Name: Een Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in het maag-darmkanaal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Leer een ex vivo assay voor hyfale morfogenese van Candida albicans in het maag-darmkanaal met immunofluorescentie. Deze methode onthult hoe darmmetabolieten schimmelsignalen reguleren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs erkennen middelen en ondersteuning van Midwestern University Cellular and Molecular Core Research faciliteit.

Alle dierprotocollen werden goedgekeurd door midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) zoals beschreven vóór57. De Institutional Animal Care and Use Committee van de Midwestern University keurde deze studie onder MWU IACUC Protocol #2894. Het MWU-beleid voor dierverzorging volgt het Beleid van de Ggd voor humane zorg en gebruik van proefdieren en het beleid dat is vastgelegd in de Wet dierenwelzijn (AWA).
1. Muizen bestuderen standaardprotocol
<ol><li>Gebruik mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J muizen ten minste zes weken oud. Vul ze aan met steriel water met of zonder cefoperazone (0,5 mg/mL).<ol>
<li>Co-house muizen in groepen van 5, met elke kooi met alle mannelijke of alle vrouwelijke muizen. Zorg te allen tijde voor de muizen standaard muischow en water (via een fles van 400 mL).</li>
		<li>Controleer kooien dagelijks om ervoor te zorgen voedsel en waterstanden zijn genoeg, en om muizen te onderzoeken op tekenen van nood.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vervang het water om de 48 uur door cefoperazone om ervoor te zorgen dat er vers antibioticum wordt geleverd, ongeacht het resterende water in de kooivoedingsflessen.</li>
	<li>Na 5\u20127 dagen van cefoperazone behandeling, euthanaseren muizen via CO2 verstikking observeren vastgesteld gevestigde IACUC protocol. Bevestig de dood via cervicale dislocatie.</li>
	<li>Ontleden muizen met behulp van autoclave-gesteriliseerde scherpe eindigde schaar en autoclave-gesteriliseerde tangen.<ol>
<li>Na euthanasie, zet het dier vast aan een dissectie oppervlak door het vastzetten van alle ledematen, zodat de buik wordt blootgesteld.</li>
		<li>Spray de buikstreek met 70% ethanol om te voorkomen dat bont vastkleeft aan tangen, scharen of darmsecties tijdens dissectie.</li>
		<li>Gebruik tangen te knijpen en til een deel van de huid aan de basis van de buik en maak een kleine incisie door de huid en de onderliggende fascia met behulp van een schaar. Neem grote zorg bij het maken van deze incisie om te voorkomen dat puncturing de cecum of darmwand.</li>
		<li>Breid deze snede uit tot de ribbenkast, waardoor de buikholte gedeeltelijk wordt blootleggen. Maak een snede vanaf het punt van de eerste incisie aan weerszijden uit te breiden naar boven en lateraal.</li>
		<li>Trek deze flappen zijdelings en pin aan het ontledende oppervlak om de buikholte volledig bloot te leggen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Haal het DARM-darmkanaal uit met tangen, terwijl je een schaar gebruikt om snijwonden superieur te maken aan de maag en in het distale gebied van de dikke darm om de grootste hoeveelheid darminhoud van elke sectie te verzamelen.</li>
	<li>Let er bij het verwijderen van het GI-kanaal op dat de afzonderlijke componenten niet meer worden gescheurd. Scheid de maag, dunne darm, cecum, en dikke darm individueel met behulp van een schaar op hun proximale en distale uiteinden.</li>
	<li>Voor het verzamelen van elke darminhoud van elke sectie, maak een enkele incisie aan het distale uiteinde van elke sectie met behulp van een schaar, gevolgd door handmatig het verwijderen van de darminhoud in een 1,5 mL microcentrifuge buis met behulp van tangen.</li>
	<li>Bewaar de darminhoud op -80 °C voor ex vivo-tests.</li>
</ol>2. Bereiding van gist extract-pepton-dextrose (YPD) agar platen
<ol><li>Voeg aan een 1 L glazen fles 25 g gistextract peptone-dextrose bouillonpoeder, 10 g agar en ultrazuiver water toe aan een eindvolume van 500 mL.</li>
	<li>Autoclave bij 121 °C gedurende 30 minuten op een vloeibare cyclus om de media te steriliseren.</li>
	<li>Onder een laminaire stroomkap, giet ongeveer 20 mL van agar media in een steriele petriplaat. 500 mL agar media moet ongeveer 25 platen opleveren.</li>
	<li>Bewaar platen op 4 °C tot klaar voor gebruik.</li>
</ol>3. Ex vivo prep voor hyphal morphogenese test
<ol><li>Streep een frisse cultuur van C. albicans SC5314 op een YPD agar plaat en broeden 's nachts op 30 °C.</li>
	<li>Kies twee tot drie middelgrote individuele kolonies uit 's nachts geteelde C. albicans SC5314-cultuur en schors opnieuw in 1 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Haal bevroren darminhoud uit de vriezer van -80 °C en ontdooi bij 25 °C.</li>
	<li>Weeg ongeveer 150 mg darminhoud af in een nieuwe buis van 1,5 mL.</li>
	<li>Stel de darminhoud opnieuw op met 150 μL PBS (darminhoud en PBS met een verhouding van 1:1 gewicht tot volume).</li>
	<li>Vortex op hoge snelheid voor 30 s om de darminhoud te homogeniseren en laat zitten op kamertemperatuur voor ongeveer een minuut.</li>
	<li>Centrifugeren de homogenaten op 1000 x g gedurende 3 min.</li>
	<li>Breng de supernatant over naar een nieuwe 1,5 mL buis.</li>
	<li>Herhaal de stappen 3.7 en 3.8 om al het vuil in de supernatant te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 10 μL van de C. albicans SC5314-entmateriaal toe aan dit supernatant</li>
	<li>Meng goed en incubeer op 37 °C gedurende 4 tot 5 uur.</li>
</ol>4. Exogene toevoeging van metabolieten aan de gut homogenaatextracten voor de hyphalorfemorogenesetest
<ol><li>Haal bevroren darminhoud uit de -80 °C vriezer en opnieuw opgehangen in PBS bij 1:1 verhouding (gewicht: volume).</li>
	<li>Voeg de gewenste concentratie darmmetabolieten toe aan het darmgehalte en het PBS-mengsel.</li>
	<li>Vortex op hoge snelheid voor 30 s om de darminhoud met metabolieten homogeniseren en laat zitten op kamertemperatuur voor ongeveer 10 min.</li>
	<li>Centrifugeren de homogenaten op 1000 x g gedurende 3 min.</li>
	<li>Breng de supernatant over naar een nieuwe 1,5 mL buis. Herhaal de stappen 4.4 en 4.5 om al het vuil in de supernatant te verwijderen.</li>
	<li>Voeg 10 μL van de C. albicans SC5314-entmateriaal toe aan dit supernatant. Meng goed en incubeer op 37 °C gedurende 4 tot 5 uur.</li>
</ol>5. C. albicans morphogenesetest (immunostaining en beeldvorming)
<ol><li>Centrifugeren de monsters op 1000 x g gedurende 2 min en gooi de supernatant via pipetting.</li>
	<li>Bevestig de monsters in 100 μL van 2% paraformaldehyde (PFA) gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Centrifuge op 1000 x g gedurende 2 min en gooi supernatant via pipetting.</li>
	<li>Was de monsters twee maal met 1 mL PBS. Om monsters te wassen, opnieuw op te schorten de pellet in PBS door pipetteren zachtjes. Niet vortex het monster als dit kan hyphal structuren beschadigen. Na herschorting, centrifugeren op 1000 x g gedurende 2 min en gooi de supernatant via pipetting.</li>
	<li>Incubeer de monsters bij kamertemperatuur in 100 μL PBS die polyklonale C. albicans antilichaam (1:100 verdunning) gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Was de monsters drie keer met 1 mL PBS. OPMERKING: Bij het gebruik van een fluorescerend antilichaam wordt aanbevolen dat alle verdunnings- en wasstappen bij weinig licht worden uitgevoerd om fotobleken te voorkomen en de levensduur van het monster te verbeteren.</li>
	<li>Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten in 100 μL PBS met anti-Konijn IgG Alexafluor 488 antilichaam bij 1:500 verdunning. Voer incubatie uit in een donkere lade of kamer om te voorkomen dat foto bleken.</li>
	<li>Was de monsters drie keer met 1 mL PBS.</li>
	<li>Stel de monsters opnieuw op in 100 μL PBS en breng over op een 96-putplaat voor beeldvorming. OPMERKING: Wanneer niet wordt afgebeeld, is het raadzaam dat de 96-well plaat worden verpakt in aluminiumfolie om foto bleken te voorkomen.</li>
	<li>Beeld schimmelcellen met behulp van 20x en 40x objectieve lenzen met behulp van een fluorescentie imaging microscoop. Gebruik een groen fluorescerend eiwit (GFP) filter (excitatiegolflengte 470/40 en emissiegolflengte 525/50) om fluorescentie te detecteren.</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

De hier beschreven methode presenteert een nieuwe manier om het effect van antibiotica, dieet, xenobiotische en therapeutische effecten op C. albicans hyphalmorphogenese in het GI-kanaal te onderzoeken. Aangezien de meeste systemische infecties afkomstig zijn van het GI-kanaal21,22,23,24,25,26,<sup class="...

Candida albicans is een opportunistische, polymorfe schimmelpathiek die normaal commensal is, maar een morfologische verandering kan ondergaan in een virulente vorm die levensbedreigende infecties kan veroorzaken bij immuungecompromitteerde personen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans is een belangrijke oorzaak van systemische nosocomiale infecties, met een sterftecijfer van 40\u201260% zelfs met schimmeldodende behandeling2,14,15. Hoewel C. albicans zich in verschillende gastheerniches bevindt, waaronder het vrouwelijke voortplantingssysteem16,17,de mondholte van gezonde individuen18 en het maag-darmkanaal19,20, is het merendeel van de systemische infecties afkomstig van het GI-darmkanaal en bovendien, de bron van systemische infectie wordt vaak bevestigd als het GI-kanaal21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. albicans pathogeniteit in het GI-darmkanaal wordt beïnvloed door een breed scala van factoren; een belangrijk kenmerk dat nodig is voor virulentie is echter de overgang van een gistcelmorfologie naar een virulente hyphaltecelmorfologie35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. albicans gehechtheid en verspreiding van het GI-darmkanaal tijdens infectie wordt sterk geassocieerd met zijn vermogen om over te stappen van een commensale gist in virulente hyphae, waardoor de schimmels invasieve ziekte44,45,46,47,48,49,50,51,52,53kunnen veroorzaken .
Een verscheidenheid van factoren in de darm, met inbegrip van n-acetylglucosamine, reguleren hyphal vorming door C. albicans. Daarom is het van cruciaal belang om de kloof in kennis over de hyphalemorfose van deze schimmelpathogenese in het GI-kanaal54,55,56teverkleinen . Recent bewijs wijst erop dat verschillende darmmetabolieten de hyphalemorfogenese van C. albicans in vitro57,58,59,60differentieel controleren . Echter, technische beperkingen presenteren problemen bij een poging om C. albicans hyphae vorming studie in in vivo darmmonsters, met name kleuring gist en hyphae cellen en kwantitatieve analyse van hyphal ontwikkeling. Om C. albicans hyphale morfogenese in het GI-kanaal te begrijpen, werd een ex vivo-methode ontwikkeld met behulp van oplosbare extracten van gehomogeniseerd darmgehalte van muizen om het effect van metabolieten op schimmelhyphale morfogenese te bestuderen. Gebruikmakend van darmmonsters van muizen die resistent zijn en gevoelig zijn voor C. albicans GI-infectie, zal deze methode helpen om het effect van metabolieten, antibiotica en xenobiotica op schimmelhyphale morfogenese in het GI-darmkanaal te identificeren en te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>1 - 10 &micro;L Pipet Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-454</td><td>Misc</td></tr><tr><td>100 - 1000 &micro;L Pipet Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-400</td><td>Misc</td></tr><tr><td>20 - 200 &micro;L Pipet Tips</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-451</td><td>Misc</td></tr><tr><td>2-methylbutyric acid</td><td>Sigma</td><td>193070-25G</td><td>hyphal-remmende verbinding</td></tr><tr><td>488 goat anti-rabbit IgG</td><td>Invitrogen (Fisher)</td><td>A11008</td><td>IF Staining secundaire ab</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td>YPD agar component</td></tr><tr><td>Automated Imaging Microscope</td><td>Keyence</td><td>BZX700</td><td></td></tr><tr><td>Candida Albicans Antibody</td><td>Invitrogen (Fisher)</td><td>PA1-27158</td><td>IF Staining primaire ab</td></tr><tr><td>cefoperazone</td><td>Cayman</td><td>16113</td><td>antibioticum</td></tr><tr><td>deoxycholic acid</td><td>Sigma</td><td>30960</td><td>hyphal-remmende verbinding</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher</td><td>D16-500</td><td>hyphal-bevorderende verbinding</td></tr><tr><td>forceps</td><td>Fisher</td><td>08-885</td><td></td></tr><tr><td>lactic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAAL13242-06</td><td>hyphal-remmende verbinding</td></tr><tr><td>lithocholic acid</td><td>Sigma</td><td>L6250-10G</td><td>hyphal-remmende verbinding</td></tr><tr><td>palmitic acid</td><td>Sigma</td><td>P5585-10G</td><td>hyphal-remmende verbinding</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td>IF Staining fixatief</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62692</td><td>PBS component</td></tr><tr><td>p-tolylacetic acid</td><td>SCBT</td><td>sc-257959</td><td>hyphal-remmende verbinding</td></tr><tr><td>sebacic acid</td><td>Sigma</td><td>283258-250G</td><td>hyphal-remmende verbinding</td></tr><tr><td>sharp ended scissors</td><td>Fisher</td><td>28301</td><td></td></tr><tr><td>sterile Milli-Q water</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Misc</td></tr><tr><td>YPD Broth</td><td>BD Biosciences</td><td>242810</td><td>YPD agar component</td></tr></tbody></table>

een ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in het maag-darmkanaal

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphalemorfogenese in het maag-darmkanaal (GI) wordt strak gecontroleerd door verschillende milieusignalen, en speelt een belangrijke rol in de verspreiding en pathogenese van deze opportunistische schimmelpathover. Echter, methoden om schimmelhyphae visualiseren in de GI tract in vivo zijn uitdagend die het begrip van milieusignalen beperkt bij het beheersen van dit morfogenese proces. Het hier beschreven protocol toont een nieuwe ex vivo methode voor visualisatie van hyphal morfogenese in darmhomogenaat extracten. Met behulp van een ex vivo test, deze studie toont aan dat cecal inhoud van antibiotica behandelde muizen, maar niet van onbehandelde controle muizen, bevorderen C. albicans hyphal morfogenese in de darminhoud. Verder, het toevoegen van terug specifieke groepen van darmmetabolieten aan de cecal inhoud van met antibiotica behandelde muizen differentieel reguleert hyphalfogenese ex vivo. Samen vertegenwoordigt dit protocol een nieuwe methode om de milieusignalen te identificeren en te onderzoeken die C. albicans hyphal morfogenese in het GI-kanaal controleren.

Deze resultaten samen met eerdere bevindingen uit het Thangamani laboratorium60 geven aan dat wanneer C. albicans wordt geteeld ex vivo in gut homogenaat extracten uit de maag, dunne darmen en dikke darmen van onbehandelde controle en antibiotica behandelde muizen, C. albicans ontwikkelt zich over het algemeen met een gist morfologie (Figuur 1B). Echter, wanneer geteeld in het cecal extract van met antibiotica behandelde muizen, C. albicans ...

De ex vivo test beschreven in deze studie met behulp van gut homogenaat extracten en immunofluorescentie kleuring vertegenwoordigt een nieuwe methode om de hyphal morfogenese van Candida albicans in de GI-darmkanaal te onderzoeken. Deze methode kan worden gebruikt om de milieusignalen te onderzoeken die morfogenetische overgang in de darm regelen.

Een Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in het maag-darmkanaal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Het protocol aangetoond in deze video stelt ons in staat om de rol van darmmetabolieten op schimmelhyphal hyphal morfogenese te begrijpen. Deze ex vivo techniek min of meer de dichtstbijzijnde benadering van de darm voor het bestuderen van schimmel hyphal morfogenese op een manier die geen in vitro studie kan repliceren. Deze methode kan worden toegepast om de rol van darmmetabolieten op andere enterische pathogenen te bestuderen.Ontleden muizen met behulp van autoclaved gesteriliseerde scherp-ended schaar en tangen. Na euthanasie, zet het dier vast aan een dissectieoppervlak door alle ledematen vast te pinnen om de buik bloot te stellen. Spray de buikstreek met 70% ethanol om te voorkomen dat bont vastkleeft aan tangen, scharen of darmsecties.Gebruik tangen te knijpen en til een deel van de huid aan de basis van de buik en maak een kleine incisie door de huid en de onderliggende fascia verzorgen om te voorkomen dat puncturing de cecum of darmwand. Breid deze snede uit tot de ribbenkast en stel de buikholte gedeeltelijk bloot en maak vervolgens een snede vanaf het punt van de initiële incisie aan weerszijden en strekt zich uit naar boven en zijdelings. Trek deze flappen zijdelings

an-ex-vivo-assay-to-study-candida-albicans-hyphal-morphogenesis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates the development of an in vivo mouse model to study the biofilm formation of Candida albicans in subcutaneous tissue. The experiment involves implanting Candida-infected devices in the animal's back region for biofilm development.

Candida albicans Biofilm Formation in an In Vivo Mouse Model

This video demonstrates an in vitro technique to study the effect of antibodies on fungal biofilms. The pathogenic fungus Candida tropicalis secretes a virulence factor secreted aspartyl proteinase 2 (Sap2), facilitating biofilm formation. Upon introducing a heat-inactivated serum containing Sap2-specific antibodies that inhibit biofilm maturation, the viability of the fungal cells is assessed using a chromogenic assay.

An In Vitro Assay to Evaluate the Effect of Antibodies on Candida tropicalis Biofilm

We beschrijven werkwijzen voor levende cellen videomicroscopie...

Live-cel Video Microscopie van pathogene schimmel Fagocytose

Het huidige artikel schetst een protocol bij een in vitro celcultuur model systeem om de interactie van een facultatief intracellulaire menselijke pathogene schimmel Candida glabrata met menselijke macrofagen, die een nuttig instrument om onze kennis van schimmel virulentiemechanismen vooruit zal bestuderen vestigen.

Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

We presenteren een experimentele procedure van Candida albicans biofilmontwikkeling in een muis subcutaan model. Schimmelbiofilms werden gekwantificeerd door het bepalen van het aantal kleurvormende eenheden en door niet-invasieve bioluminescentie-beeldvorming, waarbij de hoeveelheid geproduceerd licht overeenkomt met het aantal levensvatbare cellen.

Candida albicans biofilm ontwikkeling op medisch-relevante vreemde lichamen in een muis Subcutane Model Gevolgd door bioluminescentiebeeldvorming

Hier presenteren we de nematode Caenorhabditis elegans als een veelzijdig hostmodel aan de studie van microbiële interactie.

De Nematode Caenorhabditis Elegans - een veelzijdig In Vivo -Model om te studeren van Host-microbe interacties

Dit protocol beschrijft het gebruik van een aanpasbaar geautomatiseerde microfluidic apparaat te visualiseren van biofilm vorming in Candida albicans , onder fysiologische omstandigheden van de gastheer.

Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat

Het doel van dit protocol is het visualiseren van Candida albicans celvorm en lokalisatie in het maagdarmkanaal van zoogdieren.

Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Dit manuscript beschrijft een methode voor het screenen van middelgrote Candida albicans mutante bibliotheken op morfogenese fenotypes tijdens actieve infectie in een zoogdier gastheer met behulp van niet-invasieve confocale microscopie.

Gebruik van in vivo beeldvorming om te screenen op morfogenese fenotypes in Candida albicans mutante stammen tijdens actieve infectie bij een zoogdiergastheer

Concurrerende homing experimenten toelaten om rechtstreeks de beoordeling van de trekkende eigenschappen van twee verschillende celpopulaties in een muis. Hier hebben we illustreren deze procedure door het vergelijken van de migratie van ex vivo gegenereerde gut-tropische versus niet-gut tropische T-cellen.

Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study

Leer een ex vivo assay voor hyfale morfogenese van Candida albicans in het maag-darmkanaal met immunofluorescentie. Deze methode onthult hoe darmmetabolieten schimmelsignalen reguleren.

Een Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in het maag-darmkanaal

Meer video's verkennen