Name: Zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Leer het zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren. Deze methode simuleert pathologische angiogenese door hypoxie en biedt een reproduceerbare neurovasculaire respons voor preklinisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen en Anne Kankkunen voor de uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de Academy of Finland, Päivikki en Sakari Sohlberg Foundation, Tampere Tuberculosis Foundation, Finnish Medical Foundation, Pirkanmaa Hospital District Research Foundation en het Tampere University Hospital Research Fund.

Het hier beschreven protocol is goedgekeurd door de Nationale Ethische Commissie voor dieren van Finland (protocolnummer ESAVI/9520/2020 en ESAVI/6421/04.10.07/2017).
1. Proefdieren en muis OIR model inductie
OPMERKING: Gebruik tijdge gepaarde dieren, bijvoorbeeld veelgebruikte C57BL/6J muizen, om pups op dezelfde dag geboren te krijgen. Gebruik pleegdammen, bijvoorbeeld 129 stam (129S1/SvImJ of 129S3/SvIM) zogende moederdieren, om de pups te verzorgen tijdens en na de inductie van hyperoxia. U kunt er ook voor zorgen dat er extra zogende dammen beschikbaar zijn voor het geval de zogende dammen moeten worden vervangen vanwege uitputting. Beperk de nestgrootte tot 6-7 pups voor elke moeder bij gebruik van C57BL/6J muizen/dammen (als de nesten groter zijn dan dat de pups de neiging hebben om beperkte gewichtstoename te hebben)16.
<ol><li>Noteer het gewicht van de dieren voor en na hyperoxia-inductie en op het moment van offeren.</li>
	<li>Zorg ervoor dat er voldoende voedsel op de bodem van de kooi ligt, zodat de dammen gemakkelijk toegang hebben tot voedsel.</li>
	<li>Voeg sodakalk met kleurindicator toe aan de onderkant van de kamer om overtollige CO2 op te nemen wanneer een filtratiesysteem niet wordt gebruikt.</li>
	<li>Controleer de luchtvochtigheid en temperatuur in de kamer en houd de luchtvochtigheid tussen de 40 en 65%. Verhoog indien nodig de luchtvochtigheid van de kamer door borden met water op de bodem van de kamer te plaatsen (bijv. Petri-gerechten).</li>
	<li>Kalibreer de O2 sensor met 100% O2 en normale kamerlucht.</li>
	<li>Plaats de P7 muizen in een kamer en zet het O2 niveau op 75%. Bewaar de muizen 5 dagen in de kamer, tot P12. Vermijd het openen van de kamer tijdens de hyperoxia inductie. Controleer de gasdruk van de O2 cilinder en vervang de cilinder indien nodig. Houd de dieren in de gaten tijdens de inductie.</li>
	<li>Haal de muizenkooien uit de kamer en weeg alle pups. Groepeer de pups op basis van het gewicht zodat elke experimentele groep een vergelijkbare gewichtsverdeling heeft bij pups.</li>
</ol>2. Proefdieren en rat OIR model inductie (met behulp van semi-gesloten systeem)
OPMERKING: Gebruik tijdge gepaarde dieren om de pups op dezelfde dag geboren te krijgen. Gebruik voor rat OIR een grotere nestgrootte, ongeveer 18 pups/moeder, om voldoende NV inductie in het rattenmodel te verkrijgen. Zwembadjongen uit verschillende nesten om voldoende pups voor elk nest te krijgen.
<ol><li>Noteer het gewicht van de dieren voor en na inductie en op het moment van offeren.</li>
	<li>Zorg ervoor dat er voldoende voedsel op de bodem van de kooi ligt, zodat de dammen gemakkelijk toegang hebben tot voedsel.</li>
	<li>Voeg sodakalk met kleurindicator toe aan de onderkant van de kamer om overtollige CO2 op te nemen wanneer het filtratiesysteem niet wordt gebruikt.</li>
	<li>Controleer de luchtvochtigheid en temperatuur in de kamer. Absorbeer extra vochtigheid (gegenereerd door meerdere ratten) door silicagel aan de onderkant van de kamer toe te voegen.</li>
	<li>Kalibreer de O2 sensor met 100% N2 en normale kamerlucht.</li>
	<li>Plaats de ratten in de kamer bij P0 (enkele uren na de geboorte). Stel het O2-niveau in op 50% en sluit de O2-cilinder 24 uur aan op de kamer. Schakel daarna de instellingen in op 10% O2 en sluit de stikstoffles (N2) gedurende 24 uur aan op de kamer. Ga 14 dagen door met fietsen tussen 50% en 10% O2.</li>
	<li>Monitor het gasverbruik en het welzijn van de dieren tijdens het onderzoek. Open de kamer tijdens de wissel tussen 50/10% O2 en voeg indien nodig meer voedsel en water toe. Verander de kooien van de dieren om de kooien tijdens de inductie schoon te maken.</li>
	<li>Haal de rattenkooien uit de kamer en weeg alle pups. Groepeer de pups op basis van het gewicht zodat elke experimentele groep een vergelijkbare gewichtsverdeling heeft in de pups.</li>
</ol>3. Toediening van geneesmiddelen (optioneel)
OPMERKING: Veelgebruikte toedieningsroute van geneesmiddelen in OIR is via intravitreale behandeling (ivt), op P12-P14 voor muizen en op P14 voor ratten. Bepaal de behandeldag op basis van de experimentele opstelling. Wanneer meerdere nesten pups in experimenten worden gebruikt, verdeel dan de behandelingsgroepen om dieren van alle nesten te hebben. Injecteer het medicijn bij voorkeur in slechts één oog en houd het contralaterale oog als controle.
<ol><li>Weeg de dieren af en maak identificatiemarkeringen op de staart en/of het oor.</li>
	<li>Verdoof het dier met injecteerbare anesthesie (bijvoorbeeld mengsel van ketamine en medetomidine, 30 mg/kg en 0,4 mg/kg voor muizen) of met inhalatie-anesthesie (isofluraan bij 2-3,5% isofluraan en 200-350 ml/min luchtstroom). Controleer de diepte van de anesthesie door in de tenen te knijpen. Houd het dier tijdens de behandeling op een verwarmingskussen.</li>
	<li>Breng voor lokale anesthesie een druppel pijnstiller aan op het ooglid. Open het ooglid voorzichtig met een tang voordat u het ivt uitvoert, terwijl muizen en ratten hun ogen openen rond P14. Breng een druppel pijnstillend (bijv. oxybuprocaïnehydrochloride) aan op het hoornvlies.</li>
	<li>Breng een druppel jodium aan voordat u de ivt-injectie uitvoert.</li>
	<li>Gebruik voor de ivt-injectie een glazen spuit waaraan een naald van 33-34 G is bevestigd. Druk de oogleden naar beneden en grijp de oogbol met een tang. Maak de injectie posterieure naar de limbus, ongeveer in 45° hoek naald wijzend naar oogzenuw.</li>
	<li>Vermijd het injecteren van meer dan 1,0 μL in de intravitreale ruimte. Houd de naald 30 s op zijn plaats na het injecteren van het medicijn om reflux van de geïnjecteerde oplossing te voorkomen.</li>
	<li>Onderzoek het oog (bijv. met een oogheelkunde) op eventuele complicaties, zoals bloedingen of netvliesbeschadiging, na het verwijderen van de naald. Breng na de injectie antibioticazalf aan op het hoornvlies. OPMERKING: Het ivt-injectievolume voor muizen moet 0,5 – 1,0 μL zijn.</li>
	<li>Draai de anesthesie om (bijvoorbeeld met een α2-antagonist voor medetomidine (2,5 mg/kg) en breng de pup terug naar de kooi. Huis het nest normaal tot het einde van het onderzoek.</li>
</ol>4. In vivo beeldvorming en elektroretinografie (optioneel)
<ol><li>Voer indien gewenst in vivo beeldvorming uit op levende dieren tijdens de follow-upperiode om veranderingen vast te leggen die zich in het netvlies ontwikkelen tijdens de angiogene reacties. Voer bijvoorbeeld fluoresceïne-angiografie (FA) uit of scan laserconfocale microscopie19 om de vasculatuur te visualiseren (figuur 4). Gebruik spectrale domein optische coherentietomografie (SD-OCT) om netvlieslagen in vivo te visualiseren (figuur 4).</li>
	<li>Onderzoek indien gewenst functionele veranderingen in verschillende netvliescelpopulaties na OIR-inductie met behulp van elektroretinografie (ERG) (figuur 5).</li>
</ol>5. Weefselverzameling en voorbereiding van retinale vlakke mounts
OPMERKING: Verzamel de weefsels volgens de gewenste onderzoekshypothese. Verzamel voor muizen de monsters bijvoorbeeld bij P12 (om vaso-vernietiging na de hyperoxische fase te bestuderen) of tijdens de hypoxische periode (P13-P17). Verzamel de muis OIR-monsters op P17, het meest voorkomende tijdspunt voor bemonstering, om de piek in NV-hoeveelheid te detecteren. Verzamel bij rat OIR de monsters op P18-P21 om de hoogste hoeveelheid NV in acht te nemen (figuur 3).
<ol><li>Weeg de dieren af voordat u bemonstert.</li>
	<li>Om de retinale vasculatuur te labelen, kunnen diep verdoofde dieren transcardieel worden doordrenkt met FITC-dextran. (Als alternatief, beits de retinale platte mounts met Isolectin later).</li>
	<li>Offer de dieren op met een overdosis anesthesiemedicijnen (bijvoorbeeld een mengsel van ketamine en medetomidine, 300 mg/kg en 4 mg/kg voor muizen) of CO 2-inademing.</li>
	<li>Verzamel de ogen van de dieren door met gebogen tang achter de oogbol te grijpen, het weefsel rond de ogen te snijden en het oog uit de baan te tillen.</li>
	<li>Incubeer de oogbollen in vers gemaakte, gefilterde 4% paraformaldehyde (in fosfaatgebufferde zoutoplossing, PBS) gedurende 1-4 uur. Verwijder het fixatief en was de oogbollen 3 x 10 min met PBS. Ontleed het netvlies onmiddellijk of bewaar ze in PBS bij +4 °C. LET OP: Paraformaldehyde is giftig bij inademing, in contact met de huid en bij inslikken. Lees het veiligheidsinformatieblad voordat u ermee werkt. OPMERKING: Oefen geen druk uit op de oogbol tijdens de bemonstering of een fase van de weefselverwerking om netvliesloslating te voorkomen, als doorsnedes van hele oogbollen worden gedaan.</li>
	<li>Bereid retinale vlakke mounts voor om de hoeveelheid NV en de grootte van ACA's te kwantificeren. U kunt ook de oogbollen/netvliezen verwerken voor histologie, of RNA- of eiwitanalyse. Ontleed het netvlies onder een stereomicroscoop met behulp van een microschaar en een tang.<ol>
<li>Plaats de oogbol in PBS om deze vochtig te houden en prik de oogbol bij limbus door met een naald (23G) en snijd rond limbus met een gebogen microschaar om iris en het hoornvlies te verwijderen.</li>
		<li>Plaats voorzichtig de punt van de schaar tussen sclera en netvlies en snijd sclera naar de oogzenuw. Doe hetzelfde aan de andere kant van de oogbol en snijd/scheur de sclera voorzichtig totdat de netvliesbeker wordt blootgesteld. Trek de lens uit de netvliesbeker en voeg PBS toe aan de beker.</li>
		<li>Verwijder alle hyaloïde vaten, glasvocht en vuil zonder het netvlies te beschadigen. Was het netvlies door PBS aan de retinale beker toe te voegen. Voer vier incisies uit (op 12, 3, 6 en 9 uur) op het netvlies met een rechte microschaar om een bloemachtige structuur te maken. Maak optioneel de sneden met chirurgisch mes voordat u de monsters monteert. Til het netvlies op met een zachte penseel op een putplaat voor vlekken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Label de retinale vasculatuur met Isolectine B4 die het oppervlak van endotheelcellen bevlekt (als de dieren niet doordrenkt waren met FITC-dextran). Incubeer het netvlies in blokkerende buffer (10% NGS + 0,5% Triton in TBS) gedurende 1 uur en was met 1% NGS + 0,1% Triton in TBS gedurende 10 minuten. Incubeer het netvlies met fluorescerende kleurstof geconjugeerd Isolectine B4 (5-10μg/ml) in 1% NGS + 0,1% Triton in TBS 's nachts bij +4 °C terwijl beschermd tegen het licht. OPMERKING: Label indien gewenst andere cellen zoals ontstekingscellen en pericyten met behulp van specifieke antilichamen.</li>
	<li>Was het netvlies 3x gedurende 10 minuten met 1% NGS + 0,1% Triton in TBS en til het netvlies op een microscopische dia, binnenste netvlies naar boven gericht. Spreid het netvlies voorzichtig uit met een zachte penseel en verwijder eventuele resterende hyaloïde vaten of vuil. Voeg het montagemedium toe aan een afdekslip en plaats het op het netvlies. Bewaar het netvlies bij +4 °C en bescherm tegen licht.</li>
</ol>6. Analyse van de vlakke bevestigingen
<ol><li>Maak foto's van de retinale platte mounts met behulp van een fluorescentiemicroscoop met 10x objectief. Focus op de oppervlakkige vasculaire plexus en op de preretinaale neovascularisatie. Maak een tegelscanafbeelding om het hele netvlies vast te leggen en de tegelscans samen te voegen</li>
	<li>Kwantificeer de beelden door de APA's, het gebied van NV en het totale netvliesgebied te meten met behulp van een beeldverwerkingsprogramma (zie Tabel met materialen).<ol>
<li>Teken de APA's en het totale netvliesgebied met behulp van een vrije hand tekengereedschap en selecteer de neovasculaire gebieden met behulp van een selectiegereedschap. De software meet de gebieden die van belang zijn voor pixels, en de AVA- en NV-gebieden (uitgedrukt in pixels) kunnen worden gebruikt om hun percentage te berekenen in verhouding tot het totale netvliesgebied. Ook zijn er enkele softwaretools beschikbaar voor het kwantificeren van NV. OPMERKING: Onlangs zijn een open-source, volledig geautomatiseerde programma's voor de kwantificering van kernwaarden van OIR-beelden met behulp van deep learning neurale netwerken geïntroduceerd en bieden een betrouwbaar hulpmiddel voor reproduceerbare kwantificering van retinale AVA en NV (bijv. https://github.com/uw-biomedical-ml/oir/tree/bf75f9346064f1425b8b9408ab792b1531a86c64)20,21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als antilichamen worden gebruikt voor immunohistochemische detectie van individuele celpopulaties, kwantificeer dan het aantal bevlekte cellen (zoals microglia, figuur 2B)van de retinale platte mounts met de hand of door geautomatiseerde beeldanalysesystemen indien gewenst.</li>
</ol>7. Statistieken
<ol><li>Analyseer normaal gedistribueerde gegevens per Student's t-test of One-Way ANOVA, gevolgd door dunnett's of Tukey's multiple comparisons test, indien van toepassing. Gebruik niet-parametrische tests zoals Mann-Whitney U-test of Kruskal Wallis-test voor niet-normaal gedistribueerde gegevens. Beschouw verschillen statistisch significant op P < 0,05 niveau.</li>
</ol>

De auteurs Maria Vähätupa, PhD, Niina Jääskeläinen, Marc Cerrada-Gimenez, PhD en Rubina Thapa zijn werknemers van Experimentica Ltd.
De auteur Giedrius Kalesnykas, PhD, is een werknemer (President en Chief Executive Officer) en aandeelhouder van Experimentica Ltd. die contractonderzoeksdiensten aanbiedt met behulp van preklinische OIR-modellen die in dit artikel worden gebruikt.
Tero Järvinen, M.D., PhD, en Hannele Uusitalo-Järvinen, M.D., PhD, hebben niets te onthullen.

De ernst van het fenotype van de ziekte is afhankelijk van zowel de stam als zelfs de leverancier in zowel muis- als rat OIR-modellen23. Dit suggereert dat er een brede genotypische variabiliteit is in de pathologieontwikkeling. Over het algemeen ontwikkelen gepigmenteerde knaagdieren een ernstiger fenotype dan de albino knaagdieren. Bijvoorbeeld, de retinale vasculatuur van albino BALB/c revasculariseert snel na hyperoxia en ontwikkelt NV helemaal niet24. Evenzo vertonen g...

Betrouwbare en reproduceerbare experimentele modellen zijn nodig om de pathologie achter angiogene oogziekten te bestuderen en nieuwe therapieën voor deze verwoestende ziekten te ontwikkelen. Pathologische angiogenese is het kenmerk voor natte leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD) en voor veel ischemische netvliesaandoeningen waaronder retinopathie van prematuriteit (ROP), proliferatieve diabetische retinopathie (PDR) en retinale ader occlusie (RVO)1,2,3,4. Menselijke en knaagdier retina's volgen een vergelijkbaar patroon van ontwikkeling, omdat zowel menselijk als knaagdier netvlies behoren tot de laatste weefsels die vasculair zijn. Voordat het netvlies vasculatuur zich volledig heeft ontwikkeld, ontvangt het netvlies zijn nutriëntentoevoer uit hyaloïde vasculatuur, dat op zijn beurt regresseert wanneer het netvlies vasculatuur begint te ontwikkelen1,2. Bij menselijke, retinale vasculaire ontwikkeling wordt voltooid vóór de geboorte, terwijl bij knaagdieren de groei van retinale vasculatuur optreedt na de geboorte. Aangezien de vasculaire ontwikkeling van het netvlies postnataal plaatsvindt bij knaagdieren, biedt het een ideaal modelsysteem om de angiogenese2,3 tebestuderen. De pasgeboren knaagdieren hebben een avasculaire retina die zich geleidelijk ontwikkelt totdat volledige vasculaire netvliesontwikkeling wordt bereikt tegen het einde van derde postnatale week4. De groeiende bloedvaten van neonatale muis zijn plastic en ondergaan regressie tijdens hyperoxia stimulus5.
ROP is de belangrijkste oorzaak voor kinderblindheid in westerse landen, omdat het bijna 70% van de premature zuigelingen met geboortegewicht onder 1.250 g6,7treft. ROP komt voor bij premature zuigelingen die worden geboren voordat netvliesvaten hun normale groei voltooien. ROP vordert in twee fasen: in fase I vertraagt vroeggeboorte de vasculaire groei van het netvlies, waarbij na fase II de onvoltooide vascularisatie van het zich ontwikkelende netvlies hypoxie veroorzaakt, wat de expressie van angiogene groeifactoren induceert die nieuwe en abnormale bloedvatgroei stimuleren8. Het OIR-model is een veelgebruikt model geweest om de pathofysiologie van ROP en andere ischemische retinopathieën te bestuderen en om nieuwe medicijnkandidaten te testen2,3,9. Het wordt algemeen beschouwd als een reproduceerbaar model voor het uitvoeren van proof-of-concept studies voor potentiële antiangiogene geneesmiddelen voor oog- en niet-oculaire ziekten. De twee knaagdiermodellen, d.w.z. muis en rat OIR verschillen in hun modelinductie en ziektefenotype. Het rattenmodel bootst het ROP-fenotype nauwkeuriger na, maar het muismodel biedt een robuuster, sneller en reproduceerbaarder model voor retinale neovascularisatie (NV). In het muismodel ontwikkelt NV zich tot het centrale netvlies. Deze pathologische uitlezing is belangrijk in farmacologische werkzaamheidsstudies voor veel ischemische retinopathieën, zoals PDR, RV en exsudatieve AMD, evenals voor niet-oculaire, angiogene ziekten zoals kanker. Bovendien maakt de beschikbaarheid van genetisch gemanipuleerde (transgene en knock-out) muizen het muis OIR-model een populairdere optie. Noch muis noch rat OIR model creëert echter retinale fibrose, wat typisch is bij menselijke ziekten.
Het inzicht dat hoge zuurstofniveaus bijdragen aan de ontwikkeling van ROP in de jaren 195010,11 leidde tot de ontwikkeling van diermodellen. De eerste studies over het effect van zuurstof op retinale vasculatuur werden gedaan in 195012,13,14 en tot de jaren 1990 waren er veel verfijningen aan het OIR-model. Het onderzoek van Smith et al. in 1994 zette een standaard voor het huidige muis OIR-model dat hyaloidopathie scheidt van retinopathie15. Een brede goedkeuring van de methode om vaso-vernietiging en pathologische NV door Connor et al. (2009) te kwantificeren verhoogde zijn populariteit verder16. In dit model worden muizen gedurende 5 dagen op 75% zuurstof (O2)geplaatst op P7, gevolgd door 5 dagen in normoxische omstandigheden. Hyperoxia van P7 tot P12 zorgt ervoor dat retinale vasculatuur teruggaat in het centrale netvlies. Bij terugkeer naar normoxische aandoeningen wordt het avasculaire netvlies hypoxisch (figuur 1A). Als gevolg van de hypoxische stimuli van het avasculaire centrale netvlies, ontspruiten sommige van de retinale bloedvaten naar het glasvocht en vormen preretinale NV, preretinale plukjes2,3genoemd . Deze plukjes zijn onvolwassen en hyperpermeabel. De hoeveelheid NV piekt op P17, waarna deze achteruitgaat. Het netvlies is volledig gerevasculariseerd en NV wordt volledig geregresseerd door P23 - P25 (figuur 2A)2,3.
Het rat OIR-model (met verschillende niveaus van O2) werd voor het eerst beschreven in de jaren 1990 waaruit bleek dat verschillende O2-niveaus bij 80% en 40% meer uitgesproken NV veroorzaken dan onder 80% O2 constante blootstelling17. Later werd ontdekt dat het intermitterende hypoxiemodel, waarbij O2 wordt gefietst uit hyperoxia (50%) hypoxie (10-12 %), veroorzaakt nog meer NV dan de 80/40% O2 model18. In het 50/10% model worden rattenjongen gedurende 24 uur blootgesteld aan 50%, gevolgd door 24 uur in 10% O2. Deze cycli worden voortgezet tot P14, wanneer de ratjongen worden teruggebracht naar normoxische omstandigheden (figuur 1B). Net als bij menselijke ROP-patiënten ontwikkelen zich in het rattenmodel de avasculaire gebieden tot aan de periferie van het netvlies als gevolg van onrijpe retinale vasculaire plexus (figuur 3).
In beide modellen zijn de belangrijkste parameters die meestal worden gekwantificeerd de grootte van AVA en NV. Deze parameters worden meestal geanalyseerd vanaf retinale platte mounts waarbij de endotheelcellen het label4,16 krijgen. Voorheen werd de hoeveelheid preretinale NV geëvalueerd aan de hand van retinale dwarsdoorsneden door het tellen van bloedvaten of vasculaire celkernen die zich uitstrekken tot glasvocht boven het binnenste beperkende membraan. De belangrijkste beperking van deze aanpak is dat het niet mogelijk is om de APA's te kwantificeren.

<table><tbody><tr><td>33 gauge, Small Hub RN Needle</td><td>Hamilton Company</td><td>7803-05, 10mm, 25&deg;, PS4</td><td>Voor intravitreale injectie</td></tr><tr><td>Adobe Photoshop</td><td>Adobe Inc.</td><td></td><td>Voor beeldanalyse</td></tr><tr><td>Air pump air100</td><td>Eheim GmbH &amp; Co. KG.</td><td>143207</td><td>Voor inhalatieanesthesie</td></tr><tr><td>Anaesthesia unit 410 AP</td><td>Univentor Ltd.</td><td>2360309</td><td>Voor inhalatieanesthesie</td></tr><tr><td>AnalaR NORMAPUR Soda lime</td><td>VWR International Ltd</td><td>22666.362</td><td>Voor CO2-controle tijdens modelinductie</td></tr><tr><td>Attane Vet 1000 mg/g</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 17 05 79</td><td>Voor inhalatieanesthesie</td></tr><tr><td>Borstel</td><td></td><td></td><td>Voor voorbereiding van vlakke montages</td></tr><tr><td>Koolstofdioxidegas</td><td></td><td></td><td>Voor het opofferen</td></tr><tr><td>Celeris D430 ERG systeem</td><td>Diagnosys LLC</td><td>121</td><td>Voor in vivo ERG</td></tr><tr><td>Celcultuurschotels</td><td>Greiner Bio-One International GmbH</td><td>664 160</td><td>Voor voorbereiding van vlakke montages</td></tr><tr><td>Cepetor Vet 1 mg/mL</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 08 78 96</td><td>Voor anesthesie</td></tr><tr><td>Dekglasjes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15165452</td><td>Voor voorbereiding van vlakke montages</td></tr><tr><td>O2 Gecontroleerde InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System en ontvochtiger</td><td>Coy Laboratory Products</td><td></td><td>Gesloten systeem voor ziektemodelinductie, optioneel voor semi-gesloten systeem</td></tr><tr><td>E702 O2 sensor</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>E207, 1801901</td><td>Voor zuurstofniveaumeting</td></tr><tr><td>Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)</td><td>Bioptigen, Inc.</td><td>BPN000668</td><td>Voor in vivo beeldvorming</td></tr><tr><td>Oogspeertjes</td><td>Beaver-Visitec International, Inc.</td><td>0008685</td><td>Voor intravitreale injectie en in vivo beeldvorming</td></tr><tr><td>Flexilux 600LL Koud lichtbron</td><td>Mikron</td><td>11140</td><td>Voor intravitreale injectie of weefselverzameling</td></tr><tr><td>Fluoresceïne natriumzout</td><td>Merck KGaA</td><td>F6377-100G</td><td>Voor in vivo beeldvorming</td></tr><tr><td>Gasafvoereenheid (+Dubbele 3-weg klep, muis- en ratgezichtsmaskers, UNOsorb filter)</td><td>UNO Roestvaststaal BV</td><td>GEX 17015249</td><td>Voor inhalatieanesthesie</td></tr><tr><td>Glasinjectiespuit, Model 65 RN</td><td>Hamilton Company</td><td>7633-01</td><td>Voor intravitreale injectie</td></tr><tr><td>HRA2 Retina angiograph (FA)</td><td>Heidelberg Engineering GmbH</td><td>Spec-KT-05488</td><td>Voor in vivo beeldvorming</td></tr><tr><td>Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>I21411</td><td>Voor het labelen van retinale vasculatuur op vlakke montages</td></tr><tr><td>Ketaminol Vet 50 mg/mL</td><td>Intervet International B.V.</td><td>vnr 51 14 85</td><td>Voor anesthesie</td></tr><tr><td>Medicinale zuurstofgas</td><td></td><td></td><td>Voor ziektemodelinductie</td></tr><tr><td>Muizen C57BL/6JRj</td><td>Janvier Labs</td><td></td><td>Ook andere stammen mogelijk</td></tr><tr><td>Microscoopglazen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>Voor voorbereiding van vlakke montages</td></tr><tr><td>Minims Povidone Jodide 5% (eenheid)</td><td>Bausch &amp; Lomb U.K Limited</td><td>vnr 24 11 304</td><td>Voor intravitreale injectie</td></tr><tr><td>Stikstofgas</td><td></td><td></td><td>Voor ziektemodelinductie (rat)</td></tr><tr><td>Oftan Chlora 10 mg/g</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 01 11</td><td>Voor intravitreale injectie</td></tr><tr><td>Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 03 43</td><td>Voor in vivo ERG</td></tr><tr><td>Oftan Obucain 4 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 55 03 50</td><td>Voor intravitreale injectie</td></tr><tr><td>Oftan Tropicamid 5 mg/ml</td><td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>vnr 04 12 36</td><td>Voor in vivo beeldvorming</td></tr><tr><td>ProOx Model 110 O2 controller en dierenkamer</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>803</td><td>Voor ziektemodelinductie, semi-gesloten systeem, optioneel voor gesloten systeem</td></tr><tr><td>ProOx Model P360 O2 controller en dierenkamer</td><td>BioSphenix, Ltd.</td><td>538</td><td>Voor ziektemodelinductie, semi-gesloten systeem, optioneel voor gesloten systeem</td></tr><tr><td>Ratten CD(SD)</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Ook andere stammen mogelijk</td></tr><tr><td>Revertor 5 mg/mL</td><td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td><td>vnr 13 04 97</td><td>Voor anesthesie-ophoging</td></tr><tr><td>Silicagel</td><td></td><td></td><td>Voor vochtopslag tijdens modelinductie</td></tr><tr><td>Systane Ultra 10ml</td><td>Alcon</td><td>Tamro 2050250</td><td>Voor hydratatie van het oog</td></tr><tr><td>Systane Ultra unit 0.7ml</td><td>Alcon</td><td>Tamro 2064871</td><td>Voor hydratatie van het oog</td></tr><tr><td>Transferpijpje</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1343-9108</td><td>Voor voorbereiding van vlakke montages</td></tr><tr><td>VENTI-Line VL 180 PRIME Droogoven</td><td>VWR</td><td>VL180S 170301</td><td>Voor het drogen van silicagel</td></tr><tr><td>VisiScope SZT350 Stereomicroscoop</td><td>VWR</td><td>481067</td><td>Voor intravitreale injectie of weefselverzameling</td></tr></tbody></table>

zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Een van de meest gebruikte modellen voor ischemische retinopathieën is het zuurstofgeïnduceerde retinopathie (OIR) model. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen voor de OIR-modelinductie en de uitlezingen ervan bij zowel muizen als ratten. Retinale neovascularisatie wordt geïnduceerd in OIR door knaagdierjongen bloot te stellen aan hyperoxia (muizen) of afwisselende niveaus van hyperoxia en hypoxie (ratten). De primaire uitlezingen van deze modellen zijn de grootte van neovasculaire (NV) en avasculaire (AVA) gebieden in het netvlies. Dit preklinische in vivo model kan worden gebruikt om de werkzaamheid van potentiële anti-angiogene geneesmiddelen te evalueren of om de rol van specifieke genen in de retinale angiogenese aan te pakken met behulp van genetisch gemanipuleerde dieren. Het model heeft enige spannings- en leveranciersspecifieke variatie in de OIR-inductie waarmee rekening moet worden gehouden bij het ontwerpen van de experimenten.

Het belangrijkste resultaat van het model is het vasculaire fenotype: de grootte van ACA's en de hoeveelheid NV. In het muis OIR-model vindt de vaso-vernietiging plaats in het centrale netvlies (figuur 2A), terwijl het zich in het rattenmodel ontwikkelt in de periferie, d.w.z. vergelijkbaar met het menselijke ROP22 (figuur 3A). Dit komt omdat de oppervlakkige vasculaire plexus zich al heeft ontwikkeld wanneer muizen worden blootgesteld aa...

Zuurstofgeïnduceerde retinopathie (OIR) kan worden gebruikt om ischemische netvliesaandoeningen zoals retinopathie van prematuriteit en proliferatieve diabetische retinopathie te modelleren en om te dienen als model voor proof-of-concept studies bij het evalueren van antiangiogene geneesmiddelen voor neovasculaire ziekten. OIR induceert robuuste en reproduceerbare neovascularisatie in het netvlies die kan worden gekwantificeerd.

Zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Na de ontwikkeling is het door zuurstof geïnduceerde model voor de retinopathie op grote schaal gebruikt in preklinische studies van neovasculaire retinale aandoeningen. Het is gebruikt als model om pathologische angiogenesis in reactie op hypoxie te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van dit model is dat het een robuuste neurovasculaire reactie induceert die reproduceerbaar en gemakkelijk te kwantificeren is.Dit model kan worden gebruikt als een preklinisch model voor het bestuderen van de effecten van mogelijke therapeutische kandidaten. Het wordt beschouwd als een relevant model voor verschillende menselijke ziekten, zoals prematuriteitsretinopathie, diabetische retinopathie en natte leeftijdsgebonden maculaire degeneratie. Noteer het gewicht van de dieren voor en na de hypoxie-inductie en op het moment van het offeren.Zorg ervoor dat er voldoende voedsel op de bodem van de kooi ligt en voeg soda-kalk met kleurindicator toe aan de bodem van de kamer om overtollig kooldioxide te absorberen wanneer er geen filtersysteem wordt gebruikt. Bewaak de luchtvochtigheid en temperatuur in de kamer, houd de luchtvochtigheid tussen 40 en 65%Als nodig, verhoog de luchtvochtigheid van de kamer door schalen met water op de bodem te plaatsen. Kalibreer de zuurstofsensor met normale kamerlucht en 100%zuurstof.Plaats vervolgens de P7 muizen in een kamer en stel het zuurstofniveau in op 75%Houd de muizen vijf dagen in de kamer tot P12, terwijl de dieren worden gemonitord tijdens de inductie. Wanneer u klaar bent, verwijdert u de muizen uit de kamer. Weeg de dieren en maak identificatiemerken op de staart of oor.Nadat het dier is verdoofd, voert u een teenprik uit. Een kleine reflex is acceptabel. Houd het dier op een verwarmingskussen tijdens de behandeling.Gebruik een glazen spuit met een 33 tot 34 gauge naald voor de IVT-injectie. Breng een druppel jodium aan, druk vervolgens het ooglid naar beneden en pak het oog met een pincet vast. Maak de injectie achter de limbus, ongeveer onder een hoek van 45 graden gericht op de oogzenuw.Houd de naald 30 seconden op zijn plaats na het injecteren van het medicijn om reflux van de geïnjecteerde oplossing te voorkomen. Onderzoek het oog op eventuele complicaties zoals bloedingen of retinale schade na het verwijderen van de naald. Breng na de injectie antibioticumzalf aan op het oog.Indien gewenst, voer in vivo beeldvorming uit op levende dieren tijdens de opvolgingsperiode om veranderingen die zich in het netvlies ontwikkelen tijdens de angiogene reacties vast te leggen. Gebruik spectral domain optische coherentietomografie om retinale lagen in vivo te visualiseren. Verzamel de ogen van de dieren door het weefsel rond het oog te snijden, achter het oog met gekromde pincet vast te grijpen en het oog uit de baan te tillen.Incubeer de oogbollen in vers gemaakte gefilterde 4%paraformaldehyde gedurende één tot vier uur. Verwijder het fixeermiddel en was de oogbollen drie keer met PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Ontdoe de retina's onmiddellijk van de oogbollen of bewaar ze in PBS bij vier graden Celsius.Bereid retinale platte montages voor om de hoeveelheid neovascularisatie en de grootte van avasculaire gebieden of AVA's te kwantificeren. Ontdoe de retina onder een stereomicroscoop met behulp van microschaar en pincet. Plaats het oogbol in PBS om het vochtig te houden en prik het bij de limbus met een 23 gauge naald, snijd vervolgens rond de limbus met gekromde microschaar om de iris en de cornea te verwijderen.Plaats voorzichtig de punt van de schaar tussen RPE en neurale retina en snijd het RPE choroïde sclera complex richting de oogzenuw. Doe hetzelfde aan de andere kant van het oogbol. Snijd vervolgens voorzichtig of scheur het weefsel totdat het retinale kopje is blootgelegd.Trek de lens uit het retinale kopje en voeg PBS toe aan het kopje. Verwijder alle hyalogeenvaten, vitreus en puin zonder het netvlies te beschadigen. Maak vier sneden in het netvlies met rechte microschaar om een ​​bloemvormige structuur te creëren.Gebruik een zachte verfkwast of een overdrachtspipet om het naar een putplaat voor kleuring over te brengen. Label het retinale vaatstelsel met isolectine B4 die het oppervlak van endotheelcellen kleurt. Incubeer de retina's in blokkeerbuffer gedurende één uur en was ze met 1%NGS en 0,1%Triton in TBS gedurende 10 minuten.Incubeer de retina's met 5 tot 10 microgram per milliliter fluorescent geconjugeerd isolectine B4 's nachts bij vier graden Celsius terwijl ze worden beschermd tegen licht. Was de retina's de volgende dag drie keer met 1%NGS en 0,1%Triton in TBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Plaats de retina's op een microscoopglaasje met de binnenkant van het netvlies naar boven.Vervolgens spreidt u het netvlies voorzichtig uit met een zachte verfkwast en verwijdert u eventuele resterende hyalogeenvaten of puin. Voeg montagemedium toe bovenop het monster en plaats een dekglas bovenop de plaat. Bewaar de retina's bij vier graden Celsius beschermd tegen licht.Beeld de retinale platte montages af met behulp van een fluorescentiemicroscoop met een 10X objectief. Focus op het oppervlakkige vasculaire plexus en de preretinale neovascularisatie. Maak een tegelscan-afbeelding om het hele netvlies vast te leggen en voeg de tegelscans samen.Kwantificeer de afbeeldingen door de AVA's, het gebied van neovascularisatie en het totale retinale gebied te meten met behulp van een beeldverwerkingsprogramma. Teken de AVA's en het totale retinale gebied met behulp van een vrijhandtekening en selecteer de neovasculaire gebieden met behulp van een selectietool. In het muismodel voor zuurstof-geïnduceerde retinopathie vindt vaso-obliteratoring plaats in het centrale netvlies.Terwijl in het rattenmodel, ontwikkelt het zich in de periferie, vergelijkbaar met menselijke ROP. Preretinale neovascularisatie ontwikkelt zich nabij

oxygen-induced-retinopathy-model-for-ischemic-retinal-diseases

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Het knaagdier netvlies is lang erkend als een toegankelijke venster naar de hersenen. In dit technisch document bieden we een protocol dat het muismodel van zuurstof geïnduceerde retinopathie van de mechanismen die leiden tot het falen van vasculaire regeneratie binnen het centrale zenuwstelsel na ischemische schade te bestuderen in dienst heeft. Het beschreven systeem kan ook worden ingezet om strategieën te ontwikkelen om hergroei van functionele bloedvaten te bevorderen binnen het netvlies...

Beoordeling van de Vasculaire Regeneratie in het CZS met de muis Retina

Het doel van dit protocol is ischemische letsel fotochemisch ertoe te bewegen de achterste oogzenuw in de rat. Dit model is kritisch voor onderzoek van de pathofysiologie van posterieure ischemische optische neuropathie, en therapeutische toepassingen voor deze en andere optische neuropathieën, evenals andere CNS ischemische ziekten.

Rat model van fotochemisch geïnduceerde posterior ischemische optische neuropathie

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor het induceren van retinale ischemie-reperfusieschade door verhoogde intraoculaire druk bij muizen. Retinale ischemie-reperfusieschade door verhoogde intraoculaire druk dient om menselijke pathologieën gekenmerkt door gecompromitteerd zuurstof en van voedingsstoffen in het netvlies model, waardoor onderzoekers potentiële cellulaire mechanismen en therapieën voor menselijke ziekten van het netvlies neurovasculaire eenheid onderzocht.

Een muismodel van retinale ischemie-reperfusie letsel door misbruik van intra-oculaire druk

Hier beschrijven we het gebruik van spectrale optische coherentietomografie (SD-OCT) om retinale en oculaire structuren in vivo te visualiseren in modellen van retinale degeneratie, glaucoom, diabetische retinopathie en bijziendheid.

In vivo structurele beoordelingen van oogziekten in knaagdiermodellen met behulp van optische coherentietomografie

Hier beschrijven we een muismodel van retinale ischemie door voorbijgaande bilaterale gemeenschappelijke halsslagader occlusie met behulp van eenvoudige hechtingen en een klem. Dit model kan nuttig zijn voor het begrijpen van de pathologische mechanismen van retinale ischemie veroorzaakt door cardiovasculaire afwijkingen.

Een Murine-model van ischemisch netvliesletsel veroorzaakt door voorbijgaande bilaterale gemeenschappelijke halsslagader Occlusie

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de bereiding en immunofluorescentiekleuring van retinale flat mounts en analyse van muizen. Het gebruik van fluoresceïne fundusangiografie (FFA) voor muizenpups en beeldverwerking worden ook in detail beschreven.

Monitoring van dynamische groei van retinale vaten in zuurstof-geïnduceerde retinopathie muismodel

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor retinale ader occlusie met behulp van rose bengal en een lasergeleid retinaal beeldvormingscoopsysteem met aanbevelingen om de reproduceerbaarheid ervan in genetisch gemodificeerde stammen te maximaliseren.

Optimalisatie van het Retinal Vein Occlusion Mouse Model om variabiliteit te beperken

Dit artikel beschrijft een gevestigde en reproduceerbare lectinevlekkentest voor de gehele retinale preparaten van mount en de protocollen die nodig zijn voor de kwantitatieve meting van vasculaire parameters die vaak worden gewijzigd in proliferatieve en niet-proliferatieve retinopathieën.

Kwantificering van vasculaire parameters in whole mount retinas van muizen met niet-proliferatieve en proliferatieve retinopathieën

Hier presenteren we drie data-analyseprotocollen voor fluoresceïneangiografie (FA) en optische coherentietomografie (OCT) beelden in de studie van Retinal Vein Occlusion (RVO).

In vivo Vasculaire letseluitlezingen in het netvlies van muizen om de reproduceerbaarheid te bevorderen

Dit protocol modelleert retinale ischemie-reperfusieschade in een muizenoog door retinale ischemie te induceren via canulatie van de voorste kamer en intraoculaire drukverhoging, gevolgd door intraoculaire druknormalisatie om de reperfusie te starten.

Inductie van retinale ischemie-reperfusieschade in een muisoogmodel

Leer het zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren. Deze methode simuleert pathologische angiogenese door hypoxie en biedt een reproduceerbare neurovasculaire respons voor preklinisch onderzoek.

Zuurstofgeïnduceerde retinopathiemodel voor ischemische netvliesziekten bij knaagdieren

Meer video's verkennen