Name: Whole Animal Imaging van Drosophila melanogaster met behulp van Microcomputed Tomography (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Ontdek microcomputed tomografie voor niet-destructieve beeldvorming van intacte Drosophila melanogaster. Deze methode behoudt de ruimtelijke architectuur van weefsels en organen voor gedetailleerde ontwikkelingsbiologische studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niets van dit alles zou mogelijk zijn geweest zonder de steun van Nasser Rusan. Ik wil graag H. Doug Morris, Danielle Donahue en Brenda Klaunberg van de NIH Mouse Imaging Facility en Ben Ache van Micro Photonics bedanken voor training en nuttige discussie. Ik dank ook Mansoureh Norouzi Rad van Zeiss voor het scannen van buikmonsters op de Xradia 520 Versa. Lauren Smith, Samantha Smith en Rachel Ng hielpen ook met scannen. Mike Marsh van Object Research Systems leverde Dragonfly technische ondersteuning. Ik ben ook dankbaar voor de steun van het National Heart, Lung, and Blood Institute (1K22HL137902-01) en Start Up Funds van de Universiteit van Wyoming. Ik dank ook de anonieme recensenten voor hun nuttige suggesties en opmerkingen.

1. Monsterselectie en cutickelvoorbereiding
<ol><li>Kies het juiste ontwikkelingstijdpunt (embryo, larve, pop of volwassene) voor beeldvorming.<ol>
<li>Voor embryonale stadia, kooi vrouwtjes op druivensap agar platen besmeurd met gistpasta en verzamelen eieren elke 30-60 min. Laat deze embryo's zich ontwikkelen bij 25 °C totdat het juiste stadium is bereikt.</li>
		<li>Verzamel voor larvale stadia de eerste en tweede instars van getimede embryoverzamelingsexperimenten. Pluk direct3e instars van de zijkant van de voedselflacon onder niet-verdringende omstandigheden.</li>
		<li>Verzamel voor de timing van de pop witte voorpoppen (omgekeerde spiracles) en noteer het tijdstip waarop de cutickel bruin begint te worden. Dieren zullen 15 stadia van popontwikkeling doorlopen op gedefinieerde tijdstippen na het bruin worden van de cuticel en kunnen dienovereenkomstig worden verzameld42.</li>
		<li>Verzamel volwassenen als maagden na eclosie en laat rijpen in een voedselflacon gedurende een vereiste hoeveelheid tijd (bijv. 5 dagen voor volledige darmontwikkeling).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Breng 5-50 dieren over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met 1 ml 0,5% Triton X-100 in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (0,5% PBST). Terwijl u periodiek op de buis op het tafelblad tikt, incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) om te helpen bij het verwijderen van de hydrofobe coating en dieren volledig onder water te laten komen.<ol>
<li>Voor embryonale, larvale en popstadia, stop de verdere ontwikkeling door de buis in een warmteblok te plaatsen dat gedurende 20 s op 100 °C is ingesteld, gevolgd door afkoeling bij RT gedurende 5 minuten. OPMERKING: Dieren kunnen ook worden ingevroren in vloeibare stikstof37.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fixatie en kleuring
<ol><li>Verwijder 0,5% PBST en voeg 1 ml Bouin's Solution toe. Kraanbuis om ervoor te zorgen dat dieren volledig ondergedompeld zijn. LET OP: Bouin's Solution bevat formaldehyde. Het kan acute toxiciteit voor huid en ogen veroorzaken als het wordt gemorst en kan fataal zijn als het wordt ingeslikt. Draag handschoenen, een veiligheidsbril en een laboratoriumjas bij het hanteren. OPMERKING: Aanvullende fixatietechnieken kunnen ook worden gebruikt, zoals het gebruik van ethanol. De verdiensten van andere fixatieven worden in detail beschreven in ref.1,30.<ol>
<li>Voor embryo- en volwassen monsters, incubeer op de tafel gedurende 16-20 uur bij RT.</li>
		<li>Voor larvale en popmonsters, fixeer de dieren gedurende 2 uur bij RT. Gooi Bouin's oplossing weg en was met 1x PBS gedurende 5 min driemaal. Breng over naar een multi-well ontleedschaal met 1x PBS en gebruik een kleine minutien-pin die aan een houder is bevestigd om een gat in de voorste en achterste cuticul te prikken, waarbij u voorzichtig bent om onderliggende zachte weefsels niet te verstoren.</li>
		<li>Breng larvale en popmonsters terug naar een microfugebuis en voeg 1 ml verse Bouin's-oplossing toe. Incubeer op benchtop gedurende 24 uur bij RT.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder Bouin's Solution en was het monster gedurende 30 minuten met 1 ml μ-CT-wasbuffer (0,1 M na2HPO4,1,8% sucrose) of 1x PBS driemaal.</li>
	<li>Voeg 1 ml van de juiste kleuringsoplossing toe en incubeer gedurende 2-7 dagen op de tafel. OPMERKING: Vlekkeuze hangt af van vele factoren, maar is over het algemeen een balans tussen penetratie, incubatietijd en resolutie. Over het algemeen biedt fosfosforungstic acid (PTA) een superieur contrast en resolutie van zacht weefsel, maar vereist mechanische verstoring van de cutickel en langere incubatietijden. De verdiensten van verschillende vlektypen worden in detail beschreven in ref.1.<ol>
<li>Gebruik voor jodiumkleuring 1 ml van 0,1 N I2KI (Lugol-oplossing). Incubeer gedurende 2 dagen. Verdere verstoring van de volwassen nagelriem is niet nodig.</li>
		<li>Gebruik voor het vlekken van fosfotungstic acid (PTA) 1 ml van een 0,5% (w / v) oplossing verdund in water. Verstoor de volwassen nagelriem, hetzij door de monddelen te verwijderen of door gaten in de thorax of buikspier te prikken met een kleine minutien pin bevestigd aan een houder. Incubeer gedurende 5-7 dagen of langer als weefselkleuring niet-homogeen lijkt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wassen met 1 ml ultrapijn water of 1x PBS gedurende 30 minuten. Herhaal de wasstap. Bewaar dieren bij RT in ultrapruimend water of 1x PBS gedurende maximaal een maand.</li>
	<li>Als dieren gehydrateerd moeten worden gescand, gaat u direct naar rubriek 4. Als het langer bewaren van het monster nodig is, gaat u verder met sectie 3 van het protocol.</li>
</ol>3. Drogen van kritieke punten (optioneel)
<ol><li>Voer een ethanol (EtOH) dehydratiereeks uit op het monster: 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 100%. Voeg 1 ml van de EtOH-oplossing toe en incubeer gedurende 1 uur op het tafelblad voor elke concentratie in de aangegeven volgorde.</li>
	<li>Na de laatste 100% EtOH-week, vervang door verse 100% EtOH en laat het monster een nacht op de bank incuberen.</li>
	<li>Voer kritische puntdroging van monsters uit volgens de instructies van de fabrikant. OPMERKING: Elektronenmicroscopiefaciliteiten hebben over het algemeen een droogmachine met kritieke punten (zie Materiaaltabel)die het drogen van het monster na EtOH-uitdroging zal uitvoeren.</li>
</ol>4. Monstermontage
<ol><li>Voor kritisch puntgedroogde monsters, hete lijmmonsters op een insectenpen of andere houder die is ontworpen om in de klauwplaat van de roterende fase te passen of deze in een plastic of glazen capillaire buis (~ 1,0-1,25 mm binnendiameter) te plaatsen.</li>
	<li>Voor gehydrateerde monsters vult u een P10-pipetpunt met water en bevestigt u het smalle uiteinde door warmteafdichting of paraffinefilm om lekkage te voorkomen. LET OP: Zorg ervoor dat u eventuele verbindingen goed omwikkelt, zodat er geen water in de scanner lekt en schade veroorzaakt.<ol>
<li>Breng een enkel monster met een tang over op de pipetpunt. Gebruik een lang, slank voorwerp, zoals een afgestompte naald van 20 G of een andere pipetpunt, duw het monster voorzichtig langs de punt naar beneden totdat het net in contact komt met de wand van de pipetpunt om het op zijn plaats te houden.</li>
		<li>Bedek de opening van de pipetpunt met paraffinefilm om verdamping van water tijdens lange scans te voorkomen.</li>
		<li>Monteer de P10-pipet met behulp van een houder die is ontworpen om in de klauwplaat van de roterende trap te passen(figuur 1A-C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Scannen
<ol><li>Voer de nodige kalibraties van het apparaat uit voordat u de dag in beeld brengen. OPMERKING: Deze verschillen per fabrikant en het wordt aanbevolen om een toepassingsspecialist te raadplegen om de juiste stappen te bepalen. Raadpleeg de tabel met materialen voor specifieke informatie over de installatie en software die in dit protocol wordt gebruikt. Over het algemeen bieden kalibraties zoals een uitlijning van de podiumas om eventuele 'wiebels' te verwijderen die verband houden met het feit dat de klauwplaat buiten de as staat ten opzichte van de roterende fase en het uitvoeren van flat-field correcties om uniforme achtergrondpixelintensiteiten op de camera te garanderen, optimale beeldomstandigheden voor de beste resolutie en datasets die vergelijkbaar zijn voor meerdere scans.</li>
	<li>Open de deur van de scanner om toegang te krijgen tot de roterende podiumhouder door op het pictogram'Open deur'in de linkerbovenhoek van de software te klikken. Bevestig het monster door de kraag rond de basis van de monsterhouder aan te spannen. OPMERKING: Gebruik zachte druk bij het bevestigen van het monster aan de roterende klauwplaat om de uitlijning van de scanner te behouden.</li>
	<li>Stel scanparameters in de software in die de scanner bestuurt voor optimale resolutie en contrast. OPMERKING: Deze moeten empirisch worden bepaald, omdat de röntgenbron, camera / detector en geometrie van elke scanner per fabrikant verschillen. Aanvullende informatie voor het selecteren van de beste parameters is ook hier te vinden43, evenals van de toepassingsspecialist van de fabrikant.<ol>
<li>Open de stroomregeling van de röntgenbron(opties | X-ray Bron). Gebruik de schuifbalken om de röntgenspanning in te stellen op 30-40 kV en de stroom op 100-110 μA om een röntgenstraal te produceren met 3-4 W vermogen en een kleine spotgrootte voor een verbeterde resolutie.</li>
		<li>Het dialoogvenster Acquisitiemodi gebruiken(Opties | Acquisitiemodi) om de belichtingstijd van de camera in te stellen op 500-800 ms.</li>
		<li>Gebruik de schuifbalk naast het vergrootglaspictogram onder aan de software om de gewenste pixelgrootte van de afbeelding in te stellen (~ 700 nm tot 4 μm), afhankelijk van de camera-instellingen en positie. Dit bepaalt het aantal projectiebeelden dat tijdens de scan wordt verkregen, waarbij meer projecties leiden tot een verbeterde resolutie maar langere scantijden (zie representatieve resultaten).</li>
		<li>Klik en sleep de schuifbalk naast de roterende pijl onder aan de software om het monster langs het 360 ° rotatiepad te verplaatsen. Zorg ervoor dat het monster binnen het gezichtsveld blijft.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klik op het pictogram'Acquisitie starten'(blauw cirkelpijlpictogram) bovenaan de software. Er verschijnt een dialoogvenster waarin aanvullende scanparameters kunnen worden ingesteld en waarin het bestand en de uitvoermap waarin de scan wordt opgeslagen, een naam krijgen.<ol>
<li>Stel de willekeurige beweging in op 10 en gemiddeld 4-6 frames. De rotatiestap wordt automatisch berekend op basis van de gebruikte camera-instellingen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Begin de scan door te klikken op'OK'in het dialoogvenster Acquisitie. Er verschijnt een tweede voortgangsbalkdialoogvenster waarin de scantijd wordt weergegeven. De scanner krijgt nu een reeks projectiebeelden (figuur 1D) van het monster langs het rotatiepad en hoeft niet te worden bewaakt.</li>
</ol>6. Wederopbouw
<ol><li>Om de tomogrammen te genereren, voert u een beeldreconstructie uit met behulp van de projectiebeelden. OPMERKING: Hoewel bijna alle reconstructies van afbeeldingen van kegelstraalgeometriescanners afhankelijk zijn van het Feldkamp-algoritme16,zullen individuele parameters variëren afhankelijk van de software-implementatie en empirisch moeten worden bepaald. De volgende instellingen, specifiek voor in de handel verkrijgbare software (zie Tabel met materialen),kunnen als leidraad worden gebruikt. Parameters zoals compensatie voor verkeerde uitlijning, vermindering van ringartefacten en balkverhardingscorrectie (0% voor de meeste vliegmonsters) worden op een iteratieve manier uitgevoerd om de beste waarden voor de uiteindelijke reconstructie te kiezen. Voor gevorderde gebruikers die meer controle willen over het reconstructieproces, zie de MATLAB-interface hier44.</li>
	<li>Voer een eerste afbeeldingsuitlijning uit met behulp van een shift-correctiealgoritme op basis van referentiescans45 (Acties | X/Y-uitlijning met een referentiescan).
</li>
	<li>Verfijn elke reconstructieparameter(Start | Fijnafstelling). Dit activeert een dialoogvenster 'Parameter fine-tuning'.<ol>
<li>Verfijn de uitlijning door op'Volgende'te klikken bij'Post-Alignment'. Stel het aantal iteraties in op vijf en de parameterstap op 1.0. Klik op de knop Start om een reeks voorvertoningen te genereren. Selecteer de afbeelding die correct is uitgelijnd. OPMERKING: Een goed uitgelijnde afbeelding zal niet wazig zijn of 'afscherende' artefacten weergeven waarbij een anders continue structuur (zoals de cutickel) gesplitst lijkt.</li>
		<li>Pas de verkleining van het ringartefact af door ernaast te klikken. Stel het aantal iteraties in op vijf en de parameterstap op 1.0. Klik op de knop Start om een reeks voorvertoningen te genereren. Selecteer de afbeelding met het minste aantal ringen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zodra de bovenstaande parameters zijn geoptimaliseerd om de beste afbeelding te geven, moet u ervoor zorgen dat de geselecteerde waarden correct worden weergegeven op het tabblad Instellingen(Instellingen).
</li>
	<li>Pas eventuele uiteindelijke helderheids- en contrastwaarden aan met behulp van het histogram, bestandsparameters zoals bitdiepte en -type, en gebruik een interessegebied (ROI) dat alleen de interessante structuren omvat (bijvoorbeeld hele vlieg of alleen hoofd) om de rekentijd te verkorten(Uitvoer).</li>
	<li>Begin met de reconstructie (Start | Begin). Als er meerdere reconstructies nodig zijn, voegt u de huidige afbeelding toe aan de batchmanager(Start | Toevoegen aan batch) en herhaal stap 6.2-6.5 voor de resterende afbeeldingen.</li>
</ol>7. Beeldanalyse
<ol><li>Visualiseer tomogrammen in twee en drie dimensies en voer verdere morfometrische analyse uit met freeware of commerciële software. OPMERKING: Details van de software die in dit protocol wordt gebruikt, zijn beschikbaar in de tabel met materialen. Andere softwarepakketten die in staat zijn om μ-CT-datasets te evalueren, omvatten freeware-opties zoals FIJI46,Seg3D (www.seg3D.org)47en ITK-SNAP48,plus commerciële software (bijv. AMIRA). Andere toepassingen die op machine learning gebaseerde algoritmen gebruiken om het segmentatieproces semi-te automatiseren, kunnen helpen workflows te versnellen en menselijke vooroordelen te verminderen (bijv. Biomedisa49).</li>
	<li>Importeer het tomogrambestand in de software(Bestand | Afbeeldingsbestanden importeren). De metagegevens die aan het bestand zijn gekoppeld, moeten automatisch in het venster worden geladen, maar kunnen ook handmatig worden ingesteld om overeen te komen met de afbeeldingseigenschappen.</li>
	<li>Als u een interessante structuur wilt segmenteren, klikt u op het tabblad Segment aan de linkerkant van het scherm. Maak een nieuwe regio van belang (ROI)(Basic | Nieuw), geef het een naam en selecteer een geschikte kleur.</li>
	<li>Definieer het drempelbereik dat de structuur van interesse omvat(Bereik | Bereik definiëren) met behulp van de schuifbalk.</li>
	<li>Selecteer een geschikte 2D- of 3D ROI-herstelgereedschapsmodus(ROI Painter | Penseel optie).
</li>
	<li>Een gebied schilderen dat wordt gedefinieerd door de drempelwaarde; houd de Ctrl-toets ingedrukt terwijl u de linkermuistoets ingedrukt houdt. Als u een gebied wilt verwijderen, houdt u de Shift-toets ingedrukt terwijl u de linkermuistoets ingedrukt houdt. OPMERKING: Als u de grootte van een cirkelvormige of vierkante penseel wilt wijzigen, scrolt u gewoon door het muiswiel terwijl u de Toetsen Ctrl of Shift ingedrukt houdt.</li>
	<li>Blijf de structuur van belang schilderen in het hele Z-volume.</li>
	<li>Zet de ROI om in een Mesh(Export | Naar een Mesh-| Normaal).
</li>
	<li>Markeer de netoverlay door erop te klikken in het deelvenster Gegevenseigenschappen en instellingen in de rechterbovenhoek.</li>
	<li>Maak het gaas glad met een passend aantal iteraties(Smooth Mesh | Iteraties). OPMERKING: Gebruik dezelfde iteratiewaarde voor het gladstrijken van mesh voor alle afbeeldingen die moeten worden vergeleken.</li>
	<li>Zorg ervoor dat de metingen van de mesh ROI(oppervlakte, volume en feretdiameter)worden weergegeven in het informatiepaneel aan de rechterkant van het scherm voor basismorfometrische analyse. Aanvullende analyse kan worden uitgevoerd met behulp van de Object Analysis Module.</li>
	<li>Render het netobject en de volledige tomogramafbeelding en visualiseer in 3D. Gebruik de ingebouwde Movie Maker om een video van het object te genereren (klik met derechtermuisknop | Movie Maker weergeven) met afzonderlijke frames van de viewer(Sleutel toevoegen). OPMERKING: Verschillende visuele verbeteringen kunnen ook op de film worden toegepast met behulp van het tabblad Visuele effecten in het rechterdeelvenster om bepaalde functies, enzovoort, te markeren.</li>
	<li>Exporteer de video voor weergave met de knop Animatie exporteren in Movie Maker.</li>
</ol>

De auteur verklaart geen tegenstrijdige of financiële belangen te hebben.

Het visualiseren van intacte Drosophila melanogaster in alle ontwikkelingsstadia is een uitdaging gebleven, voornamelijk vanwege de incompatibiliteit van lichtmicroscopie met de dikke, gepigmenteerde cuticel die bij dit dier wordt aangetroffen. Terwijl andere beeldvormingsmethoden voor hele dieren, zoals Magnetic Resonance Imaging (MRI), Optical Coherence Tomography (OCT) en ultramicroscopie in combinatie met weefselverwijdering met succes zijn gebruikt bij vliegen50,51,52,53,54,μ-CT een aantal voordelen biedt die het ideaal maken voor beeldvorming van hele dieren van dit organisme13,15,30 . Röntgenstralen dringen gemakkelijk de gepigmenteerde cutickel binnen en hun kleine golflengte maakt submicron beeldvorming mogelijk. Etikettering vereist minimale investeringen in algemeen beschikbare chemicaliën en geen gespecialiseerde bench skills13. μ-CT-scanners zijn ook commercieel verkrijgbaar en de kosten zijn vergelijkbaar met lichte microscopieplatforms, terwijl ze ook aantrekkelijker zijn voor een breder scala aan disciplines (geologie, paleontologie, engineering, enz.) die ook kunnen profiteren van de beschikbaarheid ervan bij een instelling. Synchrotron X-Ray bronnen kunnen ook worden gebruikt voor hoge resolutie μ-CT beeldvorming van vaste en levende insecten31,55,56,maar zijn minder toegankelijk dan commerciële benchtop scanners.
Dit protocol biedt een efficiënte manier om μ-CT-beelden van vliegenvolwassenen, poppen, larven en cellulaire embryo's te verkrijgen. Merk op dat voor veel van de hierboven beschreven stappen ook alternatieve methoden kunnen worden toegepast om monsters voor te bereiden op beeldvorming. Andere studies hebben een gedetailleerde vergelijking opgeleverd van verschillende fixatie-, etiketterings- en droogstappen voor gebruik bij insecten en degenen die geïnteresseerd zijn in het toepassen van deze techniek worden aangemoedigd om de verdiensten van elke benadering1,4,13,29,30,57te evalueren. Hoewel dit protocol relatief eenvoudig is, worden een paar nuttige suggesties gepresenteerd.
Ten eerste moet voorzichtigheid worden besteed aan het verstoren van de cuticel van intacte exemplaren, zodat onderliggende zachte weefsels niet significant worden verstoord. Het is belangrijk om larvale en vroege popstadia gedurende 2 uur fixatie te laten ondergaan in bouin's oplossing voordat je prikt. Dit verstijft het weefsel en beperkt de hoeveelheid hemolymfe die uit de cuticiekgaten sijpelt, wat de orgelarchitectuur kan veranderen. Individuele lichaamssegmenten (hoofd, thorax en buik) van de volwassene kunnen worden gescheiden als de structuur (en) van belang zich daar bevinden. Het wordt aanbevolen om een scalpel te gebruiken om deze segmenten netjes door te snijden in plaats van ze uit elkaar te trekken met een tang, wat bijvoorbeeld de 3D-architectuur van de darm of het centrale zenuwstelsel zou kunnen verstoren. Wat timing betreft, hebben volwassenen over het algemeen slechts 16 uur nodig. voor volledige fixatie, terwijl larvale en popstadia 24 uur nodig hebben. Ook als jodium- of PTA-kleuring ongelijk lijkt, kan het monster terug in oplossing worden geplaatst om langer te incuberen totdat een gelijkmatige kleuring is bereikt. Ten slotte mogen gehydrateerde monsters niet bij 4 °C worden geplaatst, omdat dit de vorming van luchtbellen in de lichaamsholte lijkt te induceren na opwarming tot kamertemperatuur.
Ten tweede zal de montage van het monster variëren per instrument, podiumtype en of het monster gehydrateerd moet blijven of op een kritiek punt is gedroogd. Indien gehydrateerd, zorg er dan voor dat het monster niet lekt en vernietig de scanner mogelijk. Wanneer u het monster in een pipetpunt monteert, moet u voorzichtig duwen met een afgestompt voorwerp totdat de monsters lichte weerstand ondervinden en niet kunnen bewegen. Te hard duwen kan leiden tot vervorming van de cutickel en onderliggende structurele defecten. Zorg er ook voor dat het monster zo dicht mogelijk bij de rotatieas in de houder is uitgelijnd. Elke wiebel zal de scantijden verlengen vanwege het grotere gezichtsveld en de resolutie van het uiteindelijke tomogram na reconstructie verminderen.
Ten derde zullen de scannerinstellingen voor het verkrijgen van projectiebeelden ook per instrument verschillen. Om de resolutiemogelijkheden van de scanner te maximaliseren, moet de spotgrootte van de röntgenstraal zo klein mogelijk zijn (5-10 μm). Dit kan worden bereikt door de röntgenspanning en stroominstellingen zodanig te balanceren dat het totale vermogen 3-4 W is. Met deze instellingen en de juiste belichtingstijd op de camera kan een goede röntgenstraalverzwakking door het monster en een optimaal beeldcontrast worden bereikt. Het gebruik van aluminium of koperen filters tussen het object en de röntgenbron kan worden gebruikt om de optimale röntgenenergie-instellingen voor het beste beeldcontrast af te stellen of de bundel voldoende te dempen om bronnen met een hoger vermogen te gebruiken. Wat de beeldresolutie betreft, hangt dit af van veel verschillende variabelen, waaronder het type vlek, het aantal projectiebeelden, de grootte van de beeldpixel, de camerapositie, de beweging van het monster, de trillingen van de scanner en de reconstructieparameters. Een staafpatroonfantoom (QRM GmbH) met bekende maatmarkeringen kan helpen bij het evalueren van de ruimtelijke resolutie voor een bepaalde scanner en camera-instelling.
Het is ook de moeite waard om de verdiensten van beeldvorming van kritische punt gedroogde of gehydrateerde monsters te evalueren. Sombke et al. voerden een vergelijkende beoordeling van de twee methoden uit en vonden dat het drogen van kritieke punten superieur was voor μ-CT-toepassingen met geleedpotigen30. Voordelen van gehydrateerde monsters zijn echter dat dieren worden blootgesteld aan minder chemische en mechanische blootstelling die kan leiden tot zowel kwantitatieve als morfologische artefacten. Dit heeft ook de neiging om delicate weefsels beter te behouden dan CPD. Gehydrateerde monsters hebben echter een veel kortere houdbaarheid en moeten uiterlijk een maand na fixatie in beeld worden gebracht, omdat weefselafbraak en verminderde beeldkwaliteit op dat moment duidelijk worden. Ook zal de resolutie van gehydrateerde monsters iets minder zijn dan een kritisch puntgedroogd monster, omdat röntgenstralen ook door zowel een plastic pipetpunt als de omringende vloeistof (water of buffer) moeten doordringen. Critical Point Gedroogde monsters kunnen veel langer worden bewaard, vooral wanneer ze op Drierite worden bewaard. Ze kunnen ook direct in het röntgenstraalpad worden geplaatst door de vleugels of poten eenvoudig op een insectenpen te lijmen en in de podiumhouder te plaatsen, waardoor het montageproces wordt vereenvoudigd. De uitgebreide ethanoluitdroging van deze monsters kan echter leiden tot weefselkrimp en verlies van delicate weefselarchitectuur, daarom is het belangrijk om een reeks toenemende EtOH-concentraties uit te voeren om deze effecten te minimaliseren. Niettemin moet worden opgemerkt dat alle vormen van chemische behandeling, inclusief paraformaldehydefixatie en zelfs jodiumkleuring, weefselkrimp kunnen veroorzaken58,59. Hoewel geen van beide methoden metingen van de 'werkelijke orgaangrootte' in een levende vlieg zal opleveren, zijn morfometrische metingen nog steeds geldig bij het vergelijken van mutante en wildtype dieren, zolang de fixatie-, kleurings- en droogstappen identiek worden uitgevoerd voor beide sets monsters - bij voorkeur parallel.
Kortom, μ-CT biedt een nuttig beeldvormingsinstrument voor hele dieren voor Drosophila33,34,35,36,37,38,39,40,41. Veel andere studies hebben de kracht van deze technologie aangetoond voor het begrijpen van verschillende aspecten van insectentaxonomie, ecologie, fysiologie, ontwikkeling en anatomie die kunnen helpen toekomstige studies bij vliegen te informeren1,28,30,31,32,55,56,57 . In combinatie met de genetische en lichtmicroscopie-instrumenten die al veel in dit organisme worden gebruikt, kan μ-CT zich positioneren in een experimentele pijplijn die een dieper begrip tussen genotype en fenotype mogelijk maakt.

Beeldvormingsmethoden die het mogelijk maken om de inwendige structuren van een object gedetailleerd te onderzoeken zonder de algehele 3D-architectuur te vernietigen, hebben bewezen op grote schaal gunstig te zijn voor een aantal verschillende disciplines, waaronder natuurkunde, techniek, materiaalkunde, archeologie, paleontologie, geologie en biologie1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Onder deze niet-destructieve beeldvormingsmethoden zijn op röntgen gebaseerde platforms vooral nuttig vanwege het vermogen van hoogenergetische röntgenstralen om veel verschillende soorten monsters en materialen te penetreren met minimale verstrooiing in vergelijking met zichtbare lichtgolven. Computertomografie (CT), Microcomputed Tomography (μ-CT), Nanocomputed Tomography (Nano-CT) en Synchrotron Microtomografie zijn daarom naar voren gekomen als de primaire technologieën voor röntgengebaseerde beeldvorming van monsters variërend van meters tot microns, met millimeter tot sub-micron resolutiemogelijkheden10,11,12,13,14.
Hoewel deze platforms verschillen in hun ontwerp, röntgengeometrie en componenten om de steekproefgrootte en resolutie in evenwicht te brengen, vertrouwen ze allemaal op hetzelfde basisprincipe voor het vastleggen van afbeeldingen: een bron van röntgenstralen die door het object reizen en worden opgevangen door een detector. Differentiële verzwakking van de röntgenstraal terwijl deze door verschillende dichtheden in het object gaat, genereert beeldcontrast. 3D-gegevens worden verkregen door het monster of de detector te roteren en een reeks 2D-projectiebeelden te verzamelen die vervolgens met behulp van algoritmen worden gereconstrueerd tot tomogrammen met 3D-informatie waarvan de resolutie isotroop is in x,y,z15. Voor veel benchtop μ-CT-scanners die een conusstraal röntgengeometrie gebruiken om röntgenstralen te projecteren op het object dat in beeld wordt gesteld, wordt het Feldkamp-algoritme gebruikt om het object nauwkeurig te reconstrueren met minimale fouten16.
De resolutie van een bepaald platform wordt voornamelijk bepaald door systeemparameters zoals de grootte van de röntgenstraal (spotgrootte), scannergeometrie (afstand van object tot röntgenbron), grootte van de pixels op de detector en het gebruikte reconstructiealgoritme. Aanvullende factoren, zoals scannertrillingen, fluctuaties van röntgenstralen, monsterbewegingen en materiaaltype of chemische vlek die wordt gebruikt om het object te visualiseren, kunnen ook de ruimtelijke resolutie onder reële beeldvormingscondities aanzienlijk beïnvloeden15.
Voor biomedische toepassingen hebben CT en μ-CT een sleutelrol gespeeld bij het bevorderen van ons begrip van anatomie, fysiologie, ontwikkeling en ziektemechanismen, en dienen als een hulpmiddel voor zowel diagnoses van menselijke patiënten als als een preklinisch beeldvormingsplatform voor modelorganismen17,18. Het Mouse International Phenotyping Consortium, dat tot doel heeft de functie van elk gen in het muizengenoom te identificeren, gebruikt bijvoorbeeld μ-CT als onderdeel van hun fenotyperingspijplijn19. Hun resultaten zijn van cruciaal belang geweest voor het begrijpen van genen die betrokken zijn bij ontwikkelings- en ziekteprocessen, terwijl ze ook dienen als een atlas voor de anatomie en ontwikkeling van muizen20. Andere modelorganismen, zoals zebravissen en ratten, hebben ook het gebruik van μ-CT volledig omarmd voor het uitvoeren van fenotypering van een aantal genmutanten17,21,22,23.
Het voordeel van het combineren van beeldvorming van hele dieren met modelorganismen is dat een mechanistisch begrip van de genfunctie voor een bepaald biologisch proces volledig kan worden onderzocht. Dit is mogelijk vanwege de goed gekarakteriseerde genomen en vele genetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn in modelorganismen die nauwkeurige manipulatie van de genfunctie mogelijk maken op verschillende ontwikkelingstijdpunten, specifieke weefsels, individuele cellen en zelfs subcellulaire organellen. Deze omvatten binaire expressiesystemen zoals het UAS / GAL4-systeem (en zijn vele derivaten), CRISPR / Cas9 en RNAi24,25,26. Wanneer deze genetische hulpmiddelen worden gebruikt in combinatie met een krachtige beeldvormingspijplijn bestaande uit elektronenmicroscopie, lichtmicroscopie (fluorescerend en niet-fluorescerend) en beeldvorming van hele dieren zoals μ-CT, kan een grondige evaluatie van moleculen, cellen, weefsels, organen en het hele organisme worden bereikt, waardoor een veel dieper begrip van de genfunctie mogelijk wordt.
Dit protocol richt zich op het gebruik van μ-CT in het niet-zoogdiermodelorganisme Drosophila melanogaster, waarvan de talloze genetische hulpmiddelen hebben geholpen bij het ophelderen van tal van moleculaire mechanismen26,27. Het werd overgenomen uit eerdere protocollen in niet-modelinsecten1,28,29,30,31,32en bouwt voort op eerdere μ-CT-studies in Drosophila om een gestandaardiseerd protocol vast te stellen voor het gebruik ervan in dit dier33,34,35,36,37,38,39 ,40,41. De stappen voor succesvolle monstervoorbereiding, beeldvorming en analyse van fly μ-CT-datasets met behulp van commercieel beschikbare scanners worden geschetst. Met dit protocol kunnen alle ontwikkelingsstadia van de vlieg met hoge resolutie worden gevisualiseerd voor zowel beschrijvende als hypothese-testende studies, waaronder taxonomie, anatomie, ontwikkeling, fysiologie en ziekte27. Dit protocol zal ook nuttig zijn voor het in beeld brengen van vrijwel elk insect en zelfs niet-levende materialen die chemische kleuring vereisen voor beeldcontrast om de visualisatie te verbeteren door μ-CT.

<table><tbody><tr><td>100% Ethanol</td><td></td><td></td><td>Voor droogpuntdroging</td></tr><tr><td>Bouin's Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT10132</td><td>Voor fixatie van dieren</td></tr><tr><td>Critical Point Dryer</td><td></td><td></td><td>Droogt monsters met de kritische puntmethode; meerdere opties beschikbaar (Balzers CPD 020 of Leica EMCPD300)</td></tr><tr><td>Dragonfly Software</td><td>Object Research Systems</td><td></td><td>Voor visualisatie en segmentatie van micro-CT-datasets; https://www.theobjects.com/dragonfly/index.html</td></tr><tr><td>Heat Block</td><td></td><td></td><td>Voor microfugebuisjes</td></tr><tr><td>Image Analysis Workstation</td><td></td><td></td><td>Moet voldoende RAM en een kwaliteitsgrafische kaart bevatten voor 3D-rendering</td></tr><tr><td>Iodine Solution (I2KI)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SI86-1</td><td>Voor kleuring</td></tr><tr><td>Microcomputed Tomography Scanner</td><td>Bruker</td><td>Skyscan 1172</td><td>Kegelstraal X-Ray geometrie; de detector is een Hamamatsu 10 MP camera met een pixelgrootte van 11,54 &micro;m.</td></tr><tr><td>Microcomputed Tomography Scanner Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>Voor het besturen van de scanner zelf (bijv. uitvoeren van flat field correcties, X-ray buisvermogen, camerablootstellingstijden, acquisitie, enz.)</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-15</td><td>Voor het maken van een gat in de cuticula</td></tr><tr><td>NRecon Image Reconstruction Software</td><td>Bruker</td><td></td><td>Gebruikt om dwarsdoorsnedebeelden te reconstrueren uit 2D projectiebeelden genomen met kegelstraal X-Ray geometrie</td></tr><tr><td>P10 pipet tips</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-120</td><td>Monstermontage</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Resarch Products International</td><td>P32060-4000.0</td><td>Voor gebruik verdunnen tot 1X met water</td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79690-25g</td><td>Voor kleuring</td></tr><tr><td>Pin Holder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26018-17</td><td>Voor Minutien Pins</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Research Products International</td><td>111036</td><td>Om wasachtige coating van volwassen vliegen te verwijderen (als 0,5% PBST)</td></tr><tr><td>X-Ray Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Xradia 520 Versa</td><td>Kegelstraal X-Ray geometrie met Fresnel zone plate objectieven voor Resolutie op Afstand (RaaD&trade;)</td></tr></tbody></table>

whole animal imaging van drosophila melanogaster met behulp van microcomputed tomography

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedische beeldvormingstools maken onderzoek mogelijk van moleculaire mechanismen op ruimtelijke schalen, van genen tot organismen. Drosophila melanogaster, een goed gekarakteriseerd modelorganisme, heeft geprofiteerd van het gebruik van licht- en elektronenmicroscopie om de genfunctie op het niveau van cellen en weefsels te begrijpen. De toepassing van beeldvormingsplatforms die een goed begrip van de genfunctie op het niveau van het gehele intacte organisme mogelijk maken, zou onze kennis van genetische mechanismen verder vergroten. Hier wordt een hele dierbeeldvormingsmethode gepresenteerd die de stappen schetst die nodig zijn om Drosophila in elk ontwikkelingsstadium te visualiseren met behulp van microcomputertomografie (μ-CT). De voordelen van μ-CT omvatten commercieel verkrijgbare instrumentatie en minimale hands-on tijd om nauwkeurige 3D-informatie te produceren op micron-niveau resolutie zonder de noodzaak van weefseldissectie of clearing methoden. In combinatie met software die beeldanalyse en 3D-rendering versnelt, kan gedetailleerde morfometrische analyse van elk weefsel- of orgaansysteem worden uitgevoerd om mechanismen van ontwikkeling, fysiologie en anatomie beter te begrijpen voor zowel beschrijvende als hypotheseteststudies. Door gebruik te maken van een beeldvormingsworkflow die het gebruik van elektronenmicroscopie, lichtmicroscopie en μ-CT omvat, kan een grondige evaluatie van de genfunctie worden uitgevoerd, waardoor het nut van dit krachtige modelorganisme wordt bevorderd.

Figuur 2 toont beelden van een embryo,3e instarlarven, poppen in het pharate volwassen stadium (P7) en een volwassen vrouwelijke vlieg gekleurd met jodium en gehydrateerd in water met behulp van een commerciële benchtop scanner. Uitstekende conservering en zelfs kleuring van delicaat weefsel zijn duidelijk, waardoor alle belangrijke organen gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd en gebruikt voor morfometrische analyse en 3D-visualisatie.
Doorgaans bieden scans die minder projectiebeelden van het monster verkrijgen een lagere resolutie dan scans die meer projectiebeelden verkrijgen, waarbij de afweging de tijd is die wordt besteed aan scannen. Hoewel scantijden per instrument en andere scanparameters kunnen variëren, duren scans die een paar honderd projecties verkrijgen (~ 3 μm beeldpixelgrootte) ongeveer 30 minuten per monster, terwijl scans bestaande uit duizenden projectiebeelden (700 nm-1,25 μm beeldpixelgrootte) 8-16 uur kunnen duren. Een vergelijking van dezelfde volwassen vliegenkop in zowel de scanmodus 'langzaam' (duizenden projecties) als 'snel' (honderden projecties) wordt weergegeven in figuur 3. Belangrijk is dat morfometrische analyses niet verschillen tussen 'langzame' en 'snelle' scans (Figuur 3C)40. Onze beeldvormingspijplijn maakt daarom gebruik van snelle scans om een voldoende grote steekproefgrootte te genereren voor morfometrische analyse en langzame scans om morfologische of anatomische defecten met een hogere resolutie te visualiseren. Met behulp van de software (stap 7) kan elk interessant weefsel- of orgaansysteem worden gesegmenteerd en gebruikt voor morfometrische analyse en in 3D worden gevisualiseerd met behulp van de filmmaker(Movie 1).
Figuur 4 toont een voorbeeld van de vliegenbuik gekleurd met PTA en gehydrateerd (water) of na het drogen van kritieke punten (CPD) op een röntgenmicroscoop (Tabel van materialen)afgebeeld. Het detail dat wordt geboden door een combinatie van de PTA en de mogelijkheden van dit platform is duidelijk zichtbaar in deze afbeeldingen, zodat individuele epitheliacellen van het midgut en spermabundels in de teelballen gemakkelijk kunnen worden opgelost. Hoewel het CPD-beeld een marginaal verhoogde resolutie vertoont in vergelijking met het gehydrateerde monster, wordt een beter behoud van de ultrastructuur van delicate weefsels (zoals de vetcellen in de buurt van de cutickel) bereikt met gehydrateerde monsters(film 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van het scannerontwerp en de monstermontage voor μ-CT. (A) Een commerciële benchtop μ-CT scanner. (B) Blik in de scanner. De röntgenbron (rechts) zendt röntgenstralen uit die door het monster gaan dat zich op een roterend podium bevindt (gele pijl). Demping van deze röntgenstralen genereert beeldcontrast terwijl ze door het monster en op de detector gaan, die bestaat uit een sprankelend scherm dat röntgenstralen omzet in fotonen en een standaard CCD-camera (links). (C) Montage van een volwassen fruitvlieg voor gehydrateerde beeldvorming in water. De aansluitpunten tussen de pipetpunt en de messing houder zijn gewikkeld in paraffinefolie om lekkage en mogelijke schade aan de scanner te voorkomen. Ook de podiumplaat wordt uitgelicht. Merk op dat de pipetpunt iets buiten de as was geplaatst, wat leidde tot een langere scantijd en een lagere resolutie in de uiteindelijke reconstructie. D)Een enkel 2D-projectiebeeld van een volwassen vrouwelijke vlieg; honderdduizenden van deze projecties worden verkregen tijdens een scan langs de rotatieas en worden gebruikt voor reconstructie om tomogrammen te genereren met isotrope resolutie en nauwkeurige 3D-informatie. Schaalbalken (C) = 2 mm. P, Achterste; V, Ventral. Dit cijfer is gewijzigd van Schoborg et al.40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig02.jpg"> Figuur 2: Alle stadia van de levenscyclus van Drosophila melanogaster, afgebeeld door μ-CT. Monsters gekleurd met jodium en afgebeeld gehydrateerd in water. Er wordt één 2D-segment weergegeven. (A) Een embryo dat de vroege stadia van gastrulatie heeft voltooid (asterisk). (B) Een derde instar larve. (C) Een P7-pharaatvolwassene tijdens metamorfose. (D) Een volwassen vrouw. Verschillende organen worden uitgelicht: BWM, lichaamswandspieren; Br, hersenen; Cd, cardia; Cr, gewas; DPM's, dorsale longitudinale spieren; DVM, dorsale ventrale spieren; E-AD, oog-antenne schijf; Em, embryo; FB, dikke lichamen; FBC's, vetlichaamscellen; H, hart; Hg, achterbeen; La, lamina; L, been; Mg, midgut; OL, hersenoptische kwab; Ov, legboor; PC, pop cuticle; SG, speekselklieren; VNC, ventrale zenuwstreng; W, vleugel; WD, vleugelschijf. Schaalstaven (A) = 100 μm; (B)-(D) = 500 μm. D, Dorsaal; A, Voorste; L, Links. Scanparameters: Bron tot monsterafstand (mm): (A, D) 36.5, (B) 48.8, (C) 40.3. Bron tot camera Afstand (mm): (A, D) 350, (B, C) 285. Pixelgrootte camera (μm): (A-D) 11.6. Pixelgrootte afbeelding (μm): (A, D) 1,2, (B) 1,9, (C) 1,7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig03.jpg"> Figuur 3: Scanparameters en beeldresolutie veranderen morfometrische analyses niet. Een volwassen hoofd scande met behulp van zowel (A, A ') 'snelle' scannerinstellingen (honderden projecties) als (B, B') 'langzame' scannerinstellingen (duizenden projecties). De hersenen zijn geel omlijnd. (C) Hersenvolumemetingen van langzame en snelle scans. Gemarkeerde structuren: AL; antennekwab; CB, centrale hersenen; FB, waaiervormig lichaam; VC's, vetcellen; La, lamina; Lo, lobula; LoP, lobulaplaat; Ik, medulla; Re, netvlies. n = 5, Welch's t-test. ns = niet significant. Schaalbalken = 100 μm. Scanparameters: Bron tot monster Afstand (mm): (A) 44.4, (B) 36.5. Bron naar camera Afstand (mm): (A) 348 (B) 350. Pixelgrootte camera (μm): (A-B) 11.6. Pixelgrootte afbeelding (μm): (A) 2,95, (B) 1,2. Dit cijfer is gewijzigd van Schoborg et al.40. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61515/61515fig04.jpg"> Figuur 4: Drosophila melanogaster buik in beeld met röntgenmicroscopie. Buiken werden gekleurd met 0,5% PTA en gehydrateerd (water) of na critical point drying (CPD) afgebeeld. (A) Critical Point Gedroogde buik, getoond vanuit het YZ perspectief en (A') XZ perspectief. (B) Gehydrateerde buik, getoond vanuit het YZ-perspectief en (B') XZ-perspectief. Verschillende organen worden uitgelicht: FC, vetcellen; Hg, achterbeen; Mg, Midgut; SP, spermapomp; Te, Teelballen. Schaalstaven (A) = 250 μm. D, Dorsaal; A, Voorste; L, Links. Scanparameters: Afstand van bron tot monster (mm): (A) 6,7, (B) 7. Bron tot camera Afstand (mm): (A) 28 (B) 29.5. Doel: (A-B) 4X. Pixelgrootte afbeelding (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61515/61515fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Film 1: Een derde instar larve, gerenderd in 3D met behulp van de Movie Maker in Dragonfly. Gemarkeerde organen zijn de hersenen (geel), oog-antenne denkbeeldige schijven (rood), vet lichaam (blauw) en de lichaamswandspieren (groen). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_1_Revised.avi" target="_blank">Klik hier om dit filmpje te downloaden.</a>
Film 2: Vergelijking van monsters afgebeeld in water of volg kritische puntdroging. Buiken gekleurd met 0,5% PTA worden getoond. Beide buiken werden gescand met identieke instellingen voor de pixelgrootte van het beeld (0,65 μm). Een reeks 2D-plakjes wordt weergegeven in een 'Z-stack'-formaat (YZ) beginnend bij het dorsale oppervlak en eindigend bij het ventrale oppervlak van de buik. Organen uitgelicht: FC, vetcellen; Mg, Midgut; SP, spermapomp; Te, Teelballen. Scanparameters: Afstand van bron tot monster (mm): (A) 6,7, (B) 7. Bron tot camera Afstand (mm): (A) 28 (B) 29.5. Doel: (A-B) 4X. Pixelgrootte afbeelding (μm): (A-B) 0,65. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61515/Movie_2_Revised.avi" target="_blank">Klik hier om dit filmpje te downloaden.</a>

Er wordt een protocol gepresenteerd dat de visualisatie van intacte Drosophila melanogaster in elk stadium van ontwikkeling mogelijk maakt met behulp van microcomputed tomografie.

Whole Animal Imaging van Drosophila melanogaster met behulp van Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Dit protocol maakt niet-destructieve beeldvorming mogelijk van intacte of zachte laboratoriummicronresolutie. Het kan worden gebruikt om mechanismen van dierlijke fysiologie, anatomie en ontwikkeling te begrijpen. Omdat de vliegen worden geïmagerd in een intacte staat zonder dat er weefseldissectie nodig is, worden de ruimtelijke architectuur van weefsels en organen behouden in hun oorspronkelijke staat en zijn ze gemakkelijk waar te nemen.Micro CT is een ideaal hulpmiddel voor studies gericht op het modelleren van menselijke ziekten in vliegen, of voor het begrijpen van ontwikkelingsdefecten die de kwaliteit van leven beïnvloeden. Het heeft zich ook als nuttig bewezen in andere disciplines, zoals engineering, fysica, materiaalkunde, geologie en antropologie. Na het selecteren van het gewenste ontwikkelingstijdstip voor beeldvorming, breng 5 tot 20 dieren over in één milliliter PBST in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis en incubeer de buis gedurende vijf minuten op kamertemperatuur met periodiek tikken om de verwijdering van hydrofobe coating te vergemakkelijken en de dieren volledig ondergedompeld te laten raken.Aan het einde van de incubatie, vervang de PBST met één milliliter Bouin-oplossing en tik op de buis om de vliegen volledig onder te dompelen. Voor larvale en poppenmonsters, na een incubatie van twee uur bij kamertemperatuur, was de dieren drie keer gedurende vijf minuten met één milliliter vers PBS per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, breng de monsters over naar een multi-well dissectiebakje met vers PBS per putje onder een dissectiemicroscoop en gebruik een kleine minutiënpen bevestigd aan een houder om een gat te prikken in de anterieure en posterieure cuticula van elk monster, waarbij moet worden gezorgd dat het onderliggende zachte weefsel niet wordt verstoord.Na het penetreren van de cuticula's, incubeer de monsters in één milliliter verse Bouin-oplossing in een nieuwe 1,5-milliliterbuis gedurende 24 uur bij kamertemperatuur voordat u het monster drie keer gedurende 30 minuten en één milliliter van één micro CT-wasbuffer per wasbeurt wast. Na de laatste wasbeurt, voeg één milliliter van de juiste kleuroplossing toe aan de buis en incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende twee tot zeven dagen. Als langere beeldbehoud noodzakelijk is, dehydrateer de monsters binnen oplopende ethanolseries in één milliliter ethanol gedurende één uur per concentratie zoals aangegeven, om de monsters voor te bereiden op kritisch punt drogen.Om kritisch punt gedroogd monsters te monteren, plaats de monsters in plastic of glazen capillaire buisjes voordat de buisjes op de roterende houder worden gemonteerd. Voor het monteren van gehydrateerde monsters, vul een P10 pipettentip met water en zet het smalle uiteinde vast met paraffinefolie. Gebruik een pincet om een enkel specimen naar de pipettentip over te brengen en gebruik een lang, slank object om het specimen voorzichtig naar beneden in de tip te duwen tot het net de wand van de tip raakt om het monster op zijn plaats te houden.Na het bedekken van het open uiteinde van de pipettentip, monteer de P10 pipettentip op een houder ontworpen om in de klauw van de roterende houder te passen. Voor scannen, klik op het Open Door-pictogram in de scannersoftware om toegang te krijgen tot de klauw van de roterende houder en draai de kraag om de basis van de monstersteun om het monster te bevestigen. Stel de scanparameters in de software in voor optimale resolutie en contrast en klik op Opties en X-Ray Bron om de röntgenbronvermogencontrole te openen.Gebruik de schuifregelaars om de röntgenspanning in te stellen op 30 tot 40 kilovolt en de stroom op 100 tot 110 micro ampère om een röntgenstraal met drie tot vier Watt vermogen en een kleine spotgrootte te produceren. Om het aantal projectiebeelden dat tijdens de scans moet worden verkregen in te stellen, selecteer Opties en Acquisitiemodi om de belichtingstijd van de camera in te stellen op 500 tot 800 milliseconden en gebruik de schuifbalk om de gewenste beeldpixelgrootte in te stellen volgens de camera-instellingen en positie. Klik en sleep de schuifbalk om het monster langs zijn 360-graden rotatiepad te verplaatsen, waarbij het monster binnen het gezichtsveld blijft.Klik op het begin acquisitie-pictogram. Er verschijnt een dialoogvenster waarin aanvullende scanparameters kunnen worden ingesteld. Geef het bestand een naam en de uitvoermap waarin het scanresultaat wordt opgeslagen.Stel de willekeurige beweging in op 10 en het gemiddelde op vier tot zes frames. De rotatiestap wordt automatisch berekend afhankelijk van de gebruikte camera-instellingen, klik vervolgens op OK om de acquisitie te starten. Er verschijnt een voortgangsbalk met de scantijd en de scanner begint een reeks projectiebeelden van het monster langs het rotatiepad te verzamelen.Om de tomogrammen te genereren, open de projectiebeelden in de reconstructiesoftware en selecteer het verschuivingscorrectiealgoritme om een ​​initiële beelduitlijning uit te voeren. Selecteer de beste waarde die de projectiebeelden goed uitlijnt en klik op Fijnafstemming om elke reconstructieparameter fijn af te stemmen. Er wordt een reeks voorbeelden gegenereerd die kunnen worden gebruikt om de juiste waarden te selecteren.Bevestig dat de optimale parameterwaarden worden weergegeven in het tabblad Instellingen en pas in het tabblad Uitvoer de bestandsparameters aan, zoals bitdiepte, bestandsnaam en map waar de gegevens worden opgeslagen. Een interessegebied kan worden gebruikt om alleen de structuren van belang te reconstrueren. Als meerdere reconstructies vereist zijn, klik op Start en Toevoegen aan batch om het huidige beeld aan de batchmanager toe te voegen en herhaal de reconstructie voor de resterende beelden.Voor morfometrische analyse van de geconstrueerde beelden, klik onder het tabblad Segment, in een geschikte morfometrische analysesoftware, op Basis en Nieuw, geef het beeld een nieuwe naam en selecteer een geschikte kleur. Vink het vakje Definieer bereik aan en pas de schuifregelaar aan om het drempelbereik dat de structuur van belang omvat, aan te passen. Om een gebied gedefinieerd door de drempel te schilderen, druk en houd de Control-toets in terwijl u de linkermuisknop ingedrukt houdt.Om een gebied te verwijderen, druk en houd de Shift-toets in terwijl u de linkermuisknop ingedrukt houdt. Z

whole-animal-imaging-drosophila-melanogaster-using-microcomputed

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van...

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

Contrast verbeterde kleine dier schip beeldvorming door microCT is een snelle, rendabele en high-throughput techniek voor...

Contrast Enhanced Imaging Schip met behulp van microCT

Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.

Imaging Door de Pupal zaak van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In dit protocol tonen we de toepassing van seriële-sectie Elektronentomografie ophelderen van mitochondriale structuur in Drosophila indirecte vlucht spier.

3D mitochondriale ultrastructuur van Drosophila indirecte vlucht spier geopenbaard door seriële-sectie Elektronentomografie

Hier we illustreren hoe enkel molecuul foto-geactiveerde lokalisatie microscopie kan worden uitgevoerd op de motorische zenuw-terminal van een levende Drosophila melanogaster derde instar larve.

In Vivo Single-molecuul volgen bij de Terminal van de presynaptische motorische zenuw Drosophila

Hier gepresenteerd is een protocol om micro-injectie en tegelijkertijd beeld meerdere Drosophila embryo's tijdens de embryonale ontwikkeling met behulp van een plaat-gebaseerde, hoog gehalte imager.

Drosophila Embryo Preparatuur en microinjectie voor live celmicroscopie uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde high content analyzer

We beschrijven de voorbereiding van linten van seriële secties en hun verzameling op grote overdrachtsondersteuning voor gebruik als Array Tomography-monsters, samen met geautomatiseerde beeldvormingsprocedures in een scanning elektronenmicroscoop. Het protocol maakt screening, retrieval en gerichte beeldvorming van lokale, zeldzame gebeurtenissen en de verwerving van grote gegevensvolumes mogelijk.

Array Tomography Workflow voor de gerichte acquisitie van volume-informatie met behulp van Scanning Electron Microscopy

We presenteren een methode die specifiek is afgestemd op het beeld van de hele hersenen van volwassen Drosophila tijdens gedrag en als reactie op stimuli. Het hoofd is gepositioneerd om optische toegang tot de hele hersenen mogelijk te maken, terwijl de vlieg zijn benen en de antennes kan bewegen, de punt van de proboscis en de ogen zintuiglijke stimuli kunnen ontvangen.

Volwassen Drosophila melanogaster voorbereiden op whole brain imaging tijdens gedrags- en stimulireacties

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de implementatie van expansiemicroscopie in vroege Drosophila-embryo's om beeldvorming met superresolutie te bereiken met behulp van een conventionele confocale microscoop met laserscanning.

Expansiemicroscopie gebruiken om Drosophila-embryo's in het geheel fysiek te vergroten voor beeldvorming met superresolutie

Ontdek microcomputed tomografie voor niet-destructieve beeldvorming van intacte Drosophila melanogaster. Deze methode behoudt de ruimtelijke architectuur van weefsels en organen voor gedetailleerde ontwikkelingsbiologische studies.

Whole Animal Imaging van Drosophila melanogaster met behulp van Microcomputed Tomography

Meer video's verkennen