Name: Het verkrijgen van primaire osteocyten door murine calvariale fractionering van GFP-tot expressie brengende osteocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: Leer een efficiënte methode voor de isolatie van primaire GFP-expresserende osteocyten uit neonatale dmp1-topaz muizen. Dit protocol verkort de handelingstijd en maximaliseert de opbrengst van levensvatbare cellen met minimale contaminatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een JSPS KAKENHI-beurs van de Japan Society for the Promotion of Science (nr. 19K10397 tot H.K. en nr. 18K09862 tot I.M.).

Alle dierprocedures en dierverzorging werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van de Tohoku University.
1. Dissectie van pasgeboren dmp1-topaas muis calvaria
<ol><li>Gebruik voor dit protocol 6\u20127 eendagsjongen van C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J muizen. Euthanaseer muizen met 5% isofluraaninhalatie en breng de pups vervolgens over in 70% ethanol.</li>
	<li>Breng de geëuthanaseerde pup over in een niet-behandelde kweekschaal.</li>
	<li>Gebruik een schaar en een pincet om de huid aan de basis van de schedel vast te pakken en maak een incisie.</li>
	<li>Gebruik de eerste incisie als uitgangspunt, snijd aan beide zijden van de schedel voor de oren, verwijder de huid en leg de calvaria bloot.</li>
	<li>Houd het hoofd van de neusbrug en snijd de calvaria langs de lambdoïde hechtdraad. Snijd langs de laterale randen van de pariëtale botten en breid deze uit naar het voorste deel.</li>
	<li>Scheid de calvaria van het onderliggende hersenweefsel. OPMERKING: Om een schone benige calvaria met minimale aanhechting van zacht weefsel te garanderen, snijd niet diep in het bot; Ter referentie moet men de schaduw van de schaar onder het bot kunnen zien.</li>
	<li>Breng de calvaria over in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4 gedurende het hele protocol). Zorg ervoor dat het holle deel naar boven is gericht.</li>
</ol>2. Fractionering van de calvaria van pasgeboren muizen
<ol><li>Breng tot 5 calvariae over in een conische buis van 50 ml met 5 ml collagenaseoplossing van 2 mg/ml. Gebruik verse collagenase-oplossing die vlak voor gebruik is bereid.<ol><li>Om een verse collagenase-oplossing te bereiden, voegt u collagenasepoeder toe aan de isolatiebuffer (70 mM NaCl, 10 mM NaHCO 3, 60 mM sorbitol,3 mMK2 HPO4, 1 mM CaCl 2, 1 mg / ml runderserumalbumine (BSA), 5 mg / ml glucose en 25 mM HEPES) bij2 mg / ml. Los het collagenasepoeder op een magneetroerder op.</li>
		<li>Laat de collagenase-oplossing door een steriele filtereenheid van 0,22 μm in een buis van 50 ml lopen en houd deze gedurende het hele protocol op ijs.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubeer de calvaria bij 37 °C gedurende 20 minuten op een schudder bij 300 tpm om fractie 1 te verkrijgen.</li>
	<li>Gooi de vertering van fractie 1 weg, was de calvaria met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en gooi de was weg.</li>
	<li>Incubeer de calvaria in 5 ml 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) met 1 mg/ml BSA in PBS, PH 7,4 bij 37 °C gedurende 15 minuten op een shaker bij 300 tpm.</li>
	<li>Verzamel de digest in een conische buis van 50 ml. Was de calvaria met 5 ml PBS en voeg de wasoplossing toe aan de digest. OPMERKING: Op elk punt van het verzamelen van de vertering en het wassen, pipetteer de botten in hun oplossing om de cellen los te maken van het bot en om doubletten en celaggregaten te voorkomen.</li>
	<li>Om fractie 2 te verkrijgen, centrifugeert u de digest bij 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg, suspensie de pellet opnieuw in 8 ml α-Minimum Essential Medium (MEM) met 10% foetaal runderserum (FBS), 100 IE / ml penicilline G en 100 μg / ml streptomycine. Zaad op een kweekschaal van 10 cm. Incubeer fractie 2 bij 37 °C onder 5% CO2.</li>
	<li>Incubeer de calvaria in 5 ml collagenase-oplossing bij 37 °C gedurende 20 minuten op een shaker bij 300 tpm.</li>
	<li>Als u breuk 3 wilt verzamelen, herhaalt u stap 2.5\u20122.6. Incubeer fractie 3 bij 37 °C onder 5% CO2. OPMERKING: Op dit punt zullen de botten kleiner worden en zullen ze worden gereduceerd tot fragmenten. Om ervoor te zorgen dat er geen botten per ongeluk in de digesten terechtkomen, wat leidt tot celverlies tijdens het proces, gebruikt u een kleine tippipet voor het verzamelen van de digesten (1000-12200 μL pipetpunten).</li>
	<li>Incubeer de calvaria in 5 ml collagenase-oplossing bij 37 °C gedurende 20 minuten op een shaker bij 300 tpm.</li>
	<li>Als u breuk 4 wilt verzamelen, herhaalt u stap 2.5\u20122.6. Incubeer fractie 4 bij 37 °C onder 5% CO2.</li>
	<li>Incubeer de calvaria in 5 ml 5 mM EDTA met 1 mg/ml BSA in PBS (pH 7,4) bij 37 °C gedurende 15 minuten op een shaker bij 300 tpm.</li>
	<li>Als u breuk 5 wilt verzamelen, herhaalt u stap 2.5\u20122.6. Incubeer fractie 5 bij 37 °C onder 5% CO2. Osteocyten kunnen op dezelfde dag worden bereid om te sorteren of tot 24 uur voor het sorteren worden gekweekt.</li>
</ol>3. Bereiding van osteocyten voor fluorescentie geactiveerde celsortering
<ol><li>Zuig het medium van elke celfractie op en was zachtjes met 10 ml PBS tweemaal.</li>
	<li>Voeg 5 ml 0,5% trypsine-EDTA toe in PBS en incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg 5 ml 10% FBS α-MEM en pipet toe om de cellen voorzichtig los te maken. Combineer de cellen in elke fractie door een celzeef van 40 μm in een conische centrifugebuis van 50 ml te zeven.</li>
	<li>Was de cellen met 10 ml PBS en verzamel door een celzeef van 40 μm in een conische centrifugebuis van 50 ml te zeven. Centrifugeer de cellen op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Zuig het supernatant aan en voeg 10% FBS α-MEM toe aan de pellet. Pas de celconcentratie aan op ongeveer 1 x 107 cellen/ml.</li>
	<li>Filter de cellen in een 35 μm nylon mesh afgedekte buis. De cellen zijn nu klaar voor FACS.</li>
	<li>Gebruik voor dit protocol een mondstuk van 100 μm. De opvangvloeistof moet bestaan uit 10% FBS α-MEM. Houd het monster gesorteerd op roeren en op 4 °C in de gehele sortering, indien mogelijk.</li>
	<li>Voorafgaand aan de sortering optimaliseert u gating om artefacten en cellen te verwijderen door het gebied side scatter (SSC) en forward scatter (FSC) aan te passen. Elimineer doubletten door SSC-breedte versus SSC-hoogte en FSC-gebied versus FSC-breedte aan te passen. GFP-negatieve osteocyten moeten worden gebruikt als een controle om de parameters van het sorteerinstrument aan te passen.</li>
	<li>Nadat de celverzameling is voltooid, centrifugeert u de cellen gedurende 10 minuten bij 300 x g bij 4 °C. Was cellen met PBS. Centrifugeer de cellen op 300 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Suspenseer de cellen opnieuw en pas het aantal naar wens aan met 10% FBS α-MEM.</li>
</ol>

<ol><li>Manolagas, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth+and+death+of+bone+cells%3A+basic+regulatory+mechanisms+and+implications+for+the+pathogenesis+and+treatment+of+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Birth and death of bone cells: basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.</a> Endocrine Reviews. 21 (2), 115-137 (2000).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocytes+as+Dynamic+Multifunctional+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Osteocytes as Dynamic Multifunctional Cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1116 (1), 281-290 (2007).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensation+and+Transduction+in+Osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+osteovision%22%5BJournal%5D)">Mechanosensation and Transduction in Osteocytes.</a> BoneKEy osteovision. 3 (10), 7-15 (2006).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Lane, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid-Treated+Mice+Have+Localized+Changes+in+Trabecular+Bone+Material+Properties+and+Osteocyte+Lacunar+Size+That+Are+Not+Observed+in+Placebo-Treated+or+Estrogen-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid-Treated Mice Have Localized Changes in Trabecular Bone Material Properties and Osteocyte Lacunar Size That Are Not Observed in Placebo-Treated or Estrogen-Deficient Mice.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (3), 466-476 (2005).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Osteocyte%3A+An+Endocrine+Cell+...+and+More%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The Osteocyte: An Endocrine Cell ... and More.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>van der Plas, A., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of osteocytes.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 7 (4), 389-396 (1992).</li>
<li>Westbroek, I., De Rooij, K. E., Nijweide, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte-specific+monoclonal+antibody+MAb+OB7.3+is+directed+against+Phex+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Osteocyte-specific monoclonal antibody MAb OB7.3 is directed against Phex protein.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 17 (5), 845-853 (2002).</li>
<li>Gu, G., Nars, M., Hentunen, T. A., Metsikkö, K., Väänänen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolated+primary+osteocytes+express+functional+gap+junctions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Isolated primary osteocytes express functional gap junctions in vitro.</a> Cell and Tissue Research. 323 (2), 263-271 (2006).</li>
<li>Kramer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+Wnt%2F%CE%B2-Catenin+Signaling+Is+Required+for+Normal+Bone+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteocyte Wnt/β-Catenin Signaling Is Required for Normal Bone Homeostasis.</a> Molecular and Cellular Biology. 30 (12), 3071-3085 (2010).</li>
<li>Kato, Y., Windle, J. J., Koop, B. A., Mundy, G. R., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+Osteocyte-like+Cell+Line%2C+MLO-Y4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an Osteocyte-like Cell Line, MLO-Y4.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 12 (12), 2014-2023 (1997).</li>
<li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+osteoid+preosteocyte-like+cell+MLO-A5+that+spontaneously+mineralizes+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an osteoid preosteocyte-like cell MLO-A5 that spontaneously mineralizes in culture.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 16 (9), 1622-1633 (2001).</li>
<li>Zhang, C., Bakker, A. D., Klein-Nulend, J., Bravenboer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+Osteocytes+in+Their+3D+Native+Matrix+Versus+2D+In+Vitro+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Osteoporosis+Reports%22%5BJournal%5D)">Studies on Osteocytes in Their 3D Native Matrix Versus 2D In Vitro Models.</a> Current Osteoporosis Reports. 17 (4), 207-216 (2019).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bone+and+mineral+research+%3A+the+official+journal+of+the+American+Society+for+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Spatz, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt+Inhibitor+Sclerostin+Is+Up-regulated+by+Mechanical+Unloading+in+Osteocytes+in+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">The Wnt Inhibitor Sclerostin Is Up-regulated by Mechanical Unloading in Osteocytes in Vitro.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (27), 16744-16758 (2015).</li>
<li>Gillet, J. P., Varma, S., Gottesman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+relevance+of+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">The clinical relevance of cancer cell lines.</a> Journal of the National Cancer Institute. 105 (7), 452-458 (2013).</li>
<li>Sandberg, R., Ernberg, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+tumor+characteristic+gene+expression+in+cell+lines+using+a+tissue+similarity+index+%28TSI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assessment of tumor characteristic gene expression in cell lines using a tissue similarity index (TSI).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (6), 2052-2057 (2005).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dentin+matrix+protein+1+expression+during+osteoblastic+differentiation%2C+generation+of+an+osteocyte+GFP-transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Dentin matrix protein 1 expression during osteoblastic differentiation, generation of an osteocyte GFP-transgene.</a> Bone. 35 (1), 74-82 (2004).</li>
<li>Paic, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+between+osteoblasts+and+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes between osteoblasts and osteocytes.</a> Bone. 45 (4), 682-692 (2009).</li>
<li>Nakashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+osteocyte+regulation+of+bone+homeostasis+through+RANKL+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evidence for osteocyte regulation of bone homeostasis through RANKL expression.</a> Nature Medicine. 17 (10), 1231-1234 (2011).</li>
<li>Kalajzic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+approaches+to+study+osteocyte+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo approaches to study osteocyte biology.</a> Bone. 54 (2), 296-306 (2013).</li>
<li>Chia, L. Y., Walsh, N. C., Martin, T. J., Sims, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+gene+expression+of+haematopoietic-cell-free+preparations+of+highly+purified+murine+osteocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Isolation and gene expression of haematopoietic-cell-free preparations of highly purified murine osteocytes.</a> Bone. 72, 34-42 (2015).</li>
<li>Halleux, C., Kramer, I., Allard, C., Kneissel, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHalleux%2C+C+%22Bone+Research+Protocols%22">Bone Research Protocols</a>. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana Press. 55-66 (2012).</li>
<li>Bernhardt, A., Wolf, S., Weiser, E., Vater, C., Gelinsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+to+isolate+primary+human+osteocytes+from+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedizinische+Technik+%28Berlin%29%22%5BJournal%5D)">An improved method to isolate primary human osteocytes from bone.</a> Biomedizinische Technik (Berlin). 65 (1), 107-111 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De eerste geïsoleerde osteocyt was van een kippencalvaria7 geïsoleerd met behulp van (OB7.3) of de aviantvariant van PHEX; Deze methode wordt echter beperkt door de beschikbaarheid van werkbare antilichamen, omdat osteocytspecifieke antilichamen die ook soortspecifiek zijn, moeten worden vervaardigd. Onderzoekers gebruikten een andere modificatie van het sequentiële enzymatische proces om osteocyten te verkrijgen uit lange botten van muizen en ratten; De gerapporteerde zuiverheid van deze culturen...

Osteocyten zijn terminaal gedifferentieerde cellen van osteoblastische voorlopers die ingebed raakten in hun uitgescheiden matrix1. Ze zijn de meest voorkomende en langstlevende cellen onder botcelpopulaties. Ze bevinden zich in lacunes en hebben een karakteristieke stellaatmorfologie met dendrieten die zich uitstrekken door kanalen die canaliculi worden genoemd en een uitgebreid netwerk van communicatie en metabole uitwisseling vormen met hun omgeving en het botoppervlak2. Osteocyten choreograferen zowel osteoblasten als osteoclasten rollen in botremodellering, ze zijn de primaire mechanosensorische cellen die aanpassing verlenen aan mechanische belasting3, zijn betrokken bij fosfaathomeostase4 en botmatrixmineralisatie5, en samen met het lacunocanaliculaire systeem fungeren ze als een endocriene orgaan dat verre weefselssignaleert 6.
Osteocyten bevinden zich in een gemineraliseerde matrix, wat de toegankelijkheid beperkt en hun isolatie uitdagend maakt, waardoor in vitro onderzoek wordt belemmerd. Een van de eerste isolatiemethoden beschreef geïsoleerde osteocyten uit kippen calvaria met behulp van een osteocytspecifiek monoklonaal antilichaam (OB7.3)7 waarvan later bekend werd dat het de aviaire variant van PHEX (PHosfaatregulerend gen met homologie aan Endopeptidases op het X-chromosoom)8 was. Andere onderzoekers gebruikten sequentiële vertering van rat 9 of muis 10 lange botten om osteocytrijke fracties te verkrijgen waarin de zuiverheid van osteocyten ongeveer70% 9 was. Beperkingen van deze procedure zijn onder meer de suboptimale zuiverheid van culturen die besmet zijn met andere celtypen dan osteocyten en dat osteocyten mogelijk kunnen worden overwoekerd door andere cellen in cultuur, omdat osteocyten het vermogen om te delen hebben verloren. Deze uitdagingen beperken de bruikbaarheid van langetermijnculturen.
Om deze beperkingen te overwinnen, werden verschillende osteocytencellijnen ontwikkeld. De MLO-Y4-cellijn11 en de MLO-A5-cellijn12 zijn met name de meest bestudeerde cellijnen die nuttig zijn voor de studie van de osteocyten in een vroeg stadium; ze zijn echter minder nuttig voor het bestuderen van volwassen osteocytensignalering omdat ze lage niveaus van sclerostine en FGF2313 uitdrukken, die beide volwassen osteocytenmarkers zijn. Andere cellijnen, waaronder IDG-SW3 14 en Ocy45415, drukken hoge niveaus van sclerostine en FGF23 uit en zijn nuttig bij het bestuderen van het late osteocytenstadium. Cellijnen blijken nuttige onderzoeksinstrumenten te zijn; Niettemin komen ze niet zonder beperkingen omdat ze de biologie van de primaire cel niet volledig vertegenwoordigen. Verschillende cellijnen vertegenwoordigen verschillende ontwikkelingsstadia van het rijpheidsspectrum van osteocyten en cellijnen vertegenwoordigen niet de heterogeniteit van primaire osteocyten16,17.
Om zuivere culturen van primaire osteocyten te verkrijgen, maakten onderzoekers gebruik van het cre-muismodel waarin de 8-kb dmp1-promotor wordt gebruikt om groene fluorescerende eiwit (GFP) expressie in osteocyten18,19 aan te sturen. Dubbele transgene muizen (pOB-Col 2.3- GFP-cyaan en DMP1-GFP-topaas) van Paic et al.19 en dmp1-topaas transgene muizen van Nakashima et al.20 zijn gebruikt om osteocytenpopulaties te verkrijgen. Waarin ze sequentiële vertering en FACS van osteocyten gebruikten die GFP tot expressie brachten om culturen van primaire osteocyten te verkrijgen19,20. De richting van cre in de 10-kb dmp1 reportermuis Ai9, die het tdTomato-eiwit activeert, bleek aanwezig te zijn in osteocyten, osteoblasten, spieren en cellen in het beenmerg. De 8-kb dmp1-promotor had hetzelfde expressiepatroon, maar slechts een deel van de osteoblasten en beenmergcellen drukte het eiwit uit, wat aangeeft dat de 8-kb dmp1-promotor specifieker is21. Desondanks moeten resultaten verkregen met behulp van de 8-kb dmp1-promotor met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd en moeten genexpressieprofielen routinematig worden uitgevoerd met behulp van osteocyten versus osteoblastspecifieke markers om ervoor te zorgen dat de verkregen populatie van voldoende zuiverheid is.
Osteoclastmarkers OSCAR en Dcstamp werden gevonden in hematopoëtische niet-uitgeputte versus uitgeputte osteocytenpopulaties, deze bevinding leidde de auteurs tot de conclusie dat digesten verkregen uit fractionering van 8-kb dmp1-topaas neonatale calvaria en GFP-sortering besmet zijn met hematopoëtische cellen. Besmetting met hematopoëtische cellen had kunnen worden verzacht door de GFP-sorteerpoort aan te scherpen, aangezien GFP-positieve hematopoëtische cellen een redelijk lagere GFP-intensiteit hadden dan GFP-positieve mesenchymale cellen (osteocyten)22.
De methoden voor het bestuderen van osteocyten in vitro hebben bijgedragen aan de recente schat aan informatie over osteocytenbiologie. Osteocytenisolatie blijft echter een arbeidsintensieve en langdurige procedure met lage celopbrengsten. De beschreven methode van botvertering met behulp van collagenase en EDTA, vaak tot fractie 823, duurt enkele uren waarin de levensvatbaarheid van osteocyten wordt belast. Onderzoekers hebben gerapporteerd dat ze fracties (2-0125) hebben gebruikt voor celsortering 20, en hebben aangetoond dat het expressieprofiel van genen geassocieerd met osteocyten versus die van osteoblasten het succes van het isoleren van pure osteocytenpopulatiesbevestigt 20. In dit artikel beschrijven we het proces van het verkrijgen van breuken (2-0125) en vergelijken we de opbrengst van osteocyten van elke fractie beginnend met fractie 1 tot en met 8 om de terugkeer van osteocyten in elke fractie te bepalen. We beschrijven ook de dissectie van pasgeboren dmp1-topaas muis calvaria en calvariale spijsvertering met behulp van collagenase en ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), evenals de bereiding van cellen voor FACS.

<table><tbody><tr><td>BD FACSDiva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Gegevensverwerving en analyse</td></tr><tr><td>BD Falcon Tube</td><td>BD Biosciences</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm buis met celstrainerdop, 35 &mu;m nylon gaas.</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td>034-22363</td><td>0,2% (w/v), ruwe collagenasemix afkomstig van C. histolyticum.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japan</td><td></td><td>5mM EDTA bereid met 0,1% BSA</td></tr><tr><td>FACSAriaTM II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Biowest, Nuaillé, Frankrijk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolatiekoppeling</td><td></td><td></td><td>70mM NaCl, 10mM NaHCO, 60mM sorbitol, 3mM K2HPO4, 1mM CaCl2, 0,1% (w/v) BSA, 0,5% (w/v) glucose en 25 mM HEPES</td></tr><tr><td>Millex steriele filtereenheid</td><td>Merck Millipore, Ierland</td><td>SLGV033RS</td><td>0,22&mu;m</td></tr><tr><td>Nylon celstrainer</td><td>FALCON, NY, USA</td><td></td><td>40&mu;m</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Life Technologies, NY, USA</td><td></td><td>0,5% x10. verdund tot x1 in PBS</td></tr><tr><td>&alpha;-MEM</td><td>Wako, Osaka, Japan</td><td></td><td>Bevat 10% fetaal bovien serum, 100 IE/ml penicilline G en 100 &mu;g/ml streptomycine</td></tr></tbody></table>

het verkrijgen van primaire osteocyten door murine calvariale fractionering van gfp-tot expressie brengende osteocyten

Obtaining Primary Osteocytes Through Murine Calvarial Fractionation of GFP-Expressing Osteocytes

De osteocyt, waarvan ooit werd gedacht dat hij een passieve bewoner van het bot was gezien de backstage-functie van het detecteren van mechanische belasting, wordt nu onder de aandacht gebracht en er is aangetoond dat hij meerdere belangrijke functies heeft, zoals het actief wijzigen van de extracellulaire matrix en het vormen van een endocriene orgaan met het lacunocanaliculaire systeem dat het omsluit en berichten naar verre locaties verzendt. Dankzij de methoden die het mogelijk maakten om de osteocyt in vitro te testen van het isoleren van primaire osteocyten tot osteocytachtige cellijnen, ervaren osteocyten nu een klinkende interesse en een golf van kennis over structuur en functie. Veel aspecten van de osteocytenbiologie en de interactie met andere moleculaire componenten moeten nog worden ontdekt. In dit protocol beschrijven we in detail de efficiënte isolatie van primaire osteocyten uit dmp1-topaas neonatale muis calvaria, die het groene fluorescerende eiwit in osteocyten tot expressie brengen, door celfractionering en vervolgens het verwerven van culturen van primaire osteocyten door FACS.

Het doel van dit protocol is om het proces aan te tonen van het verkrijgen van culturen van primaire osteocyten uit dmp1-topaas neonatale muis calvaria door middel van een fractioneringsproces met behulp van collagenase om de collageenmatrix en EDTA voor calciumchelatie af te breken, waarna cellen worden voorbereid op FACS om osteocyten van andere celpopulaties te scheiden.
Methoden voor het verkrijgen van primaire osteocyten uit neonatale muis calvaria beschrijven vaak het gebruik van fractie...

Dit protocol beschrijft de dissectie van neonatale dmp1-topaas muizen calvaria en isolatie van osteocyten die het groene fluorescerende eiwit tot expressie brengen door celvertering en fractionering, naast osteocytenpreparaat voor fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS).

Het verkrijgen van primaire osteocyten door murine calvariale fractionering van GFP-tot expressie brengende osteocyten

The osteocyte, once thought to be a passive resident of the bone given the backstage function of sensing mechanical loading, is now brought to the ...

Primaire osteocytisolatie is een langdurige procedure die vaak gebieden met lage celdichtheid overslaat. Dit protocol biedt efficiënte methoden voor het isoleren van een groot aantal primaire GFP-expresserende osteocyten. Dit protocol vermindert de behandelingstijd en maakt het mogelijk om een hoger aantal osteocyten te verkrijgen in een enkele procedure met minimale besmetting door hematopoëtische of mesenchymale cellen.Voor de isolatie van GFP-expresserende osteocyten, plaats euthanasiëerde, postnataal dag zes tot zeven, transgene muizenpups in een niet-behandelde kweekschaal en gebruik schaar en pincetten om de huid aan de basis van de schedel vast te grijpen. Gebruik de schaar om een initiële insnijding in de opgetilde huid te maken, gevolgd door sneden langs beide zijden van de schedel voor de oren. Verwijder de huid om de calvaria bloot te leggen en houd het hoofd vast aan de neusbrug, snijd de calvaria langs de lambdoïde naad en langs de randen van de pariëtale botten tot aan het frontale deel van het weefsel.Scheiden de calvaria van het onderliggende hersenweefsel en plaats de botten met de holle kant naar boven in PBS. Om fractie een te verkrijgen, verzamel tot vijf calvaria per 50-milliliter buis in vijf milliliter vers bereid twee milligram per milliliter collageenase en incubeer de weefsels gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius en 300 omwentelingen per minuut. Aan het einde van de incubatie, gooi het digest van fractie een weg en was de calvaria met vijf milliliter PBS.Vervang de was met vijf milliliter vijf millimolair EDTA, aangevuld met één milligram per milliliter bovien serumalbumine in PBS gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius met schudden. Aan het einde van de incubatie, breng het digest over naar een 50-milliliter conische buis en was de calvaria met vijf milliliter PBS. Breng vervolgens de wasoplossing over naar het digest.Om fractie twee te verkrijgen, plaats het digest voor centrifugatie en gooi de supernatant weg. Resuspendeer het pellet in acht milliliter alfa minimaal essentieel medium bevattend 10% foetaal bovien serum, of FBS, en antibiotica, en zaai de cellen op een 10-centimeter kweekschaal. Plaats vervolgens de fractie twee cellen in de celkweekincubator.Na het verzamelen en kweken van fracties drie en vier zoals zojuist is gedemonstreerd. Incubeer de calvaria in vijf milliliter vijf millimolair EDTA, aangevuld met één milligram per milliliter bovien serumalbumine in PBS gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius met schudden. Aan het einde van de incubatie, verzamel en kweek fractie vijf zoals gedemonstreerd voor fracties twee, drie en vier.Onmiddellijk na fractionering, verzamel de cellen voor sortering. Of verzamel de cellen na 24 uur kweken door het medium af te zuigen en de cellen voorzichtig twee keer te wassen met 10 milliliter PBS per schaal per wassing. Na de tweede wassing, behandel de cellen met vijf milliliter 0,5% trypsine EDTA in PBS per plaat.Na vijf minuten bij 37 graden Celsius, voeg vijf milliliter compleet alfa minimaal essentieel medium toe aan elke plaat en los de cellen voorzichtig los met pipetteren. Om de cellen in elke fractie te combineren, filter de celsuspensies door een 40-micron celsifter in een enkele 50-milliliter conische centrifugebuis. Na het wassen van de cellen met 10 milliliter PBS, voeg ze toe aan de buis.Filter de cellen door een zeef en verzamel de cellen door centrifugatie. Zodra de cellen zijn gepelleteerd, resuspendeer het pellet in compleet minimaal essentieel medium tot een eenmaal 10 tot de zevende cellen per milliliter mediumconcentratie en filter de cellen door een 35-micron nylon gaas gekapte buis. Om de efficiëntie van deze methode te testen, werden fracties afzonderlijk gesorteerd en 24 uur gekweekt om het percentage en de opbrengst van osteocyten uit elke fractie te bepalen.De dichtheid van de osteocyten in fracties twee tot vijf was hoger dan die waargenomen voor fractie een en nam opmerkelijk af in fracties zes, zeven en acht. Hoewel het percentage osteocyten dat tussen alle fracties is verkregen niet statistisch significant is, verschilt de dichtheid van de osteocyten aanzienlijk tussen de fracties. Hier wordt de gating strategie voor het isoleren van GFP-positieve osteocyten van hun GFP-negatieve tegenhangers door fluoresceine-geactiveerde celsortering getoond.Na sortering kunnen osteocyten worden geanalyseerd op de expressie van osteocyte markers van belang. In deze analyse werden de osteocyte marker genen op hogere niveaus uitgedrukt in de geïsoleerde GFP-positieve osteocyten vergeleken met fractie twee vóór sortering, die bekend staat als een hoge osteoblast fractie. Hier kan de morfologie van een GFP-positieve osteocyt worden waargenomen die een stellaatvorm behoudt met dendrieten die zich uitstrekken vanuit het cellichaam na 24 uur kweken op een plastic kweekschaal, post sortering.Let op bij het afzuiging van de digests, aangezien de calvaria tot minuscule pellets zal worden verminderd. Vergeet niet om een kleine tip aspirator te gebruiken om celverlies te voorkomen. Osteocyten zijn raadselachtig geweest omdat ze in bot zijn ingebed.Deze techniek heeft de weg geëffend voor het bestuderen van moleculaire interacties van osteocyten en hun controle over osteoclasten en osteoblasten.

obtaining-primary-osteocytes-through-murine-calvarial-fractionation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Kwantitatieve meting van botvoorlopercellen functie de genezing van breuken vereist hoge resolutie seriële imaging technologie. Hier zijn protocollen voorzien met intravitale microscopie en osteo-lijn volgen sequentieel beeld en kwantificeren van de migratie, proliferatie en differentiatie van endogene osteogene stam / voorlopercellen in het proces van het herstellen botbreuken.

Sequentiële<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging van Osteogeen Stam / progenitorcellen Tijdens Fracture Repair

Behandeling van primaire muis osteoblasten met retinoinezuur produceert een homogene populatie van vertakte cellen die morfologische en moleculaire kenmerken van osteocyten. De werkwijze overwint de moeilijkheid van het verkrijgen en handhaven primaire osteocyten in kweek, en kan voordelig zijn om cellen uit transgene modellen bestuderen.

Toepassing van retinoinezuur aan Osteocyten Culturen van primaire muizen osteoblasten verkrijgen

De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Osteoclasten zijn de voornaamste botresorberende cellen in het lichaam. Het vermogen om osteoclasten te isoleren in grote aantallen heeft tot aanzienlijke vooruitgang in het inzicht van osteoclast biologie. In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het isoleren, kweken en kwantificeren van osteoclasten in vitro.

Osteoclast Afleiding van Mouse Bone Marrow

In dit artikel presenteren we methoden om te isoleren en te onderscheiden van het beenmerg stromale cellen en hematopoietische stamcellen van lange beenderen van de muis. Twee verschillende protocollen worden gepresenteerd opbrengst andere cel populaties geschikt voor uitbreiding en differentiatie in botcellen, adipocytes en osteoclasten.

Isolatie, cultuur en differentiatie van beenmerg stromale cellen en Osteoclast voorlopercellen van muizen

Osteoclasten zijn weefsel-specifieke macrofagen polykaryons afgeleid van de monocyten-macrofagen afstamming van hematopoietische stamcellen. In dit protocol wordt beschreven hoe u beenmergcellen isoleren zodat grote hoeveelheden osteoclasten worden verkregen terwijl het risico op ongevallen in traditionele methoden wordt verminderd.

Isolatie, zuivering en differentiatie van osteoclast precursoren van het Rat beenmerg

Dit protocol beschrijft de detectie van CCL5-gemedieerde periostale skeletstamcelmigratie in realtime met behulp van levende intravitale microscopie van dieren.

Real-time beeldvorming van CCL5-geïnduceerde migratie van periosteale skeletstamcellen bij muizen

We beschrijven hier de methode voor het afbeelden van megakaryocyten en proplatelets in het merg van het schedelbot van levende muizen met behulp van twee-fotonenmicroscopie.

In vivo Twee-foton Beeldvorming van Megakaryocyten en Proplatelets in de Muis Schedel Beenmerg

Het huidige artikel beschrijft het uitvoeren van een intravitale beeldvormingsbenadering om mechanisch geïnduceerde calciumsignalering van ingebedde osteocyten in vivo in realtime te observeren als reactie op mechanische belasting op weefselniveau van het derde middenvoetsbeentje van de muis.

Een fluorescerende intravitale beeldvormingsbenadering om door belasting geïnduceerde calciumsignaleringsdynamiek in osteocyten van muizen te bestuderen

Deze studie schetst de methode om driedimensionale (3D) modellen van osteocyten binnen het lacunair-canaliculaire netwerk (LCN) te visualiseren en te ontwikkelen voor computationele vloeistofdynamica (CFD) analyse. De gegenereerde modellen met behulp van deze methode helpen om osteocyt-mechanosensatie in gezonde of zieke botten te begrijpen.

Analyse en beeldvorming van osteocyten

Intravitale microscopie maakt het mogelijk om dynamische biologische processen zoals weefselregeneratie en tumorontwikkeling te bestuderen. Het calvariale beenmerg, een zeer dynamisch weefsel, biedt inzicht in hematopoëse en vasculaire functie. Het gebruik van een biocompatibel 3D-geprint hoofdfixatie-implantaat maakt repetitieve longitudinale beeldvorming mogelijk, waardoor ons begrip van weefseldynamiek en de micro-omgeving van de tumor wordt verbeterd.

Intravitale longitudinale beeldvorming van vasculaire dynamiek in het calvariale beenmerg

Leer een efficiënte methode voor de isolatie van primaire GFP-expresserende osteocyten uit neonatale dmp1-topaz muizen. Dit protocol verkort de handelingstijd en maximaliseert de opbrengst van levensvatbare cellen met minimale contaminatie.

Het verkrijgen van primaire osteocyten door murine calvariale fractionering van GFP-tot expressie brengende osteocyten

Meer video's verkennen