Immunohistochemische technieken om cellulaire proliferatie en neurogenese bij ratten te analyseren met behulp van de Thymidine Analog BrdU
9 september 2020
Dit artikel presenteert vier van de meest voorkomende technieken voor het visualiseren van BrdU-positieve cellen om volwassen neurogenese bij ratten te meten. Dit werk omvat instructies voor reagenspreparaatatie, thymidine-analoge toediening, transcardiale perfusie, weefselvoorbereiding, peroxidase immunohistochemische reactie, immunofluorescentie, signaalversterking, counterstaining, microscopiebeeldvorming en celanalyse.
Dit is een belangrijk protocol in het veld van Adult Neurogenesis. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van de stappen die nodig zijn om een succesvolle kleuring te bereiken. Deze techniek maakt het mogelijk om specifieke eiwitten die in de cellen onder verdeling co-exprimeerd worden tegelijkertijd te identificeren terwijl de weefselintegriteit behouden blijft.
We raden aan om de weefselantilichamen en -condities vooraf te testen. De cruciale stappen zijn membraanpermeabilisatie, zorgvuldige DNA-denaturatie en het testen van de tijden voor blokkerings- en wasstappen. Het standaardiseren van de techniek is een uitdaging voor nieuwe laboratoria.
De bereiding van reagentia en toediening van thymidine-analogon bij knaagdieren is cruciaal voor succesvolle resultaten. Voor de toediening van thymidine-analogon BrdU, immobiliseer de onderbuikholte om de experimentele rat te beperken en gebruik een enkele milliliter spuit uitgerust met een 23 gauge naald om intraperitoneaal een vers bereide oplossing van 50 milligram per kilogram BrdU in het dier te injecteren. Bij het juiste experimentele eindpunt, verzamel de hersenen en bevries de hersenen om de verwerving van 40 micrometer dikke coronale secties mogelijk te maken met behulp van een cryostat microtoom en plaats de secties in individuele putjes van een 24-wels celkweekplaat in cryo beschermingsoplossing in de volgorde van hun verzameling. Wanneer alle secties zijn verzameld, bewaar de monsters bij minus 20 graden Celsius gedurende maximaal een paar maanden.
Om BrdU-kleuring te beoordelen, gebruik makend van een peroxidase reactie, met het avidine-biotine-peroxidase complex, breng de plakjes over van de cryo beschermingsoplossing naar 0,1 molair PBS tot de monsters kamertemperatuur bereiken en spoel de weefsels drie keer gedurende 10 minuten met verse 0,1 molair PBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, incubeer de secties in endogene peroxidase blokkeeroplossing gedurende 30 minuten, bij kamertemperatuur, gevolgd door drie 10 minuten wasbeurten in 0,1 molair PBS. Na de laatste wasbeurt incubeer de secties gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius in twee molaire zoutzuur gevolgd door een 10 minuten spoelen in 0,1 molair boraatbuffer.
Na drie wasbeurten in ijskoud 0,1 molair PBS, incubeer de monsters gedurende twee uur bij kamertemperatuur in PBS+blokkadoplossing, gevolgd door een overnachtelijke incubatie met muis Anti-BrdU primaire antilichaam in PBS+bij vier graden Celsius. Na drie 0,1 molair PBS wasbeurten, incubeer de monsters gedurende twee tot vier uur met het geschikte muis biotinyleerde secundaire antilichaam in PBS+bij kamertemperatuur. Na het wassen, behandel de secties met ABC-oplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur, gevolgd door drie 0,1 molair PBS wasbeurten.
Na de laatste wasbeurt breng de plakjes over naar DAB-Peroxidase Substraat Oplossing voor een incubatie van twee tot 10 minuten totdat de plakjes donkergrijs worden. Als positieve cellen kunnen worden gevisualiseerd, spoel de monsters met drie 15 minuten kraanwater wasbeurten gevolgd door drie 0,1 molair PBS wasbeurten. Na de laatste wasbeurt Gebruik een zachte borstel om de plakjes voorzichtig op gelatiniseerde glijmiddelen te monteren, voor overnachtelijke luchtdroging bij kamertemperatuur.
De volgende ochtend gebruik permanent montagemiddel om dekglasjes over de monsters te plaatsen. Om de BrdU positieve cellen te kwantificeren, gebruik eerst de 4x vergroting op een microscoop om de dentate gyrus te identificeren en zoek zorgvuldig langs de Z-as in de granulaire cel laag voor BrdU gelabelde kernen. Na het selecteren van een interval sectie voor cel zoeken over de gehele dentate gyrus, tel alle BrdU positieve cellen.
De morfologie van de gelabelde kern kan veranderen afhankelijk van hoeveel BrdU de cel heeft geïncorporeerd. Beweeg langzaam over de Z-as om alle kernen te kwantificeren vanuit ten minste 10 secties per dier en ten minste vijf dieren per groep die een cluster integreren. Voor beelddeconvolutie, open de diffractie punt spreiding functie 3D plugin, vul alle vereiste gegevens in, klik op OK en sla het bestand op.
Open vervolgens de DeconvolutionLab2 plugin en sleep de overeenkomende Z-stack afbeelding en PSF-bestand naar de overeenkomende venster slot. Selecteer het deconvolutie algoritme en het aantal iteraties, en klik op uitvoeren. Om de gedeconvolueerde afbeeldingen te combineren tot een enkele Z-stack afbeelding, selecteer Afbeelding en Stapels en klik op Z project.
Selecteer in het projectie type menu Max Intensiteit. Klik op OK en sla het bestand op. Om een RGB-afbeelding te maken, selecteer Afbeelding en Kleur en klik op Kanalen samenvoegen om de overeenkomende afbeelding in te stellen naar de gewenste kleurkanaal vanuit het vervolgkeuzemenu.
Schakel vervolgens het vakje Maak samengestelde afbeelding uit. Klik op OK en sla het bestand op. Wanneer alle kanaalafbeeldingen zijn gemaakt, open ten minste twee van de afbeeldingsbestanden en selecteer verschillende kleurkanalen voor elk afbeeldingsbestand om een RBG-afbeelding te maken.
In deze afbeeldingen kunnen representatieve dentate gyrus secties met BrdU gelabelde cellen worden waargenomen. Zoals waargenomen in deze vergrote afbeeldingen van de secties, tonen de gelabelde cellen een intense donkere kleuring. Opmerkelijk is dat er significante verschillen zijn in het aantal BrdU positieve cellen tussen gecontroleerde ratten die geen fysieke activiteit hebben ondergaan en de experimentele groep die is blootgesteld aan fysieke activiteit, in overeenstemming met andere gerapporteerde resultaten die hebben aangetoond dat fysieke activiteit de cellulaire proliferatie in de volwassen dentate gyrus verhoogt.
Bij het uitvoeren van dit protocol gebruik vers bereide oplossingen en behandel het weefsel voorzichtig. De hippocampus is vatbaar om te scheiden van de rest van de dia's wanneer het wordt behandeld en kan worden gemist. Deze procedure zou kunnen worden aangepast voor DNA-label en index evaluatie van DNA-synthese en dubbele kleuring celproliferatie studies.
We hopen dat deze inspanning nuttig is geweest voor de wetenschappelijke gemeenschap en het gemakkelijker maakt om nieuw
Overzicht
Deze studie richt zich op technieken voor het visualiseren van BrdU-positieve cellen om de volwassen neurogenese bij ratten te meten. Het artikel beschrijft protocollen voor de bereiding van reagentia, de toediening van thymidine-analogen, weefselverwerking en microscopie-beeldvorming om de cellulaire proliferatie in de gyrus dentatus te beoordelen.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Volwassen neurogenese
- Celproliferatie
- Immunohistochemie
Achtergrond
- Hemizygote labeling van delende cellen is belangrijk voor het begrijpen van neurogenese.
- Lichamelijke activiteit beïnvloedt het aantal BrdU-positieve cellen in de gyrus dentatus.
- De standaardisatie van kleuringstechnieken vormt een uitdaging voor nieuwe laboratoria.
Gebruikte methoden
- Intraperitoneale injectie van BrdU voor celmarkering
- Standaard immunohistochemische protocollen
- Microscopie voor beeldanalyse en kwantificering
Belangrijkste Resultaten
- Het protocol identificeert effectief BrdU-positieve cellen in hersenweefsel.
- Er werden significante verschillen in celproliferatie vastgesteld tussen de controle- en experimentele groepen.
- De beschreven methoden kunnen worden aangepast voor diverse cellulaire studies.
Conclusies
- De studie biedt een betrouwbare methode voor het beoordelen van neurogenese bij volwassenen.
- De resultaten benadrukken het belang van fysieke activiteit bij het bevorderen van neurogenese.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Een nauwkeurige kwantificering van cellulaire proliferatie en neurogenese is essentieel voor targetvalidatie bij het ontdekken van geneesmiddelen voor het centraal zenuwstelsel (CZS), waarbij mechanische risicobeperking steunt op reproduceerbare biomarkers voor regeneratief vermogen. Gestandaardiseerde BrdU-immunohistochemie maakt voorspellend vertrouwen in preklinische modellen mogelijk door kwantitatieve, op histologie gebaseerde read-outs te bieden die go/no-go-beslissingen in de vroege ontdekkingsfase ondersteunen. Deze techniek pakt een kritiek omslagpunt aan bij de triage van portfolio's door functionele target-interactie te koppelen aan meetbare veranderingen in de neurogenese van de hippocampus.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot neurogene routes en functionele doelwitvalidatie in ziekterelevante systemen te onderzoeken.
- Operationele waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie door directe visualisatie van delende cellen, waardoor mechanistische ambiguïteit in studies naar doelwitinteractie wordt verminderd.
- Voorspellende waarde: Genereert kwantitatieve gegevens over de activiteit van progenitorcellen dieten ten grondslag liggen aan portfolioprioritering en strategieën voor de identificatie van lead-verbindingen.
Screening & assayontwikkeling
- Klaar voor analyse: Produceert gestandaardiseerde, reproduceerbare weefselcoupes die geschikt zijn voor high-content imaging en geautomatiseerde workflows voor celtellingen.
- Kwantitatieve output: Levert meetbare aantallen BrdU-positieve cellen die dosis-responsanalyse en compound-screening in proliferatieve routes mogelijk maken.
- Herbruikbaar platform: Vestigt een overdraagbaar histologisch platform dat toepasbaar is op diverse knaagdiermodellen voor consistente campagnes voor target-validatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Verbindt mechanistische bevindingen in de gyrus dentatus van knaagdieren met menselijke neurogene paden die relevant zijn voor cognitieve stoornissen en stemmingsstoornissen.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen targetmodulatie in de ontdekkingsfase en preklinische beoordeling van de effectiviteit via geconserveerde proliferatieve biomarkers.
- Risico-gecorrigeerde voortgang: Informeert go/no-go-beslissingen door target-gemedieerde veranderingen in de neurogenese te correleren met functionele uitkomsten in gedragsmodellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van het testen van target-hypotheses tot lead-optimalisatie, en biedt histologie-gebaseerde validatie die mechanistische risicoreductie ondersteunt voordat er aanzienlijke investeringen in lead-kandidaten worden gedaan.
- Discovery Biology: Faciliteert de verduidelijking van signaalpaden en target-validatie door de co-detectie van BrdU met celtype-specifieke markers in proliferatieve niches mogelijk te maken.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve immunohistochemische output die bijdraagt aan de standaardisatie van assays binnen screeningcampagnes.
- Analytics: Genereert gestandaardiseerde celgetallen en morfometrische gegevens, waardoor statistische vergelijking van experimentele condities en behandelingseffecten mogelijk wordt.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de afstemming van biomarkers door een geconserveerde neurogene readout vast te stellen die vertaalbaar is van knaagdier- naar menselijke pathofysiologie.
- Enterprise Reuse: Fungeert als een herbruikbaar histologieplatform dat over verschillende locaties en projecten heen kan worden gestandaardiseerd voor consistente target-validatie.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door directe, kwantitatieve meting van de cellulaire proliferatie in neurogene zones.
- Operationele waarde: Garandeert de reproduceerbaarheid en standaardisatie van de assay via gedetailleerde weefselbewerking, antigeenherstel en detectiestappen.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroege risicoreductie van neurogene targets mogelijk te maken, waardoor het percentage mislukkingen in latere stadia afneemt.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door targetmodulatie te koppelen aan meetbare veranderingen in de hippocampale neurogenese.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in histologie, immunohistochemie en microscopie voor een succesvolle weefselverwerking en antigeendetectie.
- Afhankelijk van betrouwbare toegang tot cryostaat-microtomen, fluorescentiemicroscopen en beeldanalyse-software voor het maken van coupes en kwantificering.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor antilichaamvalidatie, blokkeringscondities en DNA-denaturatie om reproduceerbaarheid tussen gebruikers te garanderen.
- Vereist aanpassing van incubatietijden en stappen voor antigeenherstel bij toepassing op verschillende weefseltypen of fixatiemethoden.
- Beperkt door de fragiliteit van het weefsel tijdens het coupesnijden en monteren, wat zorgvuldige behandeling vereist om de integriteit van de hippocampus te behouden.
Veelgestelde vragen over biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Thymidine Analog (5‐Bromo‐2'‐Deoxyuridine) BrdU Administration and Tissue Preparation
2:02
BrdU Detection
4:40
Cell Quantification
5:33
Image Deconvolution
6:59
Results: BrdU‐Labeled Cell Identification and Quantification in Representative DG Tissue Section
7:46
Conclusion
