Name: Een patiënt-afgeleide Xenograft Model voor veneuze misvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Leer een patiënt-afgeleid xenograftmodel voor veneuze misvormingen met endotheelcellen. Deze methode maakt dagelijkse monitoring van celgroei en therapierespons mogelijk voor preklinisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Nora Lakes bedanken voor het proeflezen. Onderzoek gemeld in dit manuscript werd ondersteund door het National Heart, Lung, and Blood Institute, onder Award Number R01 HL117952 (E.B.), onderdeel van de National Institutes of Health. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.

<ol><li>Dompmartin, A., Vikkula, M., Boon, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+malformation%3A+update+on+aetiopathogenesis%2C+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Phlebology%3A+The+Journal+of+Venous+Disease%22%5BJournal%5D)">Venous malformation: update on aetiopathogenesis, diagnosis and management.</a> Phlebology: The Journal of Venous Disease. 25 (5), 224-235 (2010).</li>
<li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+in+angiopoietin+receptor+gene+TEK+cause+solitary+and+multiple+sporadic+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations in angiopoietin receptor gene TEK cause solitary and multiple sporadic venous malformations.</a> Nature Genetics. 41 (1), 118-124 (2009).</li>
<li>Castel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+PIK3CA+mutations+as+a+driver+of+sporadic+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic PIK3CA mutations as a driver of sporadic venous malformations.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 42(2016).</li>
<li>Limaye, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+Activating+PIK3CA+Mutations+Cause+Venous+Malformation%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Somatic Activating PIK3CA Mutations Cause Venous Malformation.</a> The American Journal of Human Genetics. 97 (6), 914-921 (2015).</li>
<li>Castillo, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+activating+mutations+in+Pik3ca+cause+sporadic+venous+malformations+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Somatic activating mutations in Pik3ca cause sporadic venous malformations in mice and humans.</a> Science Translational Medicine. 8 (332), 43(2016).</li>
<li>Stratman, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+lumen+and+vascular+guidance+tunnel+formation+requires+MT1-MMP-dependent+proteolysis+in+3-dimensional+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell lumen and vascular guidance tunnel formation requires MT1-MMP-dependent proteolysis in 3-dimensional collagen matrices.</a> Blood. 114 (2), 237-247 (2009).</li>
<li>Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Highly+Immunocompromised+Mice+for+the+Establishment+of+Patient-Derived+Xenograft+%28PDX%29+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models.</a> Cells. 8 (8), 889(2019).</li>
<li>Byrne, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+open+issues+in+cancer+precision+medicine+with+patient-derived+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts.</a> Nature Reviews Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).</li>
<li>Allen, P., Melero-Martin, J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+collagen%2C+fibrin+and+PuraMatrix+matrices+provide+permissive+environments+for+human+endothelial+and+mesenchymal+progenitor+cells+to+form+neovascular+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Type I collagen, fibrin and PuraMatrix matrices provide permissive environments for human endothelial and mesenchymal progenitor cells to form neovascular networks.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (4), 74(2011).</li>
<li>Allen, P., Kang, K. T., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+onset+of+perfused+blood+vessels+after+implantation+of+ECFCs+and+MPCs+in+collagen%2C+PuraMatrix+and+fibrin+provisional+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative%22%5BJournal%5D)">Rapid onset of perfused blood vessels after implantation of ECFCs and MPCs in collagen, PuraMatrix and fibrin provisional matrices.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 9 (5), 632-636 (2015).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+angiogenesis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays.</a> Angiogenesis. 21 (3), 425(2018).</li>
<li>Roh, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+results+of+surgical+treatment+for+patients+with+venous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Vascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">The results of surgical treatment for patients with venous malformations.</a> Annals of Vascular Surgery. 26 (5), 665-673 (2012).</li>
<li>Marler, J. J., Mulliken, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+management+of+hemangiomas+and+vascular+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Plastic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Current management of hemangiomas and vascular malformations.</a> Clinics in Plastic Surgery. 32 (1), 99-116 (2005).</li>
<li>Goines, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+xenograft+model+for+venous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">A xenograft model for venous malformation.</a> Angiogenesis. 21 (4), 725-735 (2018).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ponatinib+Combined+With+Rapamycin+Causes+Regression+of+Murine+Venous+Malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+thrombosis%2C+and+vascular+biology%22%5BJournal%5D)">Ponatinib Combined With Rapamycin Causes Regression of Murine Venous Malformation.</a> Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 39 (3), 496-512 (2019).</li>
<li>Le Cras, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutively+active+PIK3CA+mutations+are+expressed+by+lymphatic+and+vascular+endothelial+cells+in+capillary+lymphatic+venous+malformation%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Constitutively active PIK3CA mutations are expressed by lymphatic and vascular endothelial cells in capillary lymphatic venous malformation.</a> Angiogenesis. , 1-18 (2020).</li>
<li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin+improves+TIE2-mutated+venous+malformation+in+murine+model+and+human+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Rapamycin improves TIE2-mutated venous malformation in murine model and human subjects.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3491-3504 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Hier beschrijven we een methode om een door de patiënt afgeleid xenograft-model van VM te genereren. Dit murine model presenteert een uitstekend systeem dat onderzoekers in staat stelt om een dieper begrip van pathologische lumen uitbreiding te krijgen en zal instrumenteel zijn in de ontwikkeling van meer effectieve en gerichte therapieën voor de behandeling van VM. Dit kan gemakkelijk worden aangepast om andere soorten vasculaire afwijkingen te onderzoeken, zoals capillaire lymfefafe veneuze misvorming...

Gebreken in de ontwikkeling van de vasculatuur zijn de onderliggende oorzaak van vele ziekten, waaronder veneuze misvorming (VM). VM is een aangeboren ziekte die wordt gekenmerkt door abnormale morfogenese en uitbreiding van aderen1. Belangrijke studies over VM-weefsel en endotheelcellen (EC) hebben gain-of-function mutaties in twee genen geïdentificeerd: TEK, dat codeert de tyrosine kinase receptor TIE2, en PIK3CA, die codeert de p110α (katalytische subunit) isoform van PI3-kinase (PI3K)2,3,4,5. Deze somatische mutaties resulteren in ligand-onafhankelijke hyper-activatie van belangrijke angiogene/groeisignaleringstrajecten, waaronder PI3K/AKT, wat resulteert in verwijde ectatische aderen3. Ondanks deze belangrijke genetische ontdekkingen zijn de daaropvolgende cellulaire en moleculaire mechanismen die abnormale angiogenese en de vorming van vergrote vasculaire kanalen veroorzaken nog steeds niet volledig begrepen.
Tijdens normale en pathologische angiogenese ontspruiten nieuwe vaten uit een reeds bestaand vasculair netwerk en de EG ondergaan een opeenvolging van belangrijke cellulaire processen, waaronder proliferatie, migratie, extracellulaire matrix (ECM) remodellering en lumenvorming6. Twee- en driedimensionale (2D/3D) in vitro culturen van de EG zijn belangrijke instrumenten om elk van deze cellulaire eigenschappen individueel te onderzoeken. Niettemin is er een duidelijke vraag naar een muismodel dat de uitbreiding van pathologische vaartuigen binnen de micro-omgeving van de gastheer hervat terwijl het een efficiënt platform biedt voor preklinische evaluatie van gerichte geneesmiddelen voor translationeel onderzoek.
Up-to-date is een transgene murinemodel van VM in verband met TIE2-functiemutaties niet gemeld. De huidige transgene VM-muismodellen zijn gebaseerd op de alomtegenwoordige of weefselbeperkte expressie van de activerende mutatie PIK3CA p.H1047R3,5. Deze transgene dieren geven significant inzicht in de effecten van deze hotspot PIK3CA mutatie. De beperking van deze modellen is de vorming van een zeer pathologisch vasculair netwerk dat resulteert in vroege dodelijkheid. Deze muismodellen weerspiegelen dus niet volledig het sporadische optreden van mutatiegebeurtenissen en gelokaliseerde aard van VM-pathologie.
Integendeel, door de patiënt afgeleide xenograftmodellen zijn gebaseerd op de transplantatie of injectie van pathologisch weefsel of cellen afkomstig van patiënten in immunodeficient muizen7. Xenograft-modellen zijn een krachtig hulpmiddel om de kennis over ziekteontwikkeling en ontdekking van nieuwe therapeutische middelen te verbreden8. Bovendien stelt het gebruik van patiënt-afgeleide cellen wetenschappers in staat om mutatieheterogeniteit samen te vatten om het spectrum van patiëntfenotypen te bestuderen.
Hier beschrijven we een protocol waarbij door de patiënt afgeleide VM EC die een gemuteerde constitutief-actieve vorm van TIE2 en/of PIK3CA uitdrukken, onderhuids worden geïnjecteerd in de rug van athymische naaktmuizen. Geïnjecteerde vasculaire cellen worden in een ECM-kader opgehangen om angiogenese te bevorderen zoals beschreven in eerdere vasculaire xenograftmodellen9,10,11. Deze VM EC ondergaan significante morfogenese en genereren vergrote, doorgesperde pathologische vaten bij afwezigheid van ondersteunende cellen. Het beschreven xenograftmodel van VM biedt een efficiënt platform voor preklinische evaluatie van gerichte geneesmiddelen voor hun vermogen om ongecontroleerde lumenexpansie te remmen.

<table><tbody><tr><td>Athymic nude mice, (Foxn1-nu); 5-6 weken, mannetjes</td><td>Envigo</td><td>069(nu)/070(nu/+)</td><td>Subcutane injectie</td></tr><tr><td>Biotinylated Ulex europeaus Agglutinin-I (UEA-I)</td><td>Vector Laboratories</td><td>B-1065</td><td>Histologische anlaysis</td></tr><tr><td>Flesdopfilter (500 ml; 0,2 &micro;M)</td><td>Thermo Fisher</td><td>974106</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>BSA</td><td>A7906-50MG</td><td>Celcultuur; Histologische analyse</td></tr><tr><td>Calciumchloride dihydraat (CaCl2.2H2O)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Caliper</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50996491</td><td>Lesie plug meting</td></tr><tr><td>CD31-geconjugeerde magnetische kralen (Dynabeads)</td><td>Life Technologies</td><td>11155D</td><td>EC-scheiding</td></tr><tr><td>Celzeven (100 &mu;M)</td><td>Greiner</td><td>542000</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Collageenase A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Conische buis; polypropyleen (15 mL)</td><td>Greiner</td><td>07 000 241</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Conische buis; polypropyleen (50 mL)</td><td>Greiner</td><td>07 000 239</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Coplin kleuringsvat</td><td>Ted Pella</td><td>21029</td><td>Histologische anlaysis</td></tr><tr><td>Dekglas (50 X 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12545E</td><td>Histologische anlaysis</td></tr><tr><td>DAB: 3,3'Diaminobenzidine Reagens (ImmPACT DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td>Histologische anlaysis</td></tr><tr><td>Dulbecco's Aanpassing van Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-027-CV</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Life Technologies</td><td>12321D</td><td>EC-scheiding</td></tr><tr><td>Oorpons</td><td>VWR</td><td>10806-286</td><td>Subcutane injectie</td></tr><tr><td>EDTA (0,5M, pH 8,0)</td><td>Life Technologies</td><td>15575-020</td><td>Histologische anlaysis</td></tr><tr><td>Endotheliaal Cell Growth Medium-2 (EGM2) Bulletkit (basismedium en supplementen)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Eosine Y (op alcoholbasis)</td><td>Thermo Scientific</td><td>71211</td><td>Histologische anlaysis</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>Histologische anlaysis</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS), HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30910.03</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Filtertip 1,250 &mu;L</td><td>MidSci</td><td>AV1250-H</td><td>Meerdere stappen</td></tr><tr><td>Filtertip 20 &mu;L</td><td>VWR</td><td>10017-064</td><td>Meerdere stappen</td></tr><tr><td>Filtertip 200 &mu;L</td><td>VWR</td><td>10017-068</td><td>Meerdere stappen</td></tr><tr><td>Formaline gebufferde oplossing (10%)</td><td>Sigma</td><td>F04586</td><td>Lesie plug dissectie</td></tr><tr><td>Hemacytometer (INCYTO; Wegwerp)</td><td>SKC FILMS</td><td>DHCN015</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Hematoxyline</td><td>Vector Hematoxyline</td><td>H-3401</td><td>Histologische anlaysis</td></tr><tr><td>Humain plasma fibronectine gezuiverd eiwit (1mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>FC010-10MG</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Waterstofperoxide oplossing (30% w/w)</td><td>Sigma</td><td>H1009</td><td>Histologische anlaysis</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td></td><td></td><td>Analyse</td></tr><tr><td>Isofluraan, USP</td><td>Akorn Animal Health</td><td>59399-106-01</td><td>Subcutane injectie</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat heptahydraat (MgSO4.7H2O)</td><td>Sigma</td><td>M1880-500G</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Basement Membrane Matrix (Phenol Red-Free; LDEV-free)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td>Subcutane injectie</td></tr><tr><td>Microcentrifugebuis (1,5 mL)</td><td>VWR</td><td>87003-294</td><td>EC-scheiding</td></tr><tr><td>Microscoopglas Superfrost (75mm X 25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>1255015-CS</td><td>Histologische anlaysis</td></tr><tr><td>Naalden, 26G x 5/8 inch Sub-Q steriele naalden</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD305115</td><td>Subcutane injectie</td></tr><tr><td>Normaal paardenserum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-2000</td><td>Histologische anlaysis</td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine-L-Glutamine (100X)</td><td>Corning</td><td>30-009-CI</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Permanent montagemedium (VectaMount)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000</td><td>Histologische anlaysis</td></tr><tr><td>Pestle Maat C, Gewoon</td><td>Thomas Scientific</td><td>3431F55</td><td>EC isolatie</td></tr><tr><td>Fosfaat Buffered Saline (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3994</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>VWR</td><td>65500-202</td><td>Subcutane injectie</td></tr><tr><td>Serologische pipetten (10 ml)</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Serologische pipetten (5ml)</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Natriumcarbonaat (Na2CO3)</td><td>Sigma</td><td>223530</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Streptavidine, Mierikswortel Peroxidase, Geconcentreerd, voor IHC</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-5004</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Spuit (60ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309653</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>SPUITFILTER (0,2 &micro;M)</td><td>Corning</td><td>431219</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Spuiten (1 mL met Luer Lock)</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>BD-309628</td><td>Subcutane injectie</td></tr><tr><td>Weefselcultuur-behandelde plaat (100 X 20 mm)</td><td>Greiner</td><td>664160</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Weefselcultuur-behandelde plaat (145X20 mm)</td><td>Greiner</td><td>639160</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Weefselcultuur-behandelde platen (60 X 15) mm</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td>Celcultuur</td></tr><tr><td>Tris-base (Trizma base)</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Histologische anlayis</td></tr><tr><td>Trypan Blauw Oplossing (0,4 %)</td><td>Life Technologies</td>

een patiënt-afgeleide xenograft model voor veneuze misvorming

A Patient-Derived Xenograft Model for Venous Malformation

Veneuze misvorming (VM) is een vasculaire anomalie die voortvloeit uit een verminderde ontwikkeling van het veneuze netwerk, wat resulteert in verwijde en vaak disfunctionele aderen. Het doel van dit artikel is om zorgvuldig te beschrijven de oprichting van een murine xenograft model dat menselijke VM nabootst en in staat is om patiënt heterogeniteit weerspiegelen. Hyperactiverende niet-erfelijke (somatische) TEK (TIE2) en PIK3CA mutaties in endotheelcellen (EC) zijn geïdentificeerd als de belangrijkste drijfveren van pathologische vaartuiguitbreiding in VM. Het volgende protocol beschrijft de isolatie, zuivering en uitbreiding van door de patiënt afgeleide EC die mutant TIE2 en/of PIK3CA uitdrukt. Deze EC worden onderhuids geïnjecteerd in de rug van immunodeficiënte athymische muizen om extatische vasculaire kanalen te genereren. Laesies gegenereerd met TIE2 of PIK3CA-mutant EC zijn zichtbaar gevasculariseerd binnen 7\u20129 dagen na injectie en recapituleren histopathologische kenmerken van VM-patiëntweefsel. Dit VM xenograft model biedt een betrouwbaar platform om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken die vm-vorming en -expansie stimuleren. Bovendien zal dit model een belangrijke rol spelen bij translationele studies die de werkzaamheid van nieuwe kandidaat-geneesmiddelen testen om de abnormale uitbreiding van het vz..

Dit protocol beschrijft het proces van het genereren van een murine xenograft model van VM op basis van de onderhuidse injectie van patiënt-afgeleide EC in de achterkant van immunodeficiënte naakt muizen. Endotheelcelkolonies kunnen binnen 4 weken na de eerste celisolatie van VM-weefsel of lesional bloed worden geoogst(figuur 1A,B). De dag na injectie bedekt de xenograftlaesieplug een oppervlakte van ongeveer 80\u2012100 mm2. In onze handen worden laesiepluggen met TIE2/PIK3CA-mutant EC zichtb...

We presenteren een gedetailleerd protocol om een murine xenograft model van veneuze misvorming te genereren. Dit model is gebaseerd op de onderhuidse injectie van patiënt-afgeleide endotheelcellen die hyper-activerende TIE2 en/of PIK3CA genmutaties bevatten. Xenograftlaesies vatten de histopathologische kenmerken van VM-patiëntweefsel nauwkeurig samen.

Een patiënt-afgeleide Xenograft Model voor veneuze misvorming

Venous malformation (VM) is a vascular anomaly that arises from impaired development of the venous network resulting in dilated and often dysfunctional ...

Dit protocol kan worden gebruikt om patiënt-afgeleide xenografts te creëren die de histopathologie van veneuze misvormingen samenvatten. Dit mocht verder onze preklinische therapeutische testen uitvoeren. Deze techniek biedt een snel en betrouwbaar NVivo-systeem dat het mogelijk maakt om dagelijks de groei van directe endotheelcellen van de patiënt en de respons op experimentele therapie te monitoren.Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast om andere soorten vasculaire of lymfeafwijkingen te onderzoeken. Begin met het voorbereiden van de celsuspensie voor injectie. Probeer de endotheelcellen met vijf milliliter voorverwarmde 0,05% tripsin-EDTA twee minuten lang bij 37 graden Celsius.Neutraliseer de tripsin en door het toevoegen van vijf milliliter EGM en verzamel de cellen in 150 milliliter conische buis. Centrifuge het tot 400 keer G gedurende vijf minuten dan aspirate de supernatant en resuspend de cellen in drie milliliter egm. Tel de cellen met een hemocytometer.Waag het volume met het gewenste celnummer in een nieuwe conische buis van 50 milliliter en pellet de cellen opnieuw door centrifugatie. Aspirate de supernatant waardoor een klein volume om de cel pellet los te maken. Resuspend de celpellet met 220 microliter BMEM per injectie.Meng de cel suspensie grondig op ijs om ervoor te zorgen dat het creëren van bellen te voorkomen. Aspirate de BMEM cel cultuur mix in een een milliliter spuit opening door het trekken van de zuiger. U vergrendelt een 26-meter steriele naald aan de spuit en houdt de voorbereide spuiten plat op ijs voorafgaand aan de injectie.Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de muis de muis goed verdoofd is, plaatst u deze op zijn maag en ontsmet het injectiegebied met 70% ethanol. Rol voorzichtig de voorbereide spuit om alle vaste cellen opnieuw op te stellen. Flake bubbels aan het einde van de spuit en verdrijven een klein volume van de cel suspensie.Knijp de huid op de injectieplaats om een tentachtige structuur te creëren. Steek vervolgens de naald recht onder de huid en zorg ervoor dat de naald is alleen de huid diep door het vrijgeven van pinch huid om injectie in spierweefsel te voorkomen. Houd de naald gestaag zorgvuldig injecteren 200 microliter van de cel suspensie om een kleine bolvormige massa te creëren.Zorg ervoor dat u de celsuspensie niet in de spier injecteert. Meet de lengte en breedte van elke stekker met een remklauw. Lijn de ontleede xenograft pluggen op een snijplank naast een liniaal en neem een beeld om de grove vasculariteit van de laesies op te nemen.Bevestig vervolgens de stekkers door ze 's nachts onder te dompelen in 10% formaline bij kamertemperatuur. Na ontleding worden de laesiepluggen verwerkt voor histologische analyse en gekleurd voor UEA-1 om menselijke afgeleide endotheelcellen in de stekker te detecteren. Neem vijf HPF-beelden per laesiesectie met een heldere veldmicroscoop bij vergroting van 20 x in een X-vlakpatroon binnen de laesiesectie om overlap te voorkomen.Zorg ervoor dat u een schaalbalk op de gemaakte afbeeldingen opneemt. Open de HPF-afbeeldingen in beeld J.To kalibreer de pixels van de schaalbalk, gebruik het gereedschap Rechte lijn en ga over de schaalbalk. Zet vervolgens de gemeten pixels om in millimeters door te klikken op Schalen analyseren en instellen.Klik vervolgens op Metingen instellen analyseren en selecteer gebied en voeg toe aan overlay. Meet het totale veldoppervlak van de HPF met behulp van analyseren en meten opslaan van deze meting voor kwantificering. Met behulp van de vrije hand selecties tool handmatig schetsen van de UEA-1 positieve vasculaire kanaal.Klik op Analyseren en meten om het geschetste gebied te kwantificeren. Meet alle vasculaire kanalen binnen de HPF. Herhaal het proces voor de vijf HPF die in elke sectie zijn genomen en breng de waarden over naar Excel voor verdere analyse.Bereken vervolgens het percentage vasculaire oppervlakte en vasculaire dichtheid volgens de hand van manuscriptaanwijzingen. Met behulp van dit protocol worden de laesiepluggen met TIE2 of PIK3CA hyperactieve mutantendotheelcellen zichtbaar gevasculariseerd en geperfundeerd binnen zeven tot negen dagen na injectie. De laesiepluggen lijken sterk op de histopathologische kenmerken van menselijk VM-weefsel en grote vasculaire kanalen uitgelijnd door een dunne laag endotheelcellen zijn zichtbaar.Deze vasculaire structuren bevatten meestal erytrocyten die functionele anastomose bevestigen met de vasculatuur van de gastheermuis. Immunohistochemische kleuring met behulp van de menselijke specifieke lectine UEA-1 bevestigt dat de cellen voering vasculaire gebieden zijn afgeleid van menselijke geïmplanteerde cellen in plaats van muis vasculatuur. Na deze procedure kan extra kleuring van laesiesecties voor markers van proliferatie of apoptose worden uitgevoerd om specifieke effecten van experimentele behandelingen te analyseren.Dit scenografische model is gebruikt voor preklinische studies van nieuwe therapieën voor veneuze misvorming, zoals de mTOR-remmer rapamycine, die werkzaamheid heeft aangetoond in verschillende klinische studies voor VM-patiënten.

a-patient-derived-xenograft-model-for-venous-malformation

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

In this video, human-derived melanoma cells are implanted subcutaneously into the flank region of an immunocompromised mouse. The PDX model allows preclinical investigation of melanoma cells that better recapitulate the tumor heterogeneity and melanoma aggressiveness observed in in vivo conditions.

Patient-derived Xenograft Modeling: A Technique to Generate Melanoma Mouse Models

We beschrijven een methode waarbij een betrouwbaar model van cerebrale veneuze hypertensie bij volwassen muizen. Dit model wordt algemeen beschreven en getest in de rat. Deze nieuwe tegenhanger in de muizen opent de mogelijkheid om genetische gemodificeerde dieren en daardoor verbreedt de toepassing van het model.

Volwassen muis Veneuze Hypertensie Model: halsslagader op externe halsader Anastomosis.

Vascularisatie is de sleutel tot een succesvolle aanpak in de tissue engineering. Daarom zijn betrouwbare technologieën die voor de ontwikkeling van vasculaire netwerken in weefsel-constructen evalueren. Hier presenteren we een eenvoudige en kosteneffectieve manier te visualiseren en kwantificeren vascularisatie in vivo.

Een Full Skin Defect model te evalueren Vascularisatie Biomaterialen<em&gt; In Vivo</em

Om onze kennis van cellulaire en moleculaire neotissue vorming te verbeteren, werd een muizenmodel van het TEVG recent ontwikkelde. De transplantaten werden geïmplanteerd infrarenale vena cava tussenvoeging enten in C57BL / 6 muizen. Dit model behaalt dezelfde resultaten als die bereikt bij onze klinische onderzoek, maar over een veel kortere tijd-cursus.

Implantatie van de vena cava inferior Interpositie Graft in muismodel

We beschrijven een microchirurgische benadering voor het genereren van een arterioveneuze (AV) -lus als model voor het analyseren van vascularisatie in vivo in een geïsoleerd en goed gekarakteriseerd omgeving. Dit model is niet alleen nuttig voor het onderzoek naar angiogenese, maar ook optimaal geschikt voor engineering axiaal gevasculariseerd en transplantable weefsels.

De arterioveneuze (AV) Loop in een klein proefdiermodel voor Angiogenese en Gevasculariseerd Tissue Engineering Studie

Deze video demonstreert een model om de ontwikkeling van myointimale hyperplasie na veneuze interpositiechirurgie bij ratten te bestuderen.

Vein Interpositie Model: Een geschikt model om te studeren Bypass Graft Patency

Patiënten-afgeleide xenotransplantaatmodellen is (PDX) modellen meer robuust even melanoom moleculaire en biologische kenmerken en zijn meer voorspellend van therapie respons in vergelijking met traditionele kunststof weefselcultuur gebaseerde assays. Hier beschrijven we ons standaard Besturingsprotocol voor de oprichting van nieuwe PDX-modellen en de karakterisatie/experimenten van bestaande PDX-modellen.

Een melanoom patiënt-afgeleide xenograft model

Een aortocaval fistel werd gecreëerd door het prikken van de Murine infra-nieraorta door beide muren in de inferieure Vena Cava en werd gevolgd door het creëren van een stenose in zijn uitstroom via gedeeltelijke ligatie van de inferieure vena cava. Dit reproduceerbare model kan worden gebruikt om centraal veneuze stenose te bestuderen.

Murine model van centraal veneuze stenose met behulp van Aortocaval fistel met een uitstroom stenose

Het huidige protocol is gericht op het experimenteel creëren van veneuze intimale hyperplasie door het onderwerpen van aderen aan arteriële bloeddruk voor het ontwikkelen van strategieën om veneuze intimale hyperplasie te verzachten na revascularisatie chirurgie met behulp van adergrafts.

Een konijn veneuze interposition model nabootsen revascularisatie chirurgie met behulp van ader grafts te beoordelen Intimal Hyperplasie onder arteriële bloeddruk

We beschrijven een xenograft muismodel van borstkanker hersenmetastase gegenereerd via staart-ader injectie van een endogene HER2-versterkte inflammatoire borstkankercellijn.

Modellering van hersenmetastase via staartaderinjectie van inflammatoire borstkankercellen

In dit protocol werd nieuwe varkensaderbypass-enting uitgevoerd via een kleine incisie in de linkerborstwand zonder cardiopulmonale bypass. Er werd een postoperatief pathologisch onderzoek gedaan, dat intimale verdikking aantoonde.

Vaststelling en evaluatie van een model voor varkensaderziekte

Leer een patiënt-afgeleid xenograftmodel voor veneuze misvormingen met endotheelcellen. Deze methode maakt dagelijkse monitoring van celgroei en therapierespons mogelijk voor preklinisch onderzoek.

Een patiënt-afgeleide Xenograft Model voor veneuze misvorming

Meer video's verkennen