Bijdrage van de Na⁺/ K⁺ Pomp aan ritmische bursting, onderzocht met modellering en dynamische klemanalyses

Dynamische klemming kan elke membraanstroom in een neuron wijzigen of introduceren. We introduceren en modificeren de natriumkaliumpomp en persistente natriumstroom in een levend hartinteron van een bloedzuiger. Het gebruik van een dynamische lamp maakt volledige controle mogelijk met een toetsaanslag van de dynamiek en amplitude van elke stroom die in realtime in een neuron wordt geïntroduceerd.

De ontwikkeling van real-time interactieve systemen zoals de dynamische klem ondersteunt al het BMI-onderzoek. Alle aspecten van de cellulaire studies over de elektrische activiteit van neuronen en netwerken kunnen mogelijk profiteren van het gebruik van dynamische klem. De belangrijkste uitdagingen van deze techniek zijn het ontwikkelen van de real-time modellen in neuron en het kalibreren van de dynamische krampaanpassingen aan het neuron dat voor studie is geselecteerd.

Voor de isolatie van het ganglion 7 van een bloedzuigerzenuwstreng vult u een zwarte harslijn ontleedschaal met ongeveer één centimeter gekoelde zoutoplossing aangevuld met natriumchloride, kaliumchloride, calciumchloride, D-glucose en HEPES in gedeïoniseerd water en speldt u een koud verdoofde bloedzuiger dorsale zijde omhoog in de kamer. Gebruik een stereomicroscoop met een vergroting van 20x met schuine lichtgeleidingsverlichting en een veerschaar van vijf millimeter om een longitudinale snede van ten minste drie centimeter lang door de lichaamswand in het rostrale derde deel van het lichaam te maken. Gebruik pinnen om het lichaamswandweefsel uit elkaar te trekken om de inwendige organen bloot te leggen en het bloed te stofzuigen om een beter zicht te krijgen.

Isoleer een individueel ganglion van het middenlichaam 7. Gebruik een scherpe tang met nummer vijf om het snijden te begeleiden en de sinus vast te houden, gebruik de schaar om de sinus te openen waarin het zenuwkoord zich bevindt, waarbij u ervoor zorgt dat de sinus dorsaal en ventraal wordt gespleten. Houd de sinus vast aan elk van de twee bilaterale zenuwwortels die uit het ganglion komen, snijd de rostrale en caudale bindzenuwbundels om het ganglion uit het lichaam te verwijderen en snijd de wortels lateraal door naar waar ze uit de sinus komen.

Gebruik oude stompe nummer vijf tang om de sinusstrips en het losse weefsel vast te zetten met verkorte Minutien insectenpennen ventrale kant naar boven in heldere met hars beklede petrischalen. Pin de rostrale en caudale bindmiddelen zo ver mogelijk van het ganglion en pin de wortels veilig vast. Verhoog de vergroting van de stereomicroscoop tot 40X of meer en pas de schuine verlichting zodanig aan dat de neuronale cellichamen gemakkelijk kunnen worden waargenomen aan de ventrale kant van het ganglion net onder het perineurium.

Begin met behulp van een microschaar de losse peroneale mande tussen de wortels aan de ene kant van het ganglion te knippen, de snede zijdelings naar de andere kant voort te zetten en zorg ervoor dat het schaarblad oppervlakkig blijft zonder de neuronale cellichamen direct onder de schede te beschadigen. Maak een soortgelijke oppervlakkige snede caudaal van de laterale snede langs de middellijn en gebruik fijne nummer vijf tang om één caudale laterale flap van de schede tegelijk van het ganglion weg te trekken zodat ze allemaal kunnen worden weggesneden. Wanneer beide flappen zijn verwijderd, moeten beide hartinerronnen worden blootgesteld.

Plaats de schotel in de opname-opstelling en overlaameer het monster met zoutoplossing met een stroomsnelheid van vijf milliliter per minuut bij kamertemperatuur. Om de interneuronen op de opname-instelling te identificeren, selecteert u een vergroting van 50 tot 100X met donkere veldverlichting eronder en lokaliseert u een HN 7-neuron van het bilaterale paar op zijn canonieke locatie op de achterste positie in ganglion 7 van het middenlichaam. Gebruik vervolgens een micromanipulator om een scherpe micro-elektrode gevuld met twee molaire kaliumacetaat en 20 millimolaire kaliumchloride micro-elektrode zeer dicht bij het doelcellichaam te plaatsen en gebruik een neurofysiologische elektrometer om continu het geregistreerde potentieel te observeren.

Stel deze potentiaal in op nul millivolts en penetreer het neuron met de micro-elektrode met behulp van de manipulator om de elektrode langzaam langs zijn lange as te drijven. Gebruik een 100 milliseconde elektrometerzoemfunctie totdat een negatieve verschuiving in membraanpotentiaal en krachtige spikingactiviteit wordt waargenomen. Stel de elektrometer in op ten minste drie kilohertz in de discontinue stroomklemmodus om tegelijkertijd de membraanpotentiaal te registreren terwijl de stroom naar het neuron wordt doorgegeven.

Gebruik een oscilloscoop om de instelling van de elektrode te controleren en gebruik een constante stroominjector om gedurende één tot twee minuten een constante stroom van minus 0,1 nanoampère te injecteren om de opname te stabiliseren. Het HN 7-neuron kan worden geïdentificeerd aan de kenmerken van de piekvorm en zwakke barstactiviteit. Voor dynamische klemgeleiding en huidige implementatie opent u een dynamisch klemsoftwareprogramma dat speciaal is gebouwd voor de digitale signaalverwerkingskaart.

En terwijl het model draait, stelt u de maximale pompstroom in op 0,1 tot 0,2 nanoampère en verhoogt u geleidelijk de maximale geleiding van de aanhoudende natriumstroom totdat er regelmatig barsten volgt. Varieer deze stromen systematisch in stappen van 0,1 nanoamp voor de maximale output van de pompstroom en één nanosiemens incrementen voor de maximale geleiding van de persistente natriumstroom en beoordeel de effecten van deze verhogingen op de piekfrequentie, inter-burst interval, burst duur en burst periode. Houd de maximale geleiding van de natriumstroom op een specifieke vaste waarde en veeg in stappen van één nanoamp over een reeks maximale pompstromen om regelmatige barstende activiteit te ondersteunen voordat de vaste waarde van de natriumgeleiding door één nanosiemens wordt verhoogd en over een tweede bereik van maximale pompstromen wordt geveegd.

Verzamel voor elk geïmplementeerd parameterpaar gegevens met ten minste acht bursts, zodat betrouwbare gemiddelde metingen van de piekfrequentie, inter-burst interval, burst-duur en burst-periode kunnen worden gemaakt. Verzamel vervolgens gegevens van verschillende extra neuronen zoals zojuist gedemonstreerd om een samengestelde grafiek te genereren. Met behulp van dit model oscilleert de uitgaande pompstroom gedurende de burst-cyclus als de interne concentratie van natrium rond een basislijnniveau.

Deze pompstroom draagt bij aan de burst-beëindiging tijdens de burst-fase. De hyperpolarisatie geproduceerd door de pompstroom activeert hyperpolarisatie geactiveerde inwaartse stroom tijdens het inter-burst interval. Het real-time hartinteronmodel geeft aan dat de aanhoudende natriumstroom in hartinterronen bijdraagt aan een groot deel van de natriuminvoer die de interne concentratie van het natrium en dus de pompstroom sterk beïnvloedt.

Omdat de persistente natriumstroom actief is bij relatief negatieve membraanpotentiaalen, verzet deze zich tegen de pompstroom tijdens zowel de burst- als inter-burst-intervallen. Zoals geïllustreerd, wordt robuuste barsten hersteld in tonisch actieve hartinerinuronen door de co-toevoeging van persistente natrium- en natriumkaliumpompstromen met een dynamische klem. Voorlopige resultaten wijzen op een sterke gecompliceerde interactie tussen de twee stromingen, die verder kan worden onderzocht met behulp van het model.

Een succesvol experiment hangt af van de goede ontheathing van het ganglion en het zorgvuldig gericht aandrijven, penetreren en zoemen van de micro-elektrode. We vergroten de dynamische klem door een natriumafhankelijke pompstroom te implementeren die wordt berekend door de intracellulaire concentratie van een ion te schatten. Dergelijke schattingen kunnen worden gebruikt om ionenafhankelijke stroom in een neuron te injecteren.