Detectie van Phytophthora capsici in irrigatiewater met behulp van loop-gemedieerde isothermale versterking

Fytopathogen detectie is een cruciale stap in het beheer van plantenziekten. Dit protocol biedt een snelle detectiemethode voor irrigatiewaterverontreiniging als gevolg van een veel voorkomende ziekteverwekker in water. Met behulp van deze techniek kan specifieke ziekteverwekker, zoals Phytophthora capcici, worden verwerkt en snel worden gedetecteerd uit ons grote volume irrigatiewater terwijl ze ter plaatse blijven.

Het aantonen van de procedure zal Owen Hudson, een Masters student uit mijn laboratorium, en Sumyya Waliullah, een postdoctoraal onderzoeker van dr. Pingxi G's laboratorium op te zetten het opzetten van een pomp en filter voor op het terrein Phytophthora capcici detectie in irrigatiewater. Bevestig een filterfles aan een buis die is aangesloten op een handpomp en plaats buchnertrechter in de rubberen stop in de mond van de filterfles. Dan past een geschikt formaat stuk filterpapier met een retentiegrootte van 15 micron in de trechter.

Om watermonsters te verkrijgen, verzamelt u irrigatiewater van de beoogde bron. Het water kan kleine hoeveelheden puin hebben, maar geen significant sediment of bodem. Giet langzaam tussen de 50 tot 1000 milliliter testwater over het filterpapier in de trechter terwijl u de handpomp gebruikt om een zuigkracht te creëren om het water door de trechter te trekken.

Wanneer al het water is gefilterd, gebruikt u tangen om het filterpapier uit de trechter te verwijderen. En gebruik steriele schaar om het papier in kleine stukjes te snijden. Dompel acht tot twaalf stukken papier onder in 400 microliter extractiebuffer in een buis van 1,5 milliliter voor een vijf minuten durende incubatie bij kamertemperatuur.

Vortex of anderszins roeren het papier voor 10 seconden per minuut. Gebruik aan het einde van de incubatiekracht tangen om het papier met zo min mogelijk buffer te verwijderen. En herhaal de licentie met de volgende set van filter papier stukken.

Voor DNA-extractie van de filter papier monsters toegevoegd 20 microliter van proteinase K en 10 microliter van 10 nanogram per microliter RNAs aan het monster ook en de oplossing incuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten met vortexing of schudden om de drie minuten. Voeg aan het einde van de incubatie 500 microliter magnetische kralen in bindende buffer toe aan het monster en meng goed door te schudden. Na vijf minuten op kamertemperatuur, plaats de buis en de magnetische scheidingsteken rack gedurende twee minuten voor het verwijderen en weggooien van de supernatant.

Verwijder de buis van de magnetische afscheider en zet de kralen krachtig opnieuw op in 500 microliter wasbuffers. Na 30 seconden terug de buis naar de magneet en wacht twee minuten voordat het verwijderen van de supernatant. Herhaal de was met 500 microliters van wasbuffer ook en 500 microliters van 80% ethanol zoals net aangetoond.

En lucht drijft de magnetische kraalpellet gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie opnieuw opschorten de kralen in 50 microliter van elution buffer met pipetten gedurende een minuut voor het plaatsen van de buis terug op de magneet gedurende twee minuten om het verzamelen van de supernatant mogelijk te maken. Na de voorbereiding van de LAMP primer mix zoals aangegeven in de tabel, voeg op 2,5 microliter van primer mix 12,5 microliter van een lava LAMP mastermix een microliter van geëxtraheerd DNA en negen microliter van dubbel gedestilleerd water aan een PCR buis en het opzetten van een positieve en een negatieve controle.

incubeer alle monsters in een 64 graden Celsius warmte blog gedurende 45 minuten of de geest drie versterking instrument aan het einde van de incubatie, een belasting van vijf microliters van elk versterkt monster op een 1%agarose gel en beeld de resulterende banden op een ultraviolet beeldvorming machine. Als een calorimetrische kleurstof is gebruikt, bekijkt u de kleurverandering om de resultaten als positief of negatief te bepalen. Als een draagbaar versterkingsinstrument is gebruikt, bekijkt u de versterkingsgrafiek op het scherm om de resultaten te bepalen.

De optische tijd voor het uitvoeren van de LAMP-test bij 64 graden is 45 minuten, omdat de laagste concentraties die positief waren voor detectie pas na 40 minuten worden versterkt, terwijl hogere concentraties na 20 minuten worden versterkt. Versterking kan worden bevestigd op een 1%agarose gel gelabeld met een Nucleïnezuur vlek. Zoals geïllustreerd conventionele PCR is 40 keer minder gevoelig dan LAMP.

Detecteren 4,8 keer 10 tot de derde zoösporen per milliliter concentraties op de laagste. In deze analyse werden watermonsters verzameld uit zeven vijvers die werden gebruikt voor commerciële groenteproductie in Tift County, Georgia. Drie daarvan toonden positieve LAMP-resultaten aan.

Toen de monsters echter door conventionele PCR werden getest, werden in slechts één van de drie positieve monsters zoösporen aangetroffen. In deze tabel worden de verschillen tussen detectiemethoden met behulp van variabelen als gevoeligheid, tijd, vereiste voorbereiding, materialen en kosten samengevat. LAMP is de minst dure methode onder de geteste methoden, en is ook de snelste, die slechts 30 tot 60 minuten voor versterking in vergelijking met conventionele PCR versterking.

Met behulp van dit protocol DNA gewonnen uit nauw verwante UMI zaad pathogenen resulteert in geen detectie voor een van de monsters, bevestiging van de specificiteit van de primers. Zorg ervoor dat u het monsterwater niet te snel giet en wees voorzichtig bij het toevoegen van geëxtraheerd DNA aan de LAMP-buizen om verontreiniging te beperken. Zodra andere watergedragen ziekteverwekkers hun specifieke primersets hebben laten ontwikkelen, kunnen de filtratie- en lampzuurmethoden worden aangepast voor andere ziekteverwekkers.