Quantifying Spontaneous Ca²⁺ Fluxes en hun downstream effecten in primaire muis midbrain neuronen

Dit protocol kwantificeert calciumstromen in dopaminerge neuronen, die verloren gaan bij de ziekte van Parkinson. Dit is handig om te begrijpen hoe abnormaal calcium dopaminerge neuron verlies veroorzaakt bij de ziekte van Parkinson. Voor het eerst tonen we spontane calciumstromen in gekweekte primaire midbrainneuronen.

Deze methode kan worden gebruikt om specifieke receptorbijdragen die betrokken zijn bij calcium-gemedieerde apoptose te ontleden. Onze methode biedt een laan voor hoge inhoud drug schermen om specifieke en effectieve neuroprotectieve verbindingen voor de ziekte van Parkinson te ontdekken. Deze neuroprotectieve verbindingen zou voorkomen dat calcium-gemedieerde apoptose in dopaminerge neuron.

Begin met het bereiden van een milliliter serum-vrij DMEM medium met een microliter van hSyn-GCaMP6f AAV per schotel. Aspirate de cel cultuur medium van elk gerecht en vervang het door een milliliter van de voorbereide DMEM met hSyn-GCaMP6f. Plaats de gerechten terug in de 37 graden Celsius incubator voor een uur.

Na de incubatie, aspirate het medium met AAV's en vervang het door drie milliliter van celcultuur medium. Broed de gerechten vijf tot zeven dagen op 37 graden Celsius. Het veranderen van het medium om de twee tot drie dagen in deze periode van virale infectie.

Bereid een liter van de HEPES opname buffer, 200 milliliter van 20 micromolar glutamaat opname buffer, en 200 milliliter van 10 micromolar NBQX opname buffer volgens manuscript aanwijzingen. Vul een steriele petrischaal van 35 millimeter met drie milliliter van de opnamebuffer. Neem de petrischaal met de geïnfecteerde culturen uit de couveuse, pak dan voorzichtig de rand van een cover slip met fijne tip tangen en breng het in de schotel met de opnamebuffer.

Plaats de resterende afdekking slip in medium terug in de 37 graden Celsius incubator en vervoer de schotel met opname buffer naar de confocale microscoop. Start de beeldsoftware. Terwijl het initialiseren is, start de peristaltische pomp en plaats de lijn in de opnamebuffer.

Kalibreer vervolgens de stroom tot twee milliliter per minuut. Breng de geïnfecteerde cover slip van de Petri schotel naar het opnamebad met fijne tangen. Met behulp van de 10X water onderdompeling doelstelling en brightfield licht, vind het vlak van focus en kijk voor een regio met een hoge dichtheid van neuron cel lichamen, dan overschakelen naar de 40X doelstelling en heroriënteren van het monster.

Selecteer en pas AlexaFluor 488 toe in het lijstvenster Kleurstoffen. Om overbelichting en fotobleken van de fluoroforen te voorkomen, begint u met lage HV- en laservermogensinstellingen. Voor het AlexaFluor 488-kanaal stelt u de HV in op 500, de winst op 1x en de offset op nul.

Stel het vermogen in op 5% voor de 488 laserlijn. Verhoog de pinhole grootte tot 300 micrometer en gebruik de focus x2 scanning optie om de emissiesignalen optimaal aan te passen aan subsaturatieniveaus. Instellingen kunnen vervolgens worden aangepast voor een optimale zichtbaarheid van elk kanaal.

Zodra de microscoop instellingen zijn geoptimaliseerd, verplaatsen van het stadium om een regio te lokaliseren met meerdere cellen met spontane veranderingen in GCaMP6f fluorescentie en zich richten op het gewenste vlak voor beeldvorming. Gebruik het gereedschap Clipnect om het beeldframe te knippen tot een grootte die een frameinterval van iets minder dan een seconde kan bereiken. Stel het intervalvenster in op een waarde van 1,0 en het venster Num op 600.

Als u een film uit de T-serie wilt vastleggen, selecteert u de optie Tijd en gebruikt u de scanoptie Xyt om te beginnen met beeldvorming. Bekijk de voortgangsbalk van de beeldvorming en verplaats de lijn van de HEPES-opnamebuffer naar de 20 micromolar glutamaat opnamebuffer op het juiste tijdstip. Wanneer de beeldvorming is voltooid, selecteert u de knop Series done en slaat u de voltooide t-serie film op.

Blijf de glutamaat nog vijf minuten doornemen, zodat de cultuur van neuronen gedurende in totaal 10 minuten is blootgesteld aan glutamaat. Herhaal dit proces voor elke cover slip worden afgebeeld. Het is mogelijk om calciumsporen en neuronale cellichamen direct na het experiment te bekijken.

Gebruik het gereedschap Ellips om het gewenste aantal ROI's rond neuronale soma te tekenen. En gebruik de knop Serieanalyse om de sporen te visualiseren. Na de extra vijf minuten blootstelling aan glutamaat, verwijder de cover slip uit het bad met fijne tangen en plaats het terug in de Petri schotel met de opname buffer totdat alle beeldvorming is voltooid.

Op de dag van beeldvorming werden de VM-culturen behandeld met glutamaat of een combinatie van glutamaat en NBQX. In beide omstandigheden werden heterogene en spontane veranderingen in GCaMP6f-florescentie waargenomen, wat duidt op spontane calciumstromen. Toepassing van glutamaat genereerde een robuuste en aanhoudende calciumrespons in zowel spontaan actieve als rustige neuronen.

Toepassing van NBQX verminderde spontane activiteit en blokkeerde gedeeltelijk de glutamaatrespons. De mate waarin glutamaattoepassing een calciumreactie in elke voorwaarde stimuleerde werd gekwantificeerd gebruikend het gebied onder de kromme, piekamplitude, en latentie om te antwoorden. De latentie naar respons nam toe onder de NBQX- en glutamaatconditie.

Om glutamaat-gemedieerde apoptose te meten, werden de cellen gefixeerd en bevlekt met een anti-Caspase-3 antilichaam. Gemiddelde caspase-3 intensiteit was aanzienlijk hoger in beide behandelingsomstandigheden in vergelijking met onbehandelde controles. Een meer grondige analyse van opgewonden giftige celdood kan worden gedaan door het tellen van het aantal immunosbree tyrosine hydroxylase positieve dopaminerge neuronen in controle en glutamaat behandelde aandoening.

Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor het begrijpen van de relatieve bijdragen van verschillende receptoren en ijzerkanalen die betrokken zijn bij calcium-gemedieerde apoptose in dopaminerge neuron.