Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

Het voorbereiden van een enkele cel of enkele kernen schorsing is een cruciale stap voor hoge doorvoer transcriptome en epigenoom profilering. Ons protocol biedt een eenvoudige, reproduceerbare en universele methode voor enkele kernisolatie. In tegenstelling tot andere methoden die wasmiddel voor kernisolatie, ons protocol is kolom-gebaseerd, dat is wasmiddel en enzym-vrij.

Het maakt kernisolatie in minder dan 30 minuten mogelijk. Ons protocol vereenvoudigt de isolatie van kernen. Het biedt een robuuste methode om enkele kernen suspensie van moeilijk te scheiden weefsels voor te bereiden.

Om te beginnen, pre-chill buffer A en B van een wasmiddel-vrije kern isolatie kit door ze op ijs voor ten minste 30 minuten. Coat buizen en pipet tips met 5%BSA oplossing, die het herstel van de kernen zal verbeteren. Om de pipettips te coaten, u twee tot drie keer pipette 5%BSA-oplossing gebruiken en deze twee uur drogen.

Om de buizen te coaten, vul ze met BSA en keer ze drie keer om. Verwijder de oplossing en de lucht droog de buizen ondersteboven op een schoon tissue papier voor twee uur. Coat één opvangbuis en één buis van 1,5 milliliter per monster.

Gebruik tangen om de schedel voorzichtig open te breken en zachte weefsels, huid en botten te verwijderen uit de ventrale en rugkanten van de schedel. Breng vervolgens voorzichtig de hersenen over in een schaal van 30 millimeter met ijskoude PBS en hak de hersenen in kleine stukjes met behulp van een scheermesje. Om enkele kernen te isoleren, breng je het gehakte weefsel over op de filtercartridge in de isolatiekit van de kernen en verwijder je overtollige oplossing en voeg je 200 microliters koude buffer A.Grind het weefsel toe met een plastic staaf gedurende twee minuten.

Voeg 300 microliter koude buffer A toe aan de filtercartridge en broed deze 10 minuten op ijs met de dop open. Dop vervolgens de cartridge af en zet het weefsel opnieuw op door de buis vijf keer om te keren. Centrifugeren de monsterbuis op 16.000 keer g gedurende 30 seconden om de cellen te scheuren.

De flow-through bevat intacte kernen, die een kleurloze pellet vormen aan de onderkant van de buis. Gooi het filter weg en zet de pellet opnieuw op door 10 seconden krachtig te wervelen. Pellet de kernen opnieuw door de oplossing drie minuten lang op 500 g te centrifugeren.

Gooi vervolgens voorzichtig de supernatant weg. Resuspend de pellet in 0,8 milliliter koude buffer B door twee tot drie keer te pipetten en de kernen gedurende 10 minuten op 600 g te centrifugeren, wat ze van het membraanpuin zal scheiden. Gooi de supernatant voorzichtig weg.

Resuspend de geïsoleerde kernen in 500 microliter PBS met 5%BSA en houd de suspensie op ijs tot FACS. Om nucleaire morfologie met HEX-kleuring te bevestigen, breng je 100 microliters van de enkele kernenusopening over naar een nieuwe buis met behulp van de met BSA gecoate tips. Bevlek de kernen door 0,1 microliter HEX toe te voegen en de buis voorzichtig te laten vortexen.

Breng de oorsussusvering over naar een glazen bodemschaal en afbeelding van de kernen met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een laserexcitatieinstelling van 405 nanometer. Voordat u FACS uitvoert, filtert u de kernen met een 40 micrometercelzeef in een met BSA gecoate buis. Verdun de gefilterde suspensie door PBS met 5% BSA toe te voegen aan een eindvolume van 1.000 microliter.

Label twee ronde FACS-buizen aan de onderkant als controle en bevlekt en breng 250 microliters van de kernenveersie in de bedieningsbuis met behulp van een met BSA gecoate pipetpunt. Breng de resterende 750 microliter van de oplossing over naar de FACS-buis met het label gekleurd en voeg één microliter HEX-kleurstof toe om de kernen te bevlekken. Meng het dan door langzame vortexing.

Laad het niet-bevlekte besturingsmonster in de celsorteerder en neem 5.000 gebeurtenissen op. Laad vervolgens het gekleurde monster en neem 5.000 gebeurtenissen op. Teken FACS-poorten voor de identificatie van enkele kernen.

Kernen kunnen worden geselecteerd door het HEX fluorescerende signaal te vergelijken tussen de besturing en gekleurde monsters. Sorteer vervolgens HEX positieve kernen van de gekleurde buis in een nieuwe 1,5 milliliter buis met 50 microliter PBS met 5%BSA. Dit protocol werd gebruikt om enkele kernsussuspensie rechtstreeks van zebravis hersenweefsel te genereren.

De geïsoleerde kernen werden bevlekt met HEX en gevisualiseerd met fluorescentiemicroscopie. Ze leken intact, rond en goed gescheiden. Belangrijk is dat nucleaire aggregatie afwezig was.

Verrijking van geïsoleerde kernen werd uitgevoerd met stroomcytometrie door gating op de aanwezigheid van een HEX fluorescerend signaal. Onbevlekte kernen weergegeven achtergrond fluorescentie, terwijl gekleurde kernen tentoongesteld sterke fluorescentie signaal. De onbevlekte en bevlekte kernen waren goed gescheiden in het violette kanaal.

Tijdens een poging tot dit protocol, is het belangrijk om te onthouden dat enkele kernen de neiging om vast te houden aan een plastic materiaal. Om het potentiële verlies van kernen te voorkomen en de efficiëntie te verhogen, wordt de basiscoating van het kunststofmateriaal ten zeerste aanbevolen. Geïsoleerde enkele kernen suspensie kan verder worden gebruikt voor enkele kernen RNA Deze techniek verhelderen cellulaire heterogeniteit in complexe biologische systemen en helpen bij het definiëren van celsubtypes en gennetwerken.

Met behulp van een wasmiddel en enzymvrije methode registreert de technische ruis en bias die tijdens de monsterbereiding zijn geïntroduceerd. Deze methode heeft een vereenvoudigde en logistieke isolatie van enkele kernen ontwikkeld.