RNA Interferentie in aquatische kevers als een krachtig instrument voor het manipuleren van genexpressie op specifieke ontwikkelingstijdpunten

Zelfs als genbewerking populair is geworden voor het bestuderen van de moleculaire genetica van niet-modelorganismen, blijft RNAi een krachtig synergetisch hulpmiddel. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze kan worden toegepast op verschillende ontwikkelingsstadia. Bovendien kan gedeeltelijke knockdown worden gebruikt om deze hele genen te bestuderen.

Het succes van de procedure is afhankelijk van de injectie van DSR en het hebben van minimale schade. Dit vergt oefening, dus wees niet ontmoedigd als het duurt een paar pogingen om het goed te krijgen. Om embryo's in een vroeg stadium voor te bereiden op micro-injectie, giet eerst kokende 20%-agarose in een kleine petrischaal en plaats drie een tot twee millimeter brede plastic buizen op het oppervlak van de vloeibare agarose voordat het stolt.

Zodra de agarose is gestold gebruik maken van een paar stompe tangen om de buizen te verwijderen en de resulterende inkepingen te bedekken met 500 microliters van autoclave gedestilleerd water. Wanneer de inzamelcontainer klaar is gebruik een fijne natuurlijke haarlak borstel om vijf acht uur oude T.marmoratus embryo van de kever nesting sites in een glazen holte schotel gevuld met autoclave gedestilleerd water onder een stereo microscoop. Met behulp van de microscoop en fijne dissectie tangen grijpen de chorion van elk embryo van beide zijden en rippen de chorion open waardoor het embryo zachtjes uit het weefsel glijden.

Na het verwijderen van beide chorionlagen uit alle verzamelde embryo's gebruikt u de kwast om de embryo's van de glazen holteschaal zorgvuldig over te brengen in de groeven van de bereide agaroseplaat. Om embryo's in een vroeg stadium met genspecifieke dubbelstrengs RNA te injecteren, bereid je eerst microinjectienaalden op een naaldpuler voor en gebruik je de stereomicroscoop en vind je tangen om elke punt tot een scherpe rand te breken. Na het gooien van de gezuiverde voorraad dubbelstrengs RNA van belang op ijs, voeg een microliter van 10X injectie buffer aan de resulterende oplossing en gebruik dubbel gedestilleerd water om het vinyl volume van de oplossing te brengen tot 10 microliters.

Gebruik een P10 pipet om een van de voorbereide microinjectienaalden te vullen met de werkende dubbelstrengs RNA-oplossing en laad de naald in een microneedle houder die is aangesloten op een microinjectiesysteem dat gebruik maakt van de uitwerptechnologie voor drukuitwerping. Zet het microinjectiesysteem en de luchttoevoer onder druk aan en gebruik de microklep op het microinjectiesysteem om de injectiedruk op 15 pond druk per vierkante inch in te stellen en gebruik vervolgens de tijdverstellingsknop om de injectieduur op seconden in te stellen. Om de injectienaald te kalibreren, beoordeelt u het volume van de vloeistofbel die aan het puntje van de naald wordt gevormd bij het injecteren in de lucht voor het embryo van T.marmoratus, gebruik dan een optimale bellengrootte van 100 tot 200 micron.

De injectienaald is van goede kwaliteit als optimale bellen kunnen worden bereikt op 15 pond druk per vierkante inch met een injectieduur van ongeveer drie seconden. Wanneer de naald is ingesteld, lijnt de naald op de agaroseplaat van embryo's zodanig uit dat de naald de embryo's in een hoek van 45 tot 60 graden nadert. Gebruik de micro manipulator om langzaam te bewegen de microneedle totdat de tip is het aanraken van het oppervlak van het midden van een embryo dan voorzichtig verplaatsen van de naald naar voren totdat het gewoon doorboort het oppervlak van het embryo.

Zodra de naald zich in het embryo bevindt, drukt u voorzichtig op de micro-injectorinjectorinjectieknop om een tot twee nanoliter dubbelstrengs RNA in het embryo te leveren. Wanneer alle RNA is geleverd langzaam terugtrekken van de naald uit het embryo zonder dat het embryo te scheuren. Met succes geïnjecteerde embryo's kunnen worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van een gekleurde plek op de plaats van injectie.

Wanneer alle embryo's zorgvuldig zijn geïnjecteerd plaats de schotel in een vochtigheidskamer in een 25 graden Celsius incubator ingesteld op een 14 uur licht 10 uur donkere cyclus voor vier tot vijf dagen. Monitor de embryoontwikkelingsvoortgang dagelijks onder de stereomicroscoop om morfologisch zichtbare knockdown fenotypes te identificeren. Met behulp van een hoge resolutie digitale camera om het ontwikkelingsproces te documenteren.

Verwijder dode embryo's en vul het water op de agaroseplaat dagelijks aan om uitdroging en verspreiding van microbiële besmetting naar andere overlevende embryo's tijdens de incubatieperiode te voorkomen. Voeg voor het verzamelen van de larve eerst 60 tot 70 graden Celsius toe aan een kleine petrischaal. Wanneer de agarose heeft gestold gebruik stompe tangen om een ondiepe groep per larve te worden geïnjecteerd in de agarose en voorzichtig afvoer van het water uit de larve cultuur cups.

Na anesthesie gebruik soft ended tangen om de larve voorzichtig plaats op de immobilisatie plaat met de nekken en lichamen in de groeven, maar de staart gelegen boven het agarose oppervlak. Wanneer alle van de larve was geplaatst, bedek elke lava met een dikke laag van agarose die nog steeds vloeibaar, maar niet gevaarlijk warm en vrij alle verhalen die per ongeluk werden bedekt als nodig is. voor een dubbelstrengde RNA microinjectiebelasting een microneedle met de genspecifieke dubbelstrengs RNA werkoplossing van belang zoals aangetoond.

Redrag de zuiger van een handmatig gestuurde microinjectiespuit en laad de naald op het microinjectiesysteem. Plaats de geïmmobiliseerde larve onder de stereomicroscoop zodanig dat de injectieplaats in een relatief vlakke hoek is uitgelijnd met de baan van de microinjectienaald. Gebruik de micro manipulator om de naaldpunt voorzichtig in de larve te verplaatsen en langzaam en zorgvuldig druk uit te oefenen op de spuit, waarbij de injectiedruk wordt aangepast aan de beweging van de gekleurde injectievloeistof in de naald indien nodig.

Wanneer alle RNA is geïnjecteerd gebruik zachte tangen om de larve te bevrijden van de agarose en plaats de larve in een nieuwe container van kamertemperatuur water op 25 tot 28 graden Celsius en een 14 uur licht 10 uur donkere cyclus. In deze representatieve analyse werden drie verschillende genen neergehaald in verschillende ontwikkelingsstadia van de zonnestraalduikkever T.marmoratus. RNA interferentie wordt uitgevoerd zoals aangetoond door het injecteren van dubbelstrengs RNA in een zeer vroeg stadium van embryogenese.

Sommige embryo's overleven het proces niet en worden necrotisch. In deze beelden controleren ze individueel en een individu met een iets lichtere oogkleur kan worden waargenomen. In deze persoon, een meer ernstige knockdown waarin de meer ventrale leugens van de cluster zijn volledig unpigmented, maar de do bondgenoten nog steeds tonen enige pigmentatie kan worden waargenomen.

Hier wordt een voorbeeld van een ander individu met hoofdzakelijk volledig pigmentverlies in alle ogen getoond. Lac2 neergehaald in larven resulteert in een minder gepigmenteerde cuticula, lichtere volwassen individuen met enigszins misvormde vleugels waarschijnlijk als gevolg van de ongewone zachtheid van het weefsel werden ook verkregen. Zorg ervoor dat u er scherp naar kijkt om uw geïnjecteerde dieren dagelijks nauwlettend in de gaten te houden en om eventuele dode individuen onmiddellijk te verwijderen.

De kracht van deze techniek is dat het kan worden toegepast op de genen van veel verschillende organismen. Deze techniek is ook op grote schaal en met succes toegepast op evolutionaire ontwikkelingsbiologie.