Whole Animal Imaging van Drosophila melanogaster met behulp van Microcomputed Tomography

Dit protocol maakt niet-destructieve beeldvorming mogelijk van intacte of zachte laboratoriummicronresolutie. Het kan worden gebruikt om mechanismen van dierlijke fysiologie, anatomie en ontwikkeling te begrijpen. Omdat de vliegen worden geïmagerd in een intacte staat zonder dat er weefseldissectie nodig is, worden de ruimtelijke architectuur van weefsels en organen behouden in hun oorspronkelijke staat en zijn ze gemakkelijk waar te nemen.

Micro CT is een ideaal hulpmiddel voor studies gericht op het modelleren van menselijke ziekten in vliegen, of voor het begrijpen van ontwikkelingsdefecten die de kwaliteit van leven beïnvloeden. Het heeft zich ook als nuttig bewezen in andere disciplines, zoals engineering, fysica, materiaalkunde, geologie en antropologie. Na het selecteren van het gewenste ontwikkelingstijdstip voor beeldvorming, breng 5 tot 20 dieren over in één milliliter PBST in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en incubeer de buis gedurende vijf minuten op kamertemperatuur met periodiek tikken om de verwijdering van hydrofobe coating te vergemakkelijken en de dieren volledig ondergedompeld te laten raken.

Aan het einde van de incubatie, vervang de PBST met één milliliter Bouin-oplossing en tik op de buis om de vliegen volledig onder te dompelen. Voor larvale en poppenmonsters, na een incubatie van twee uur bij kamertemperatuur, was de dieren drie keer gedurende vijf minuten met één milliliter vers PBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, breng de monsters over naar een multi-well dissectiebakje met vers PBS per putje onder een dissectiemicroscoop en gebruik een kleine minutiënpen bevestigd aan een houder om een gat te prikken in de anterieure en posterieure cuticula van elk monster, waarbij moet worden gezorgd dat het onderliggende zachte weefsel niet wordt verstoord.

Na het penetreren van de cuticula's, incubeer de monsters in één milliliter verse Bouin-oplossing in een nieuwe 1,5-milliliterbuis gedurende 24 uur bij kamertemperatuur voordat u het monster drie keer gedurende 30 minuten en één milliliter van één micro CT-wasbuffer per wasbeurt wast. Na de laatste wasbeurt, voeg één milliliter van de juiste kleuroplossing toe aan de buis en incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende twee tot zeven dagen. Als langere beeldbehoud noodzakelijk is, dehydrateer de monsters binnen oplopende ethanolseries in één milliliter ethanol gedurende één uur per concentratie zoals aangegeven, om de monsters voor te bereiden op kritisch punt drogen.

Om kritisch punt gedroogd monsters te monteren, plaats de monsters in plastic of glazen capillaire buisjes voordat de buisjes op de roterende houder worden gemonteerd. Voor het monteren van gehydrateerde monsters, vul een P10 pipettentip met water en zet het smalle uiteinde vast met paraffinefolie. Gebruik een pincet om een enkel specimen naar de pipettentip over te brengen en gebruik een lang, slank object om het specimen voorzichtig naar beneden in de tip te duwen tot het net de wand van de tip raakt om het monster op zijn plaats te houden.

Na het bedekken van het open uiteinde van de pipettentip, monteer de P10 pipettentip op een houder ontworpen om in de klauw van de roterende houder te passen. Voor scannen, klik op het Open Door-pictogram in de scannersoftware om toegang te krijgen tot de klauw van de roterende houder en draai de kraag om de basis van de monstersteun om het monster te bevestigen. Stel de scanparameters in de software in voor optimale resolutie en contrast en klik op Opties en X-Ray Bron om de röntgenbronvermogencontrole te openen.

Gebruik de schuifregelaars om de röntgenspanning in te stellen op 30 tot 40 kilovolt en de stroom op 100 tot 110 micro ampère om een röntgenstraal met drie tot vier Watt vermogen en een kleine spotgrootte te produceren. Om het aantal projectiebeelden dat tijdens de scans moet worden verkregen in te stellen, selecteer Opties en Acquisitiemodi om de belichtingstijd van de camera in te stellen op 500 tot 800 milliseconden en gebruik de schuifbalk om de gewenste beeldpixelgrootte in te stellen volgens de camera-instellingen en positie. Klik en sleep de schuifbalk om het monster langs zijn 360-graden rotatiepad te verplaatsen, waarbij het monster binnen het gezichtsveld blijft.

Klik op het begin acquisitie-pictogram. Er verschijnt een dialoogvenster waarin aanvullende scanparameters kunnen worden ingesteld. Geef het bestand een naam en de uitvoermap waarin het scanresultaat wordt opgeslagen.

Stel de willekeurige beweging in op 10 en het gemiddelde op vier tot zes frames. De rotatiestap wordt automatisch berekend afhankelijk van de gebruikte camera-instellingen, klik vervolgens op OK om de acquisitie te starten. Er verschijnt een voortgangsbalk met de scantijd en de scanner begint een reeks projectiebeelden van het monster langs het rotatiepad te verzamelen.

Om de tomogrammen te genereren, open de projectiebeelden in de reconstructiesoftware en selecteer het verschuivingscorrectiealgoritme om een ​​initiële beelduitlijning uit te voeren. Selecteer de beste waarde die de projectiebeelden goed uitlijnt en klik op Fijnafstemming om elke reconstructieparameter fijn af te stemmen. Er wordt een reeks voorbeelden gegenereerd die kunnen worden gebruikt om de juiste waarden te selecteren.

Bevestig dat de optimale parameterwaarden worden weergegeven in het tabblad Instellingen en pas in het tabblad Uitvoer de bestandsparameters aan, zoals bitdiepte, bestandsnaam en map waar de gegevens worden opgeslagen. Een interessegebied kan worden gebruikt om alleen de structuren van belang te reconstrueren. Als meerdere reconstructies vereist zijn, klik op Start en Toevoegen aan batch om het huidige beeld aan de batchmanager toe te voegen en herhaal de reconstructie voor de resterende beelden.

Voor morfometrische analyse van de geconstrueerde beelden, klik onder het tabblad Segment, in een geschikte morfometrische analysesoftware, op Basis en Nieuw, geef het beeld een nieuwe naam en selecteer een geschikte kleur. Vink het vakje Definieer bereik aan en pas de schuifregelaar aan om het drempelbereik dat de structuur van belang omvat, aan te passen. Om een gebied gedefinieerd door de drempel te schilderen, druk en houd de Control-toets in terwijl u de linkermuisknop ingedrukt houdt.

Om een gebied te verwijderen, druk en houd de Shift-toets in terwijl u de linkermuisknop ingedrukt houdt. Z