Name: Systeemanalyse van de neuro-inflammatoire en hemodynamische respons op traumatisch hersenletsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-27T13:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Leer een systeemanalyse van neuro-inflammatoire en hemodynamische reacties op traumatisch hersenletsel bij muizen. Deze methode integreert diffuse correlatiespectroscopie en cytokine-multiplexing voor holistisch inzicht.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door de National Institutes of Health R21 NS104801 (EMB) en R01 NS115994 (LBW/EB) en Children's Healthcare of Atlanta Junior Faculty Focused Award (EMB). Dit werk werd ook ondersteund door het Amerikaanse ministerie van Defensie via de congressionally directed medical research programs onder Award No. W81XWH-18-1-0669 (LBW/EMB). Meningen, interpretaties, conclusies en aanbevelingen zijn die van de auteur en worden niet noodzakelijkerwijs onderschreven door het ministerie van Defensie. Dit materiaal is gebaseerd op werk dat wordt ondersteund door het National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program onder Grant No. 1937971. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden uitgedrukt, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de National Science Foundation.

<ol><li>Langlois, J. A., Rutland-Brown, W., Wald, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epidemiology+and+impact+of+traumatic+brain+injury%3A+a+brief+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Head+Trauma+Rehabilitation%22%5BJournal%5D)">The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview.</a> Journal of Head Trauma Rehabilitation. 21 (5), 375-378 (2006).</li>
<li>Iraji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+State+Functional+Connectivity+in+Mild+Traumatic+Brain+Injury+at+the+Acute+Stage%3A+Independent+Component+and+Seed-Based+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Resting State Functional Connectivity in Mild Traumatic Brain Injury at the Acute Stage: Independent Component and Seed-Based Analyses.</a> Journal of Neurotrauma. 32 (14), 1031-1045 (2015).</li>
<li>Guskiewicz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cumulative+effects+associated+with+recurrent+concussion+in+collegiate+football+players%3A+the+NCAA+Concussion+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">Cumulative effects associated with recurrent concussion in collegiate football players: the NCAA Concussion Study.</a> Journal of the American Medical Association. 290 (19), 2549-2555 (2003).</li>
<li>Longhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+window+of+vulnerability+to+repetitive+experimental+concussive+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury.</a> Neurosurgery. 56 (2), 364-374 (2005).</li>
<li>Committee on Sports-Related Concussions in Youth, Board on Children, Youth, and Families, Institute of Medicine, National Research Council. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Sports-Related+Concussions+in+Youth%3A+Improving+the+Science%2C+Changing+the+Culture%22">Sports-Related Concussions in Youth: Improving the Science, Changing the Culture</a>. , National Academies Press (US). Washington (DC). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK169016/ (2014).</li>
<li>Barkhoudarian, G., Hovda, D. A., Giza, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Pathophysiology+of+Concussive+Brain+Injury+-+an+Update%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Medicine+and+Rehabilitation+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">The Molecular Pathophysiology of Concussive Brain Injury - an Update.</a> Physical Medicine and Rehabilitation Clinics of North America. 27 (2), 373-393 (2016).</li>
<li>McCrory, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+statement+on+concussion+in+sport--the+4th+International+Conference+on+Concussion+in+Sport+held+in+Zurich%2C+November+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+Sport+Medicine%22%5BJournal%5D)">Consensus statement on concussion in sport--the 4th International Conference on Concussion in Sport held in Zurich, November 2012.</a> Clinical Journal of Sport Medicine. 23 (2), 89-117 (2012).</li>
<li>Belanger, H. G., Vanderploeg, R. D., Curtiss, G., Warden, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+neuroimaging+techniques+in+mild+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropsychiatry+and+Clinical+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Recent neuroimaging techniques in mild traumatic brain injury.</a> Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 19 (1), 5-20 (2007).</li>
<li>Sours, C., Zhuo, J., Roys, S., Shanmuganathan, K., Gullapalli, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+in+Resting+State+Functional+Connectivity+and+Cerebral+Blood+Flow+in+Mild+Traumatic+Brain+Injury+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Disruptions in Resting State Functional Connectivity and Cerebral Blood Flow in Mild Traumatic Brain Injury Patients.</a> PLoS ONE. 10 (8), 0134019(2015).</li>
<li>Buckley, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+Microvascular+Cerebral+Blood+Flow+Assessed+by+Diffuse+Correlation+Spectroscopy+after+Repetitive+Concussions+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Decreased Microvascular Cerebral Blood Flow Assessed by Diffuse Correlation Spectroscopy after Repetitive Concussions in Mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35 (12), 1995-2000 (2015).</li>
<li>Sankar, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cerebral+blood+flow+is+a+non-invasive+biomarker+of+neuroinflammation+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Low cerebral blood flow is a non-invasive biomarker of neuroinflammation after repetitive mild traumatic brain injury.</a> Neurobiology of Disease. 124, 544-554 (2019).</li>
<li>Vagnozzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+window+of+metabolic+brain+vulnerability+to+concussions%3A+mitochondrial-related+impairment--part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Temporal window of metabolic brain vulnerability to concussions: mitochondrial-related impairment--part I.</a> Neurosurgery. 61, 379-388 (2007).</li>
<li>Longhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+window+of+vulnerability+to+repetitive+experimental+concussive+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Temporal window of vulnerability to repetitive experimental concussive brain injury.</a> Neurosurgery. 56, 364-374 (2005).</li>
<li>Fujita, M., Wei, E. P., Povlishock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intensity-+and+interval-specific+repetitive+traumatic+brain+injury+can+evoke+both+axonal+and+microvascular+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Intensity- and interval-specific repetitive traumatic brain injury can evoke both axonal and microvascular damage.</a> Journal of Neurotrauma. 29, 2172-2180 (2012).</li>
<li>Angoa-Perez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+sports-related+head+injury%3A+bridging+the+gap+between+preclinical+research+and+clinical+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Animal models of sports-related head injury: bridging the gap between preclinical research and clinical reality.</a> Journal of Neurochemistry. 129, 916-931 (2014).</li>
<li>Prins, M. L., Hales, A., Reger, M., Giza, C. C., Hovda, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+traumatic+brain+injury+in+the+juvenile+rat+is+associated+with+increased+axonal+injury+and+cognitive+impairments%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Repeat traumatic brain injury in the juvenile rat is associated with increased axonal injury and cognitive impairments.</a> Developmental Neuroscience. 32, 510-518 (2010).</li>
<li>Viano, D. C., Hamberger, A., Bolouri, H., Saljo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concussion+in+professional+football%3A+animal+model+of+brain+injury--part+15%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Concussion in professional football: animal model of brain injury--part 15.</a> Neurosurgery. 64, 1162-1173 (2009).</li>
<li>Kane, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+human+repetitive+mild+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury.</a> Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).</li>
<li>Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Recovery+Time+Between+Injuries+Improves+Cognitive+Outcome+After+Repetitive+Mild+Concussive+Brain+Injuries+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Increasing Recovery Time Between Injuries Improves Cognitive Outcome After Repetitive Mild Concussive Brain Injuries in Mice.</a> Neurosurgery. 71 (4), 885-892 (2012).</li>
<li>Durduran, T., Yodh, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+correlation+spectroscopy+for+non-invasive%2C+micro-vascular+cerebral+blood+flow+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Diffuse correlation spectroscopy for non-invasive, micro-vascular cerebral blood flow measurement.</a> NeuroImage. 85, 51-63 (2014).</li>
<li>Sathialingam, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+separation+diffuse+correlation+spectroscopy+for+measurement+of+cerebral+blood+flow+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Small separation diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow in rodents.</a> Biomedical Optics Express. 9 (11), 5719(2018).</li>
<li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+optical+assessment+of+resting-state+cerebral+blood+flow+in+children+with+sickle+cell+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Noninvasive optical assessment of resting-state cerebral blood flow in children with sickle cell disease.</a> Neurophotonics. 6 (03), 1(2019).</li>
<li>Wang, H., Liu, Q., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+partial+least-squares+regression+models+with+VARIMAX+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Partial+Least+Squares%22%5BJournal%5D)">Interpretation of partial least-squares regression models with VARIMAX rotation.</a> Partial Least Squares. 48 (1), 207-219 (2005).</li>
<li>Eriksson, L., Byrne, T., Johansson, E., Trygg, J., Vikström, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-+and+Megavariate+Data+Analysis+Basic+Principles+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Umetrics+Academy%22%5BJournal%5D)">Multi- and Megavariate Data Analysis Basic Principles and Applications.</a> Umetrics Academy. , (2013).</li>
<li>Conzen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+and+regional+hemodynamics+of+isoflurane+and+sevoflurane+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesia+and+Analgesia%22%5BJournal%5D)">Systemic and regional hemodynamics of isoflurane and sevoflurane in rats.</a> Anesthesia and Analgesia. 74 (1), 79-88 (1992).</li>
<li>Durduran, T., Choe, R., Baker, W. B., Yodh, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+optics+for+tissue+monitoring+and+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Reports+on+Progress+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Diffuse optics for tissue monitoring and tomography.</a> Reports on Progress in Physics. 73 (7), 076701(2010).</li>
<li>Lee, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+separation+frequency-domain+near-infrared+spectroscopy+for+the+recovery+of+tissue+optical+properties+at+millimeter+depths%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Small separation frequency-domain near-infrared spectroscopy for the recovery of tissue optical properties at millimeter depths.</a> Biomedical Optics Express. 10 (10), 5362-5377 (2019).</li>
<li>Bertrand, F., Maumy-Bertrand, M. plsRglm: Partial Least Squares Regression for Generalized Linear Models. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm">https://CRAN.R-project.org/package=pplsRglm</a> (2019).</li>
<li>White, B. R., Bauer, A. Q., Snyder, A. Z., Schlaggar, B. L., Lee, J. M., Culver, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+functional+connectivity+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Imaging of functional connectivity in the mouse brain.</a> PLoS One. 6, 16322(2011).</li>
<li>Buckley, E. M., Parthasarathy, A. B., Grant, P. E., Yodh, A. G., Franceschini, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+correlation+spectroscopy+for+measurement+of+cerebral+blood+flow%3A+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Diffuse correlation spectroscopy for measurement of cerebral blood flow: future prospects.</a> Neurophotonics. 1 (1), 011009(2014).</li>
<li>Rowan, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrovascular+reactivity+measured+in+awake+mice+using+diffuse+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Cerebrovascular reactivity measured in awake mice using diffuse correlation spectroscopy.</a> Neurophotonics. 8 (1), (2021).</li>
<li>Tate, J., Ward, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferences+in+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist.+Reviews%22%5BJournal%5D)">Interferences in immunoassay.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 25 (2), 105-120 (2004).</li>
<li>Staples, E., Ingram, R. J. M., Atherton, J. C., Robinson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimising+the+quantification+of+cytokines+present+at+low+concentrations+in+small+human+mucosal+tissue+samples+using+Luminex+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays.</a> Journal of Immunological Methods. 394 (1-2), 1-9 (2013).</li>
<li>Gierut, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network-level+effects+of+kinase+inhibitors+modulate+TNF-%CE%B1-induced+apoptosis+in+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Network-level effects of kinase inhibitors modulate TNF-α-induced apoptosis in the intestinal epithelium.</a> Science Signaling. 8 (407), 129(2015).</li>
</ol>

Hierin beschrijven we methoden voor de beoordeling van de hemodynamische en neuro-inflammatoire respons op repetitief mild traumatisch hersenletsel. Verder hebben we laten zien hoe we deze gegevens kunnen integreren als onderdeel van een multivariate systeemanalyse met behulp van partiële kleinste kwadratenregressie. In de onderstaande tekst zullen we enkele van de belangrijkste stappen en beperkingen in verband met het protocol bespreken, evenals de voor- / nadelen van de methoden ten opzichte van bestaande methoden.</p...

Overzicht Mild traumatisch hersenletsel (mTBIs) impact ~ 1,6-3,8 miljoen atleten per jaar1. Deze verwondingen, waaronder sub-hersenschudding en hersenschudding, kunnen patiënten achterlaten met voorbijgaande fysieke, emotionele, psychologische en cognitieve symptomen2. Bovendien kan repetitieve mTBI (rmTBI) binnen een "venster van kwetsbaarheid" leiden tot cumulatieve ernst en duur van cognitieve gevolgen die langer duren dan de effecten van een enkele mTBI alleen3, en uiteindelijk zelfs tot permanent verlies van functie 4,5,6. Hoewel veel patiënten binnen een relatief kort tijdsbestek (<1 week) herstellen, lijdt 10-40% van de patiënten aan langdurigere effecten van mTBI gedurende > 1 maand, waarvan sommige tot 1 jaarduren 3,7,8,9. Ondanks de hoge prevalentie en blijvende gevolgen van deze verwondingen, zijn letselmechanismen slecht begrepen en bestaan er geen effectieve behandelingsstrategieën.
Gezien de hoge variabiliteit in uitkomsten na mTBI/rmTBI, is een uitdaging bij het identificeren van moleculaire triggers in een vroeg stadium van weefsel verkregen in terminale mTBI/rmTBI-studies het gebrek aan longitudinale gegevens die definitieve "acute moleculaire verbanden" van deze moleculaire triggers met resultaten op langere termijn aantonen. Om deze uitdaging te overwinnen, heeft onze groep ontdekt dat een acuut verminderde cerebrale bloedstroom, acuut gemeten met behulp van een optisch hulpmiddel genaamd diffuse correlatiespectroscopie (DCS), sterk correleert met cognitieve resultaten op langere termijn in een muismodel van rmTBI10. Met behulp van deze hemodynamische biomarker toonden we aan dat muizen met een acuut lage cerebrale bloedstroom (en, bij uitbreiding, slechter voorspelde langetermijnresultaten) gelijktijdige acute toenames hebben in neuronale fosfo-signalering binnen zowel MAPK- als NFκB-routes, toename van neuronale expressie van pro-inflammatoire cytokines en toename van expressie van de fagocyt / microgliale marker Iba111 . Deze gegevens suggereren een mogelijke rol voor neuronale fosfo-signalering, cytokine-expressie en microgliale activering in zowel de acute regulatie van cerebrale bloedstroom na letsel als bij het activeren van een signaalcascade die leidt tot neuronale disfunctie en slechtere cognitieve resultaten. Hierin beschrijven we onze aanpak om tegelijkertijd zowel de hemodynamische als neuro-inflammatoire omgeving na rmTBI te onderzoeken en hoe deze complexe datasets te integreren. In het bijzonder schetsen we procedures voor vier belangrijke stappen in deze alomvattende aanpak: (1) een weight-drop model van mild traumatisch hersenletsel, (2) beoordeling van de cerebrale bloedstroom met diffuse correlatiespectroscopie, (3) kwantificering van de neuro-inflammatoire omgeving en (4) gegevensintegratie (figuur 1). Hieronder geven we een korte inleiding tot elk van deze belangrijke stappen om lezers te helpen bij het doorlopen van de redenering achter onze methoden. De rest van het manuscript biedt een gedetailleerd protocol voor elk van deze belangrijke stappen.
Weight-drop model van mild traumatisch hersenletsel Hoewel er veel uitstekende preklinische modellen van repetitieve milde TBI bestaan 12,13,14,15,16,17,18, gebruiken we een goed ingeburgerd en klinisch relevant weight-drop gesloten hoofdletselmodel. Belangrijke kenmerken van dit model zijn (1) stompe impact van de intacte schedel / hoofdhuid gevolgd door onbeperkte rotatie van het hoofd rond de nek, (2) geen openlijk structureel hersenletsel, oedeem, schade aan de bloed-hersenbarrière, acute celdood of chronisch hersenweefselverlies, en (3) aanhoudende (tot 1 jaar) cognitieve tekorten die pas na meerdere treffers19 optreden (figuur 2).
Beoordeling van de cerebrale bloedstroom met diffuse correlatiespectroscopie Diffuse correlatiespectroscopie (DCS) is een niet-invasieve optische techniek die de bloedstroommeet 5,20,21. Bij DCS wordt een nabij-infrarode lichtbron op het weefseloppervlak geplaatst. Een detector wordt op een vaste afstand van de bron op het weefseloppervlak geplaatst om licht te detecteren dat zich heeft vermenigvuldigd verspreid door het weefsel (figuur 3). Verstrooiing van bewegende rode bloedcellen zorgt ervoor dat de gedetecteerde lichtintensiteit met de tijd fluctueert. Een eenvoudig analytisch model dat bekend staat als correlatiediffusietheorie wordt gebruikt om deze intensiteitsfluctuaties te relateren aan een index van de bloedstroom (CBFi, figuur 4). Hoewel de eenheden van CBFi (cm2/s) niet de traditionele stroomeenheden zijn (ml/min/100 g), heeft een eerdere studie bij muizen aangetoond dat CBFi sterk correleert met de cerebrale bloedstroom gemeten door arteriële spin met het label MRI21.
Ter referentie, het DCS-instrument dat hier wordt gebruikt, is in eigen huis gebouwd en bestaat uit een 852 nm lange coherentie-lengtelaser, een array van 4 fotonen die lawinefotodiodes tellen en een hardware autocorrelatorbord (enkele tau, 8-kanaals, 100 ns minimale monstertijd)21,22. Gegevens worden verkregen met zelfgemaakte software geschreven in LabView. De dierlijke interface voor het apparaat bestaat uit een 400 μm multimode bronvezel (400-2200 nm golflengtebereik, pure silicakern, TECS Hard Cladding) en een 780 nm single mode detector fiber (780-970 nm golflengtebereik, pure silica core, TECS Hard Cladding, 730 ± 30 nm second mode cut-off) op 6 mm afstand van elkaar en ingebed in een zwarte 3D-geprinte sensor (4 mm x 8 mm, Figuur 3).
Kwantificering van de neuro-inflammatoire omgeving Hoewel neuro-inflammatie wordt gereguleerd door diverse cellulaire processen, zijn twee belangrijke relevante mechanismen extracellulaire signalering door cytokines / chemokines en intracellulaire signalering door fosfo-eiwitten. Om de neuro-inflammatoire omgeving van de hersenen na het letsel te onderzoeken, worden hersenen geëxtraheerd uit muizen, gemicrodisseceerd en cytokines / chemokines en fosfo-eiwitten worden gekwantificeerd met behulp van Luminex (figuur 5, figuur 6, figuur 7). Luminex multiplexed immunoassays maken gelijktijdige kwantificering van een diverse verzameling van deze eiwitten mogelijk door enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's) te koppelen aan fluorescerend gelabelde magnetische kralen. Verschillende fluorescerende tags worden gebruikt voor elk eiwit van belang, en kralen van elke tag worden gefunctionaliseerd met een capture-antilichaam tegen dat specifieke eiwit. Honderden kralen voor het vangen van elk eiwit worden gemengd, in een 96-putplaat geplaatst en geïncubeerd met monster. Na monsterincubatie wordt een magneet gebruikt om de kralen in de put te vangen terwijl het monster wordt uitgewassen. Vervolgens bindt gebiotinyleerd detectieantilichaam zich aan de analyt van belang om een antilichaam-antigeensandwich te vormen dat vergelijkbaar is met een traditionele ELISA, maar met de ELISA voor elk eiwit dat op een andere fluorescerend gelabelde kraal voorkomt. Het toevoegen van fycoerythrin-geconjugeerde streptavidin (SAPE) voltooit elke reactie. Het Luminex-instrument leest vervolgens de kralen en scheidt het signaal volgens elke fluorescerende tag / eiwit.
Data-integratie Vanwege het grote aantal analyten (bijvoorbeeld cytokines) gemeten in de Luminex-test, kan data-analyse moeilijk te interpreteren zijn als elk gekwantificeerd eiwit afzonderlijk wordt geanalyseerd. Om de analyse te vereenvoudigen en trends tussen analyten vast te leggen, gebruiken we een multivariate analysemethode genaamd partial least squares regression (PLSR, Figuur 8)23. PLSR werkt door het identificeren van een as van gewichten die overeenkomen met elk gemeten eiwit (d.w.z. cytokines of fosfo-eiwitten, aangeduid als "predictorvariabelen") die samen de co-variantie van de gemeten eiwitten met een responsvariabele (bijv. Cerebrale bloedstroom) optimaal verklaren. De gewichten worden "belastingen" genoemd en worden samengevoegd tot een vector die bekend staat als een latente variabele (LV). Door de gemeten eiwitgegevens op elk van de twee LP's te projecteren (aangeduid als "scoring"), kunnen de gegevens opnieuw worden uitgezet in termen van deze LVs. Na het berekenen van de PLSR gebruiken we een varimax-rotatie om een nieuwe LV te identificeren die de covariantie tussen de monsterprojecties op de LV en de predictorvariabele24 maximaliseert. Deze benadering stelt ons in staat om LV1 te definiëren als de as waarvoor de variantie van de responsvariabele het best kan worden verklaard. LV2 maximaliseert de co-variantie tussen de responsvariabele en LV1-restgegevens, die kunnen worden geassocieerd met biologische of technische variabiliteit tussen monsters. Ten slotte voeren we een Leave One Out Cross Validation (LOOCV) uit om ervoor te zorgen dat het PLSR-model niet sterk afhankelijk is van één monster23.
In dit protocol beschrijven we methoden om de neuro-inflammatoire en hemodynamische weefselrespons op mTBI te karakteriseren. De algemene workflow wordt beschreven in figuur 1. In dit protocol worden muizen onderworpen aan een of meer mTBIs met behulp van een gewichtsdruppel gesloten hoofdletselmodel. De cerebrale bloedstroom wordt in de lengterichting gemeten voor en op meerdere tijdstippen na het letsel. Op het moment van interesse voor ondervraging van neuro-inflammatoire veranderingen, wordt het dier geëuthanaseerd en worden de hersenen geëxtraheerd. Hersengebieden van belang worden geïsoleerd via microdissectie en vervolgens gelyseerd om eiwit te extraheren. Lysaten worden vervolgens gebruikt voor zowel Luminex multiplexed immunoassays van cytokine en fosfo-eiwit expressie als Western blot. Ten slotte wordt deze holistische dataset geïntegreerd met behulp van een partiële kleinste kwadratenregressieanalyse.

<table><tbody><tr><td>Adjustable pipettes</td><td></td><td></td><td>elke aanpasbare pipet</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td>VWR</td><td>89107-726</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Plex cell lysis kit</td><td>C Bio-Rad</td><td>171304012</td><td></td></tr><tr><td>BRAND BRANDplates pureGrade Microplates, Nonsterile</td><td>BrandTech</td><td>781602 96</td><td></td></tr><tr><td>Complete mini protease inhibitor tablet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td></td></tr><tr><td>Depilatory cream</td><td>Amazon</td><td>Nair</td><td></td></tr><tr><td>DiH2O</td><td>VWR</td><td>VWRL0200-1000</td><td></td></tr><tr><td>Handheld magnetic separator block for 96 well flat bottom plates</td><td>Millipore Sigma Catalogue</td><td>40-285</td><td></td></tr><tr><td>Hardware Autocorrelator Board</td><td>www.correlator.com</td><td>Flex05-8ch</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 250 mL</td><td>MED-VET INTERNATIONAL</td><td>RXISO-250</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe (11.2 x 21.3 cm)</td><td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory vortex mixer</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr><tr><td>LabView</td><td>National Instruments</td><td>LabVIEW</td><td></td></tr><tr><td>Luminex 200, HTS, FLEXMAP 3D, or MAGPIX with xPONENT software</td><td>Luminex Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminex Drive Fluid</td><td>Luminex</td><td>MPXDF-4PK</td><td></td></tr><tr><td>Luminex sheath fluid</td><td>EMD Millipore</td><td>SHEATHFLUID</td><td></td></tr><tr><td>MILLIPLEX MAP Mouse Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel - Premixed 32 Plex - Immunology Multiplex Assay</td><td>Millipore Sigma</td><td>MCYTMAG-70K-PX32</td><td></td></tr><tr><td>MILLIPLEX MAPK/SAPK Signaling 10-Plex Kit-Cell Signaling Multiplex Assay</td><td>Millipore Sigma</td><td>48-660MAG</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller rotator</td><td>VWR</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-1G</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>VWR</td><td>97064-158</td><td></td></tr><tr><td>Plate Sealer</td><td>VWR</td><td>82050-992</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene microfuge tubes</td><td>VWR</td><td>20901-547</td><td></td></tr><tr><td>Mini LabRoller</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z674591</td><td></td></tr><tr><td>Reagent Reservoirs</td><td>VWR</td><td>89094-668</td><td></td></tr><tr><td>R Programming Language</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RStudio</td><td>www.rstudio.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Titer plate shaker</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>1 m acrylic guide tube</td><td>McMaster-Carr</td><td>49035K85</td><td></td></tr><tr><td>4 photon counting avalanche photodiode</td><td>Perkin-Elmer</td><td>SPCM-AQ4C-IO</td><td></td></tr><tr><td>400 um multimode source fiber</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>FT-400-EMT</td><td></td></tr><tr><td>54 g bolt</td><td>Ace Hardware</td><td></td><td>0,95 cm basislichaam diameter, 2 cm hoofddiameter, 10,2 cm lengte</td></tr><tr><td>780 nm single mode detector fiber</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>780HP</td><td></td></tr><tr><td>852 nm long-coherence length laser</td><td>TOPTICA Photonics</td><td>iBeam smart</td><td></td></tr></tbody></table>

systeemanalyse van de neuro-inflammatoire en hemodynamische respons op traumatisch hersenletsel

Systems Analysis of the Neuroinflammatory and Hemodynamic Response to Traumatic Brain Injury

Licht traumatisch hersenletsel (mTBIs) is een belangrijk probleem voor de volksgezondheid. Herhaalde blootstelling aan mTBI kan leiden tot cumulatieve, langdurige functionele tekorten. Talrijke studies door onze groep en anderen hebben aangetoond dat mTBI cytokine-expressie stimuleert en microglia activeert, de cerebrale bloedstroom en het metabolisme vermindert en de cerebrovasculaire reactiviteit schaadt. Bovendien hebben verschillende werken een verband gemeld tussen verstoringen in deze neuro-inflammatoire en hemodynamische markers en cognitieve stoornissen. Hierin beschrijven we methoden om de neuro-inflammatoire en hemodynamische weefselrespons op mTBI bij muizen te karakteriseren. In het bijzonder beschrijven we hoe we een gewichtsdruppelmodel van mTBI kunnen uitvoeren, hoe we de cerebrale bloedstroom longitudinaal kunnen meten met behulp van een niet-invasieve optische techniek die diffuse correlatiespectroscopie wordt genoemd, en hoe een Luminex multiplexed immunoassay op hersenweefselmonsters kan worden uitgevoerd om cytokines en immunomodulerende fosfo-eiwitten te kwantificeren (bijvoorbeeld binnen de MAPK- en NFκB-routes) die reageren op en reguleren van activiteit van microglia en andere neurale immuuncellen. Ten slotte beschrijven we hoe deze gegevens kunnen worden geïntegreerd met behulp van een multivariate systeemanalysebenadering om de relaties tussen al deze variabelen te begrijpen. Het begrijpen van de relaties tussen deze fysiologische en moleculaire variabelen zal ons uiteindelijk in staat stellen om mechanismen te identificeren die verantwoordelijk zijn voor mTBI.

Eerder verzamelde gegevens werden genomen van eerder werk waarbij een groep van acht C57BL /6-muizen werd onderworpen aan drie gesloten hoofdletsels (figuur 2) eenmaal daagsverdeeld 11. In dit werk werd de cerebrale bloedstroom gemeten met diffuse correlatiespectroscopie 4 uur na het laatste letsel (figuur 3, figuur 4). Na cbf-beoordeling na het letsel werden de dieren geëuthanaseerd en werd hersenweefsel geë...

Dit protocol presenteert methoden om de neuro-inflammatoire en hemodynamische respons op mild traumatisch hersenletsel te karakteriseren en om deze gegevens te integreren als onderdeel van een multivariate systeemanalyse met behulp van partiële kleinste kwadratenregressie.

Systeemanalyse van de neuro-inflammatoire en hemodynamische respons op traumatisch hersenletsel

Mild traumatic brain injuries (mTBIs) are a significant public health problem. Repeated exposure to mTBI can lead to cumulative, long-lasting functional ...

Deze methoden kunnen worden gebruikt om neuro-inflammatoire en hemodynamische reacties op hersenletsel te karakteriseren als onderdeel van een multivariate systeemanalyse met behulp van partiële regressie van de kleinste kwadraten. Deze technieken worden gebruikt om meer een holistisch beeld te geven van de reactie van de hersenen op letsel. Om een verwonding te veroorzaken, bevestigt u een gebrek aan reactie op teenknijpen bij een verdoofde muis en plaatst u de muis in de buikligging op het midden van een dun membraan.Gebruik beide handen om het geleerde weefsel vast te houden, zet de staart van de muis onder een duim en plaats de muiskop onder de geleidebuis. Wanneer de muis in positie is, gericht op de impact tussen de achterkant van de ogen en de voorkant van de oren, laat u de bout van de bovenkant van de geleidebuis op het dorsale aspect van het hoofd van de muis vallen. Bij impact zal de muis door het weefsel breken, waardoor een snelle versnelling van het hoofd rond de nek mogelijk is.Laat de muis na de verwonding in rugligging herstellen op een opwarmkussen van 37 graden Celsius. Na een stabilisatieperiode van twee minuten laat u de DCS-sensor voorzichtig over de rechterhersenhelft van de schedel van de muis rusten, zodat de bovenrand van de optische sensor op één lijn ligt met de achterkant van het oog en de zijkant van de sensor langs de middellijn. Geef de sensor een hand om deze af te schermen van ruimtelicht en ontvang vijf seconden aan gegevens.Verplaats vervolgens de sensor over de linkerhersenhelft en verkrijg vijf seconden gegevens over de linkerhersenhelft. Om de productie van gemultiplext cytokine en fosfo-eiwit te beoordelen, voegt u 150 microliter gemengde lysisbuffer toe per ongeveer drie milligram geoogst dierlijk hersenweefsel. En gebruik een pipetpunt van 1.000 microliter om het weefsel 15 tot 20 keer mechanisch te tritureren.Plaats de gehomogeniseerde monsters gedurende 30 minuten op een rotator bij vier graden Celsius voordat u het weefselafval verzamelt door centrifugeren. Breng de supernatanten over in nieuwe buizen en centrifugeer de monsters om het resterende neerslag te verwijderen. Breng de supernatanten over naar nieuwe buizen en bepaal de eiwitconcentratie door BCA-assay volgens standaardprotocollen.Bereid 25 microliter van elk monster voor bij de optimale eiwitconcentratie zoals bepaald door de lineaire bereikanalyse in nieuwe buizen. Gebruik van assaybuffer om het totale volume van elk monster te normaliseren tot 25 microliter. Om een testplaat te bereiden, voegt u 200 microliter wasbuffer toe aan elke put van een bord met 96 putten en schudt u de plaat gedurende 10 minuten op een shaker met 750 omwentelingen per minuut.Decanteer aan het einde van de incubatie de wasbuffer en tik de plaat op een papieren handdoek om eventuele resten te verwijderen. Voeg vervolgens 25 microliter testbuffer toe aan elke put, gevolgd door 25 extra microliter buffer aan de achtergrondputten. Voeg 25 microliter van de verdunde monsters toe aan de juiste monsterputten en draai de via van gemultiplexte magnetische kralen gedurende één minuut, voordat u 25 microliter van de grondig opnieuw gesuspendeerde kralen aan elke put toevoegt.Wanneer alle kralen zijn toegevoegd, sluit u de plaat af met een platensealer en bedekt u de plaat met folie voor een nachtelijke incubatie met schudden bij twee tot acht graden Celsius. Plaats de volgende ochtend de plaat op een magnetische afscheider en zorg ervoor dat de putten zijn uitgelijnd met de magneten. Decanteer na twee minuten de inhoud van de put met de plaat nog steeds bevestigd aan de magnetische separator en voeg 200 microliter wasbuffer toe aan elke put.Nadat u het twee minuten hebt laten schudden, plaatst u de plaat gedurende twee minuten op de magnetische afscheider. Decanteer vervolgens de inhoud van de put met de plaat nog steeds bevestigd aan de magnetische separator en was de plaat met een verse 200 microliter wasbuffer per put, zoals zojuist is aangetoond. Voeg na de tweede wasbeurt 25 microliter detectieantilichaam per put toe en bedek opnieuw met folie gedurende een incubatie van een uur met 750 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur.Voeg aan het einde van de incubatie 25 microliter streptavidin phycoerythrin toe aan elke put en breng de plaat nog eens 30 minuten bij kamertemperatuur terug naar de shaker. Plaats de plaat aan het einde van de incubatie twee minuten op de magnetische afscheider voordat u de inhoud van de put decanteert. Was de plaat twee keer met 200 microliter verse wasbuffer per wasbeurt en voeg 75 microliter van de juiste aandrijfvloeistof toe aan elke put.Hang vervolgens de kralen opnieuw op de platenschudder gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur en lees de platen op de analysator volgens de instructies van de fabrikant. In deze analyse werd de cerebrale bloedstroom gemeten met diffuse correlatiespectroscopie vier uur na het laatste letsel. De cerebrale bloedstroomindex en de gemiddelde cerebrale stroomindex voor elke hemisfeer kunnen dan worden bepaald.Een lineaire bereikanalyse kan worden uitgevoerd om een geschikte eiwitbelastingsmassa te bepalen voordat gegevens van alle monsters worden verzameld. Cytokinegegevens kunnen worden voorbereid door de achtergrondmetingen af te trekken van de steekproefgegevens en vervolgens de Z-scoregegevens voor elke anolyt te berekenen. Partiële kleinste kwadratenregressie kan worden uitgevoerd met behulp van een fagocyt microgliale activeringsmarker of andere variabele van belang als de responsvariabele en de cytokinemetingen als de predictorvariabelen.Varimax-rotatie kan worden uitgevoerd om de covariantie van de gegevens op latente variabele één te maximaliseren, met de activeringsmarkermetingen. Hoge belastingsgewichten in latente variabele één komen overeen met de cytokine-expressies die het meest geassocieerd zijn met een hoge expressie van de activeringsmarker. Lineaire regressies tussen de activeringsmarker en cytokines illustreren dat die cytokines met de grootste belastingsgewichten in latente variabele één ook statistisch significant waren voor deze analyse.Hoewel we dit protocol hebben gericht op traumatisch hersenletsel, zijn deze methoden op grote schaal generaliseerbaar voor de studie van een overvloed aan pathologische aandoeningen die de hersenen beïnvloeden. We gebruiken deze technieken om ons te helpen bij het identificeren van verhandelbare doelen om te moduleren in toekomstige experimenten om causale mechanistische relaties vast te stellen en uiteindelijk met het doel om nieuwe therapeutische strategieën voor mild traumatisch hersenletsel te ontwikkelen.

systems-analysis-neuroinflammatory-hemodynamic-response-to-traumatic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit artikel geeft een overzicht van een multi-modale benadering van licht traumatisch hersenletsel diagnose en herstel in de jeugd. Deze aanpak combineert neuropsychologische testen met functionele magnetische resonantie beeldvorming en het hoofd Impact telemetrie systeem op de relatie tussen het hoofd stoten en hersenactiviteit tijdens cognitieve testen te controleren.

Een onderzoek naar de effecten van sport-gerelateerde Hersenschudding in de jeugd met behulp van functionele Magnetische Resonantie Imaging en het hoofd Impact telemetriesysteem

Laterale vloeistof percussie (LFP), een uitgewerkt model van traumatisch hersenletsel bij muizen, is aangetoond. LFP vervult drie belangrijke criteria voor dierlijke modellen: validiteit, betrouwbaarheid en klinische relevantie. De procedure, bestaande uit chirurgische craniotomie, fixatie van de hub, gevolgd door inductie van letsels die zouden ontstaan ​​bij focale en diffuse blessures, is beschreven.

Laterale Fluid Percussie: Model van traumatisch hersenletsel bij muizen

Een veelzijdige benadering van het onderzoek naar functionele veranderingen in de hippocampus circuits wordt uitgelegd. Elektrofysiologische technieken worden beschreven, samen met de schade-protocol, gedrags-testen en regionale dissectie methode. De combinatie van deze technieken kunnen worden toegepast op soortgelijke wijze andere hersengebieden en wetenschappelijke vragen.

Onderzoeken op Wijzigingen van de hippocampus Circuit Functie Na mild traumatisch hersenletsel

In this video, we demonstrate the diffuse correlation spectroscopy technique to measure cerebral blood flow in a mouse model of mild traumatic brain injury.

Diffuse Correlation Spectroscopy to Assess Cerebral Blood Flow in a Mouse Model

Traumatische hersenverwondingen (THV) blijven een ernstig gezondheidsprobleem. Met behulp van het gecontroleerde corticale impactchirurgie-model kan onderzoek worden gedaan naar de effecten van THV en mogelijke behandelmethoden.

Gecontroleerde Corticale Impact Model voor traumatisch hersenletsel

Intraparenchymale bloeding en neuro-inflammatie vergezeld van hersenkneuzing kunnen ernstig secundair hersenletsel veroorzaken. Dit protocol beschrijft een muisgecontroleerd corticaal impactmodel (CCI), waarmee onderzoekers bloedingen, kneuzingen en posttraumatische immuunresponsen kunnen bestuderen en mogelijke therapieën kunnen onderzoeken.

Een preklinisch gecontroleerd corticaal impactmodel voor traumatische bloedingen, kneuzingen en neuro-inflammatie

Dit protocol presenteert een gemodificeerd muismodel van repetitief mild traumatisch hersenletsel (rmTBI) geïnduceerd via een closed-head injury (CHI)-methode. De aanpak omvat een verdund schedelvenster en vloeibare percussie om de ontsteking die vaak wordt veroorzaakt door blootstelling aan hersenvliezen te verminderen, samen met verbeterde reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid bij het modelleren van rmTBI bij knaagdieren.

Gemodificeerd muismodel van repetitief mild traumatisch hersenletsel met een verdund schedelvenster en vloeibare percussie

Hier presenteren we een protocol om een diermodel voor letsel aan het hoofd op te stellen dat de neuroimage-uitkomst van ongecompliceerd licht traumatisch hersenletsel repliceert met de behouden hersenstructuur in de acute fase en langdurige hersenatrofie. Longitudinale magnetische resonantie beeldvorming is de primaire methode die wordt gebruikt voor bewijs.

Ontwikkeling van een ongecompliceerd model voor licht traumatisch hersenletsel, gemodificeerd door middel van een gewichtsverliesmethode en aangetoond door magnetische resonantiebeeldvorming

Vereenvoudigde modellen voor traumatisch hersenletsel (TBI) hebben de ontwikkeling van therapeutische benaderingen vergemakkelijkt. Dit protocol schetst de aanmaak van een niersteekwond muiscortex met behulp van naalden, waardoor bloedingen en ontstekingen kunnen worden geanalyseerd. Het steekwond TBI-muismodel biedt het voordeel dat het kan worden uitgevoerd zonder dat er gespecialiseerde apparatuur nodig is.

Steekwondmuismodel voor het bestuderen van bloedingen en ontstekingen bij traumatisch hersenletsel

We beschrijven hoe laser capture microdissectie (LCM) om verrijkte populaties van hippocampale neuronen of afzonderlijke neuronen vastgezette gewonden rattenhersenen voor daaropvolgende analyse van genexpressie met kwantitatieve real time PCR en / of hele genoom microarrays verkrijgen.

Laser Capture Microdissection van Verrijkt populaties van neuronen of Single Neuronen voor de analyse van genexpressie na traumatisch hersenletsel

Leer een systeemanalyse van neuro-inflammatoire en hemodynamische reacties op traumatisch hersenletsel bij muizen. Deze methode integreert diffuse correlatiespectroscopie en cytokine-multiplexing voor holistisch inzicht.

Systeemanalyse van de neuro-inflammatoire en hemodynamische respons op traumatisch hersenletsel

Meer video's verkennen