhinderde.In menselijke NK-cellen bleek 100 micromolar DNP de optimale dosis te zijn. Hier wordt een typisch mitochondriaal stresstestexperiment met 750.000 NK-cellen per put getoond. In deze test oligomycine leidt tot een dramatische daling van het zuurstofverbruik.En een toename van ECAR. Dat is een overstap naar glycolyse en een poging om cellulaire ATP-niveaus te behouden. Activering van de NK-cellen via gangpad 15 veroorzaakte een toename van zowel het mitochondriale zuurstofverbruik als de extracellulaire verzuring.Basale Maximal en ATP gekoppelde ademhaling verhoogd, maar niet proton lek of niet mitochondriale ademhaling. Bovendien daalde het OCR/ECA-tarief wat duidt op een verschuiving naar een glycolytisch metabolisme na IL 15 stimulatie. Bij het uitvoeren van dit protocol is het erg belangrijk om een zuivere en gezonde celpopulatie te verkrijgen om het optimale celaantal te bepalen en de concentratie van uncablers te titreren.

analysis-of-human-natural-killer-cell-metabolism

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the method to analyze energy metabolism in activated human NK cells using an extracellular flux analyzer. Different inhibitors of the electron transport chain complexes impact ATP synthesis, which is measured through the oxygen consumption rate or OCR, providing insights into cellular metabolism and bioenergetics.

Real-Time Monitoring of Energy Metabolism in Human NK Cells Using an Extracellular Flux Analyzer

This video demonstrates the lytic activity of natural killer cells against fluorescently-stained target cells. The method enables NK cell-induced cytotoxicity measurement by staining dead cells and using a flow cytometer to quantify live and dead target cells.

Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity Assay Sample Preparation for Flow Cytometric Analysis

Een eenvoudige en betrouwbare werkwijze is beschreven om een ​​set van NK celfuncties zoals degranulatie cytokine en chemokine productie in verschillende NK cel subsets te analyseren.

Flowcytometrie-gebaseerde test voor het toezicht op NK celfuncties

Dit werk beschrijft een geavanceerd werkproces voor de nauwkeurige en snelle bepaling van het NK (Natural Killer) celgetal en de NK celcytotoxiciteit in menselijke bloedmonsters.

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

Een stroom cytometry gebaseerde methode om kwantitatief de cytotoxische activiteit van menselijke natural killer cellen wordt hier weergegeven.

Een stroom Cytometry gebaseerde cytotoxiciteit Assay voor de beoordeling van menselijke NK cel activiteit

Ontduiking van natuurlijke killer (NK) celgemedieerde uitroeiing door kankercellen is belangrijk voor kanker initiatie en progressie. Hier presenteren we twee niet-radioactiviteit-gebaseerde protocollen om NK cel-gemedieerde cytotoxiciteit te evalueren in de richting van levertumorcellen. Daarnaast wordt een derde protocol gepresenteerd om NK-celmigratie te analyseren.

Meting van Natural Killer Cell-Gemedieerde Cytotoxiciteit en Migratie in de context van levertumorcellen

Een protocol voor het bestuderen van FcγRIIIa-gedreven gebeurtenissen door therapeutische antilichamen in menselijke natural killer cellen wordt hier beschreven. Dit kunstmatige stimulatieplatform maakt het mogelijk om stroomafwaartse effectorfuncties te onderzoeken, zoals degranulatie, chemokine / cytokineproductie en signaalroutes gemedieerd door de FcγRIIIa- en Fc-delen van antilichamen die betrokken zijn bij binding.

Beoordeling van menselijke natural killer celgebeurtenissen gedreven door FcγRIIIa betrokkenheid bij de aanwezigheid van therapeutische antilichamen

Het huidige protocol laat zien hoe CD3−/CD45+CD56+ cellen met milde cytotoxiciteit kunnen worden onderscheiden van humane expanded potential stamcellen (hEPSC's) onder zowel 3D- als 2D-kweekomstandigheden. Dit maakt routinematige fenotypische validatie mogelijk zonder de vernietiging van de complexe micro-omgeving.

Generatie van Natural Killer Cellen uit Human Expanded Potential Stamcellen

Dit protocol beschrijft een labelvrije methode voor de snelle analyse van het aantal en de activiteit van natural killer (NK) cellen met behulp van lensloze schaduwbeeldvormingstechnologie. Deze methode kwantificeert morfologische veranderingen in individuele NK-cellen door computeranalyse van hun diffractiepatronen.

In het veld inzetbaar lensloos beeldvormingsplatform voor snelle labelvrije analyse van de activering van natural killer-cellen

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde in vitro. workflow voor consistente meting van natuurlijke, chimere antigeenreceptor-gemedieerde en antistofafhankelijke cytotoxiciteit van menselijke natuurlijke moordenaars met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie.

Kwantificatie van NK-cel cytotoxiciteit versterkt door chimerische antigeenreceptoren en therapeutische antilichamen met behulp van live-cell imaging en flowcytometrie

Leer hoe u het metabolisme van humane Natural Killer-cellen analyseert met een extracellular flux analyzer. Deze methode meet glycolyse en mitochondriale ademhaling in real-time voor immunologisch onderzoek.

Analyse van human natural killer cell metabolisme

Meer video's verkennen