Systeemanalyse van de neuro-inflammatoire en hemodynamische respons op traumatisch hersenletsel

Deze methoden kunnen worden gebruikt om neuro-inflammatoire en hemodynamische reacties op hersenletsel te karakteriseren als onderdeel van een multivariate systeemanalyse met behulp van partiële regressie van de kleinste kwadraten. Deze technieken worden gebruikt om meer een holistisch beeld te geven van de reactie van de hersenen op letsel. Om een verwonding te veroorzaken, bevestigt u een gebrek aan reactie op teenknijpen bij een verdoofde muis en plaatst u de muis in de buikligging op het midden van een dun membraan.

Gebruik beide handen om het geleerde weefsel vast te houden, zet de staart van de muis onder een duim en plaats de muiskop onder de geleidebuis. Wanneer de muis in positie is, gericht op de impact tussen de achterkant van de ogen en de voorkant van de oren, laat u de bout van de bovenkant van de geleidebuis op het dorsale aspect van het hoofd van de muis vallen. Bij impact zal de muis door het weefsel breken, waardoor een snelle versnelling van het hoofd rond de nek mogelijk is.

Laat de muis na de verwonding in rugligging herstellen op een opwarmkussen van 37 graden Celsius. Na een stabilisatieperiode van twee minuten laat u de DCS-sensor voorzichtig over de rechterhersenhelft van de schedel van de muis rusten, zodat de bovenrand van de optische sensor op één lijn ligt met de achterkant van het oog en de zijkant van de sensor langs de middellijn. Geef de sensor een hand om deze af te schermen van ruimtelicht en ontvang vijf seconden aan gegevens.

Verplaats vervolgens de sensor over de linkerhersenhelft en verkrijg vijf seconden gegevens over de linkerhersenhelft. Om de productie van gemultiplext cytokine en fosfo-eiwit te beoordelen, voegt u 150 microliter gemengde lysisbuffer toe per ongeveer drie milligram geoogst dierlijk hersenweefsel. En gebruik een pipetpunt van 1.000 microliter om het weefsel 15 tot 20 keer mechanisch te tritureren.

Plaats de gehomogeniseerde monsters gedurende 30 minuten op een rotator bij vier graden Celsius voordat u het weefselafval verzamelt door centrifugeren. Breng de supernatanten over in nieuwe buizen en centrifugeer de monsters om het resterende neerslag te verwijderen. Breng de supernatanten over naar nieuwe buizen en bepaal de eiwitconcentratie door BCA-assay volgens standaardprotocollen.

Bereid 25 microliter van elk monster voor bij de optimale eiwitconcentratie zoals bepaald door de lineaire bereikanalyse in nieuwe buizen. Gebruik van assaybuffer om het totale volume van elk monster te normaliseren tot 25 microliter. Om een testplaat te bereiden, voegt u 200 microliter wasbuffer toe aan elke put van een bord met 96 putten en schudt u de plaat gedurende 10 minuten op een shaker met 750 omwentelingen per minuut.

Decanteer aan het einde van de incubatie de wasbuffer en tik de plaat op een papieren handdoek om eventuele resten te verwijderen. Voeg vervolgens 25 microliter testbuffer toe aan elke put, gevolgd door 25 extra microliter buffer aan de achtergrondputten. Voeg 25 microliter van de verdunde monsters toe aan de juiste monsterputten en draai de via van gemultiplexte magnetische kralen gedurende één minuut, voordat u 25 microliter van de grondig opnieuw gesuspendeerde kralen aan elke put toevoegt.

Wanneer alle kralen zijn toegevoegd, sluit u de plaat af met een platensealer en bedekt u de plaat met folie voor een nachtelijke incubatie met schudden bij twee tot acht graden Celsius. Plaats de volgende ochtend de plaat op een magnetische afscheider en zorg ervoor dat de putten zijn uitgelijnd met de magneten. Decanteer na twee minuten de inhoud van de put met de plaat nog steeds bevestigd aan de magnetische separator en voeg 200 microliter wasbuffer toe aan elke put.

Nadat u het twee minuten hebt laten schudden, plaatst u de plaat gedurende twee minuten op de magnetische afscheider. Decanteer vervolgens de inhoud van de put met de plaat nog steeds bevestigd aan de magnetische separator en was de plaat met een verse 200 microliter wasbuffer per put, zoals zojuist is aangetoond. Voeg na de tweede wasbeurt 25 microliter detectieantilichaam per put toe en bedek opnieuw met folie gedurende een incubatie van een uur met 750 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur.

Voeg aan het einde van de incubatie 25 microliter streptavidin phycoerythrin toe aan elke put en breng de plaat nog eens 30 minuten bij kamertemperatuur terug naar de shaker. Plaats de plaat aan het einde van de incubatie twee minuten op de magnetische afscheider voordat u de inhoud van de put decanteert. Was de plaat twee keer met 200 microliter verse wasbuffer per wasbeurt en voeg 75 microliter van de juiste aandrijfvloeistof toe aan elke put.

Hang vervolgens de kralen opnieuw op de platenschudder gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en lees de platen op de analysator volgens de instructies van de fabrikant. In deze analyse werd de cerebrale bloedstroom gemeten met diffuse correlatiespectroscopie vier uur na het laatste letsel. De cerebrale bloedstroomindex en de gemiddelde cerebrale stroomindex voor elke hemisfeer kunnen dan worden bepaald.

Een lineaire bereikanalyse kan worden uitgevoerd om een geschikte eiwitbelastingsmassa te bepalen voordat gegevens van alle monsters worden verzameld. Cytokinegegevens kunnen worden voorbereid door de achtergrondmetingen af te trekken van de steekproefgegevens en vervolgens de Z-scoregegevens voor elke anolyt te berekenen. Partiële kleinste kwadratenregressie kan worden uitgevoerd met behulp van een fagocyt microgliale activeringsmarker of andere variabele van belang als de responsvariabele en de cytokinemetingen als de predictorvariabelen.

Varimax-rotatie kan worden uitgevoerd om de covariantie van de gegevens op latente variabele één te maximaliseren, met de activeringsmarkermetingen. Hoge belastingsgewichten in latente variabele één komen overeen met de cytokine-expressies die het meest geassocieerd zijn met een hoge expressie van de activeringsmarker. Lineaire regressies tussen de activeringsmarker en cytokines illustreren dat die cytokines met de grootste belastingsgewichten in latente variabele één ook statistisch significant waren voor deze analyse.

Hoewel we dit protocol hebben gericht op traumatisch hersenletsel, zijn deze methoden op grote schaal generaliseerbaar voor de studie van een overvloed aan pathologische aandoeningen die de hersenen beïnvloeden. We gebruiken deze technieken om ons te helpen bij het identificeren van verhandelbare doelen om te moduleren in toekomstige experimenten om causale mechanistische relaties vast te stellen en uiteindelijk met het doel om nieuwe therapeutische strategieën voor mild traumatisch hersenletsel te ontwikkelen.