Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) voor het opnemen van de licht-opgeroepen elektrische reacties van de Muis Retinal Pigment Epithelium

De DC-ERG-techniek kan worden gebruikt voor de niet-ontwijkende evaluatie van de epitheelfunctie van het netvliespigment om leeftijdsgerelateerde veranderingen of ziekteprogressie te monitoren en farmacologische interventieeffecten te beoordelen. Deze techniek verbetert bij DC-ERG reproduceren vermogen en het gebruiksgemak door het vereenvoudigen van de capillaire elektrode voorbereiding. Het kan ook worden aangevuld met een standaard ohm software applicatie om analyse te vergemakkelijken.

Begin met het voorzichtig schuiven van een 25-gauge spuitnaald door de siliconen rubberen pakking naar de achterwand van de elektrodehouder. Vul de basis van de elektrodehouder met ontgast HBSS terwijl u de naald langzaam intrekt, zorg ervoor dat er geen bellen worden geïntroduceerd en vervang de schroefdraaddop zonder aandraaien. Plaats de spuitnaald opnieuw om de lege ruimte in de opening met HBSS op te vullen en de capillaire horizontaal vast te houden tijdens het vullen om te voorkomen dat de oplossing aan de andere kant ontsnapt.

Pak het gevulde capillair aan het gebogen uiteinde vast, steek het andere uiteinde langzaam door de losgemaakte dop en draai de schroefdop op zijn plaats. Kantel de elektrodehouders met de capillaire elektroden naar boven gericht om eventuele bellen naar buiten te laten stromen en de haarvaten gedurende vijf tot tien minuten in een vacuümkamer te ontgassen. Laat vervolgens langzaam het vacuüm los en vul de elektrodehouders en glasvattillaries bij, zoals aangetoond.

Om een aangepaste standaard te maken voor de micro-elektrodenhouder, verwijdert u de zwarte polyacetale clips van één kant van een nummer acht T-clip en gebruikt u een cilinderbasis met magnetische kogelgewrichten die in de helft worden bewerkt om de hoogte aan te passen. Zet de gemodificeerde T-clips vast aan de magnetische kogelmontageschroeven met M3-formaat moeren en een schuif in ongeveer een-inch taps toelopende houten handvat, gewijzigd van een katoenen tip reinigingsstok, in de standaard onder een hoek om de micro-elektrodrode houder veilig in de op maat gemaakte T-clip magnetische bal gewrichtsstandaard. Gebruik vervolgens de cilinderbasis van zeldzame aardmagneten om de aangepaste elektrodehouder op de metalen plaat van het podium te plaatsen, waardoor een rotatie van 360 graden op een 180-gradenas mogelijk is.

Om een elektrodetest uit te voeren, moet u eerst voorzichtig de volledig geassembleerde HBSS-gevulde capillaire micro-elektroden in een kleine container van HBSS laten zakken. Plaats de naaldgrondelektrode en de zilver-, zilverchloride-gecentreerde pelletreferentieelektrode in dezelfde HBSS om het circuit te voltooien en selecteer of maak een geschikte id om de te testen muis te beschrijven. Als u het direct gekoppelde elektroretinogramprotocol wilt selecteren dat moet worden uitgevoerd, klikt u op protocollen en selecteert u DC-ERG.

Klik op uitvoeren. Er verschijnt een dialoogvenster met de patiëntgegevens. Als de informatie juist is, klikt u op ja en gaat u verder met stap één van de zes.

Sluit de deuren van de kooi van Faraday en klik op impedantie om de impedantiemodus weer te geven. Controleer of de waarden voor de mondverwijzing, de staartgrond en de registratie van elektroden aanvaardbaar zijn en klik op stap vier van zes om de basisstabiliteit te testen. Klik op voorbeeld om de sporen te bekijken.

De sporen moeten weinig ruis hebben met een piek-tot-piek amplitude van minder dan 200 microvolt. Om de muis en elektroden te positioneren voor een experiment, verdoven het hoornvlies van een verdoofde muis met een druppel van 5% proparacaine zoutzuur voordat het hoornvlies verwijdt met een druppel van 2,5% fenylephrine HCL en 5% tropicamide. Controleer in de ERG-systeemsoftware of de juiste patiënt is geselecteerd.

Klik op protocollen. Selecteer onder protocolbeschrijving DC-ERG en klik op uitvoeren. Klik op ja om te controleren of de juiste test wordt uitgevoerd.

Gebruik stap één van de zes om een zwak rood lampje in de koepel in te schakelen en de muis op een verwarmde opnametafel te plaatsen. Gebruik tangen om de huid van het achterbeen voorzichtig te vertenten. En met behulp van een hand om stevig vast te houden van de naald elektrode, gebruik de andere hand om de elektrode onderhuids in het achterste been om de elektrode op zijn plaats te zetten.

Plaats de referentie zilver, zilverchloride elektrode in de mond van het dier, zodat de gecentreerde pellet rust langs de rug wang en wordt op zijn plaats gehouden achter de tanden. Voordat u de haardelektrode op het oog plaatst, plaatst u de elektrodehouder met de glazen haarvaten verticaal georiënteerd en veegt u de elektrodehouder met een wijsvinger om eventuele bellen te verwijderen die mogelijk zijn geïntroduceerd. Gebruik een naald van 25 meter om de haarvaten te vullen met HBSS en inspecteer de haarvaten om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen in de uiteinden zitten.

Plaats de elektrodehouderstandaard zodat de open uiteinden van de met HBSS gevulde haarvaten in zacht contact staan met het hoornvlies. En zorg ervoor dat u geen bellen inbrengt, omkert de glijmiddel ooggeldispenser om de eerste druppels weg te gooien. Plaats vervolgens een druppel glijmiddel ooggel op elk oog om de geleidbaarheid te behouden en uitdroging tijdens de opname te voorkomen.

Als u de DC-ERGs wilt opnemen, klikt u op stap vijf van zes en klikt u op impedantie om het scherm voor impedantiecontrole te gebruiken om de weerstanden van de linker- en rechterogen te onderzoeken. De impedantiewaarden voor de opnameelektroden aan elk oog moeten vergelijkbaar zijn. En de impedantiewaarden voor zowel de grond- als referentieelektroden moeten minder dan 10 kilohms zijn.

Klik op voorbeeld om de sporen voor de linker- en rechterogen te bekijken en wacht tot 10 minuten tot een stabiele basislijn wordt bereikt. Klik vervolgens op stoppen om het tracepvoorbeeld af te sluiten en klik op uitvoeren om de opname te starten. Hier wordt een voorbeeldgegevensset van voorwaardelijke knock-out en wild-type muizen weergegeven.

In deze analyse, het spoor last van minuten bellen in de elektrode. Het verhoogde het piek-tot-piekgeluid in het spoor. In een aparte analyse werden de bellen geëlimineerd met behulp van de vacuümkamer voordat de micro-elektroden in de elektrodehouderstands werden gemonteerd.

De best passende lijnen van de eerste 25 seconden kunnen worden berekend, waardoor de drift-gecorrigeerde reacties kunnen worden gerepliceerd en de amplitudes van de DC-ERG componenten kunnen worden geïdentificeerd. Zoals verwacht, verminderde expressie van genezing 7.1 kaliumkanalen in de RPE sterk verzwakt de c-golf en snelle oscillatie, wat wijst op een aanzienlijke aantasting van het netvlies pigment epitheel elektrische eigenschappen. Hier worden de relatieve amplitudes van de DC-ERG componenten getoond, genormaliseerd tot wildtype en uitgezet tegen de twee grootste licht-opgeroepen a-wave amplitudes.

Deze vorm van analyse kan bepalen of de verminderde elektrische reacties van de RPE kunnen worden verantwoord door de vermindering van fotoreceptoractiviteit alleen. Of als er een onderliggend defect is dat afkomstig is van de RPE. Vergeet niet om een stabiele basislijn te bereiken voordat u naar de muisopname gaat en de elektroden periodiek opnieuw te bezichtigen op bellen die mogelijk zijn geïntroduceerd.

Donkere en aangepaste ERG's kunnen voorafgaand aan de DC-ERG worden geregistreerd om de kegelgestuurde retinale functie te meten. Licht aangepaste ERGs kunnen ook worden uitgevoerd na de DC-ERG om de kegel-gedreven retinale reacties te evalueren.