Isoleren van menselijke perifere bloedmonucleaire cellen en CD4 + T-cellen van patiënten met het Sézary-syndroom voor transcriptomische profilering

Dit protocol stelt ons in staat om lymfocyten T-cellen van patiënten met de ziekte te isoleren voor studies, het moleculair defect en immunologisch defect. Deze methode stelt ons in staat om levensvatbare cellen te isoleren, cellen met de ziekteafwijkingen voor zuivering van RNA, DNA en eiwit van deze patiënten en dat stelt ons in staat om moleculaire defecten te karakteriseren om pathways-afwijkingen te begrijpen die belangrijk zijn in pathogenese. Deze methode is waardevol voor isolatie van perifeer bloed dat verder kan worden gefractioneerd om bloedcellen in normale toestanden te bestuderen, evenals bloedcellen van ziekten met immuunafwijkingen.

Deze procedure wordt gedemonstreerd door Alanna, een medische student research fellow van mijn laboratorium. Na het verkrijgen van een perifeer bloedmonster in vijf buisjes van 10 milliliter die antistollingsmiddel bevatten, brengt u 10 tot 15 milliliter bloed over in scheidingsbuizen van 50 milliliter met het onderwerpnummer en verdunt u de monsters ten minste tweevoudig, maar tot niet meer dan 35 milliliter per buis met HBSS. Leg het bloed voorzichtig en langzaam onder elkaar met ongeveer 13 milliliter dichtheidsmedium per buis, waardoor het pipetteren wordt gestopt wanneer de pipet bijna leeg is om bubbels te voorkomen.

Verwijder de pipet langzaam om te voorkomen dat de bloed- en dichtheidsmediumlagen worden gemengd en breng de gevulde scheidingsbuizen voorzichtig over naar de centrifuge zonder de lagen te verstoren. Na het scheiden van de cellen door centrifugeren, verwijdert u alles behalve de laatste 10 milliliter van het plasma dat de bovenste laag bevat, voordat u voorzichtig en langzaam de buffy coat verzamelt. Bundel de buffy coat van tussen twee scheidingsbuizen in een enkele gelabelde steriele buis van 50 milliliter en verdun de PBMC ten minste tweevoudig met verse HBSS tot een totaal van 50 milliliter per buis.

Wanneer alle buffy coats zijn verzameld, pellet de cellen door centrifugeren en zoveel mogelijk van het supernatant uit elke buis verwijderen. Tik op de bodem van de buis om de pellet los te maken en de pellets opnieuw te suspenderen in één tot twee milliliter ACK-lysisbuffer per oorspronkelijk bloedmonstervolume van 10 milliliter per buis. Stop na precies vijf minuten de lysis in elke buis met een gelijk of groter volume HBSS en pas elk volume aan op 50 milliliter.

Na het centrifugeren gooit u het supernatant weg, bundelt u de cellen van dezelfde donor en brengt u het volume tot 50 milliliter met verse HBSS voor een nieuwe centrifugatie. Vervolgens resuspend de cellen in 10 milliliter van 37 graden Celsius RP 10F medium voor het tellen. Voor CD4+CD45RO+T-celzuivering draait u de cellen af en verdunt u de PBMC tot een concentratie van vijf keer 10 tot de zevende cel per milliliter selectiebuffer.

Breng de cellen over in een polystyreenbuis met een ronde bodem van vijf milliliter en voeg 50 microliter antilichaamcocktail per milliliter monster toe met zachte menging. Na vijf minuten bij kamertemperatuur vortex magnetische deeltjes op hoge snelheid gedurende 30 seconden voordat 50 microliter magnetische deeltjes per milliliter monster aan de buis worden toegevoegd met zachte menging. Breng het volume op 2,5 milliliter met verse selectiebuffer en voorzichtig mengen en plaats de buis gedurende 2,5 minuut op een magneet.

Pak aan het einde van de incubatie de magneet op en keer de buis in één continue beweging om om de verrijkte celsuspensie in een nieuwe steriele buis te decanteren. Om het celherstel te verhogen, voegt u 2,5 milliliter selectiebuffer toe aan de buis zonder de geïmmobiliseerde kralen te verstoren gedurende nog eens 2,5 minuten incubatie op de magneet en voegt u de was toe aan de verzamelbuis, telt u vervolgens het aantal levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en bevestigt u de celzuiverheid door flowcytometrie. Om de cellen te activeren, past u CD4 + CD45RO + T-cellen aan op een vijf keer 10 tot de zesde cellen per milliliter van 37 graden Celsius RP 10F mediumconcentratie en zaait u de cellen op kweekschalen van de juiste grootte.

Laat de cellen 's nachts rusten in een bevochtigde incubator van 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide. Verzamel de volgende ochtend de rustende cellen door centrifugering en resuspend de pellet met een gemiddelde concentratie van vijf keer 10 tot de zesde cellen per milliliter van 37 graden Celsius RP 10F. Splits de suspensie in vijf tot 10 keer 10 tot de zesde cel aliquots in elk van de drie steriele schroefdopbuizen en stimuleer de cellen in buis twee met PMA en buis drie met A23187 en voorzichtig mengen.

Voeg een gelijk volume dimethylsulfoxide toe aan de eerste buis om als voertuigcontrole te dienen en plaats de buizen met de doppen losgemaakt in de incubator gedurende de juiste activeringsperiode. Verzamel aan het einde van de incubatie de cellen door centrifugering en gooi zoveel mogelijk van het supernatant weg zonder de celkorrel te verstoren. Lyseer vervolgens de cellen zoals voorgeschreven door een in de handel verkrijgbare RNA-isolatiekit en isoleer het RNA volgens de instructies van de fabrikant.

De levensvatbaarheid en zuiverheid van CD4+CD45RO+T-cellen verkregen door dit negatieve selectieprotocol is consistent hoog. De opbrengst van CD4+CD45RO+T-cellen verkregen uit leukoreductiesysteemkamers van SS PBMC's is typisch ongeveer 75%, vergeleken met ongeveer 16% van normale donor PBMC's. SS geheugen T-cellen en SS PBMC's slecht tot expressie gebracht cytokine en andere immuunresponsgenen in vergelijking met cellen van normale donor T-cellen en PBMC's.

Bovendien zijn veel genen die normaal niet tot expressie komen in normale donor-T-cellen sterk tot expressie in SS T-cellen, zowel in rust als na stimulatie. Een goede steriele techniek en een consistente routine zijn erg belangrijk voor het succes van deze techniek. Het is ook erg belangrijk tijdens het gelaagd maken van de Ficoll dat je een automatische pipet gebruikt met fijne controle en dat je echt let op de snelheid waarmee je de Ficoll neerlegt.

Cellen die met deze methode worden geïsoleerd, zullen levensvatbaar zijn en kunnen worden gebruikt voor toxiciteitsstudies, moleculair biochemische studies voor de karakterisering van signaaltransductieroutes, flowcytometrie en genexpressiestudies. De methode kan worden gebruikt voor het isoleren van cellen van patiënten met een ziekte, voor ontstekingsziekten en ook andere ziekten zoals kankers voor directe studies. Voorbeelden van deze ziekten zijn psoriasis en atopische dermatitis.